龟背竹凝集素基因及其编码的蛋白质与应用的制作方法

专利名称：：龟背竹凝集素基因及其编码的蛋白质与应用的制作方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，特别是涉及在龟背竹中表达的龟背竹凝集素基因、蛋白及其应用。背暈技术虫害是造成农作物减产的重要因素之一，害虫不仅对作物产生直接危害,还因携带各种植物病原体而造成间接危害。在全世界范围内，每年因各种虫害造成的直接损失约占农作物总收获量的13%以上(Gatehouseefa/.，1992)，年损失约数千亿美元。特别是针对同翅目害虫(如釾虫、褐K虱及叶蝉等在世界范围内危害都很严重)的抗虫基因很少被分离。因此，分离克隆这类抗性基因以用于分子育种，对于减少病虫危害带来的损失，保证粮食的稳定增产和卫生品质的改善具有重要意义(Kaiefa/.，2003)。近年来凝集素在生物学方面的应用研究发展迅速，它最大的特点在于其能够识别糖和糖类，每一种凝集素具有对某一种特殊的碳水化合物有专一结合的能力。并已有一些外源凝集素基因如雪花莲外源凝集素(GNA)在提高作物抗同翅目害虫方面体现出了重要的应用价值。在对现有文献的分析中，虽然"EuropeanJournalofBiochemisty(欧洲生物化学杂志)1991:202:23-30"和"DNAsequence(核苷酸序列)，2003:14:223-226"等先后报道了从雪花莲及韭莲等中分离克隆了单子叶甘露糖结合凝集素基因，但尚未有任何文献报道从龟背竹(Monsterade/Zc/osa)中分离出单子叶甘露糖结合凝集素基因，至今尚未发现与本发明主题有密切联系献的报道。
发明内容所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种龟背竹凝集素基因及其编码蛋白与用途，以填补尚未有任何文献报道从龟背竹中分离出单子叶甘露糖结合凝集素基因的空白，及利用转基因方法克服植物对同翅目害虫如蚜虫等的抗性较差的缺陷。提供一种龟背竹凝集素基因及其编码蛋白序列。使其包含所说基因的融合基因构建体、携带该构建体的新的重组表达载体、所说的表达载体转化植物细胞、以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代(包括植物种子及植物组织)，以获得对植物病虫害具有增强的抗性的转基因植物。技术方案本发明的技术方案之一是提供一种龟背竹凝集素基因，具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本发明的技术方案之二是提供一种龟背竹凝集素蛋白质，由上述的基因序列所编码。其优选方案为，具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。本发明的技术方案之三是提供一种含有上述技术方案之一的龟背竹凝集素基因全序列或部分片段的质粒。本发明的技术方案之四是提供一种含有上述技术方案之一的龟背竹凝集素基因全序列或部分片段的植物表达载体。本发明的技术方案之五是提供一种宿主细胞，该细胞含有上述技术方案之一或之三或之四中任一项所述的基因序列。优选所说的细胞为大肠杆菌细胞，或者优选为农杆菌细胞，或者优选为烟草细胞。本发明的技术方案之六是提供一种龟背竹凝集素基因的应用，包括用技术方案之四所述的植物表达载体转化烟草细胞、或者用上述的农杆菌与烟草细胞共培养、或者用权利要求9所述的烟草细胞培育烟草植株。或者，技术方案之六也可以是提供一种转基因烟草，该烟草含有所述的龟背竹凝集素基因序列。具体而言，本发明的技术方案中涉及的概念的定义如下在本发明所说的龟背竹凝集素基因的DNA分子包括编码具有龟背竹凝集素蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第49-900位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40—55T:条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第49-900位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第49-900位的核苷酸序列。本发明分离出的龟背竹凝集素蛋白多肽包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佧地，该多肽是具有SEQIDNO.2序列的多肽。本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态K伴随核酸的组分分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语"龟背竹凝集素蛋白(或多肽)的编码基因"指编码具有龟背竹凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第49-900位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1序列的编码框第49-900位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1中第49-900位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDN0.2所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第49-900位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQIDNO.1中从核苷酸第49-900位的核苷酸序列的同源性至少70。/。，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95Q/。的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的龟背竹凝集素蛋白相同功能的蛋白的SEQIDNQ.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若千个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语"龟背竹凝集素蛋白或多肽"指具有龟背竹凝集素蛋白活性的SEQIDN0.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然龟背竹凝集素蛋白相同功能的、SEQIDN0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括龟背竹凝集素蛋白的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的龟背竹凝集素蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与龟背竹凝集素蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用龟背竹凝集素蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。在本发明中,术语"龟背竹凝集素蛋白保守性变异多肽"指与SEQIDN0.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1.保守性变异多肽中的取代残基<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>发明还包括龟背竹凝集素蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然凝集素多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的龟背竹凝集素蛋白时，可以将龟背竹凝集素蛋白的编码基因的核酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成龟背竹凝集素蛋白表达载体。如本发明所用的"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连亍编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法技术分析龟背竹凝集素蛋白的编码基因产物的表达，即分析龟背竹凝集素基因的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有龟背竹凝集素核苷酸编码区序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码龟背竹凝集素蛋白的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在龟背竹凝集素蛋白的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于龟背竹凝集素蛋白的核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的龟背竹凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选龟背竹凝集素蛋白源基医或同源蛋白。为了得到与龟背竹凝集素基因相关的龟背竹cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选龟背竹cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用^P对龟背竹凝集素基因序列的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自龟背竹的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可以识别与龟背竹凝集素的基因家族的核苷酸序列。本发明的龟背竹凝集素核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;Merrifield丄(1963)丄AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的龟背竹凝集素蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与龟背竹凝集素蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。有益效果本发明提供的龟背竹单子叶甘露糖结合凝集素基因是首次从龟背竹中克隆制备的，可以通过基因工程技术用来提高植物对同翅目害虫如蚜虫等的抗性，结果显示，转基因烟草在抗虫性试验中具有明显的作用，对保护植物的健康生长有所帮助。特别是许多农作物在很多地区存在虫害重、品质差的问题，提高农作物的抗虫性是解决这一问题、减少农药残留危害、降低农业投资、提高种植业效益的有效方法，本发明的凝集素基因对农作物抗虫、抗病以及抗菌等的改良具有广泛的应用价值。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于-说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1龟背竹凝集素蛋白的编码基因的克隆1.组织分离(isolation)龟背竹幼嫩叶片来源于上海，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。2.RNA的分离(RNAisolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TRIzolReagents,G旧COBRL,USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据雪花莲及其它单子叶甘露糖凝集素氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行0)3'-RACEPCR(UPM+F2)得到MDAF2'(0.6kb),回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL),知其核酸序列及编码蛋白与已知单子叶甘露糖凝集素基因(如韭莲和雪花莲凝集素等)的同源性很高,故初步认为它是一个凝集素基因。(2)5'陽RACE根据3'RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR(UPM+R2)得到MDAR2'(0.75kb)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，釆用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-曰mer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。将测序结果与3'RACE结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。(3)将5'RACE测序结果与3'RACE测序结果比序并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增MDA编码区(MDAKF1+MDAKR1)得到MDA编码区(0.852kb)(过程同(1))。BLAST的结果及分子建模结果证明从龟背竹中新得到的基因确为一个植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素(GNA)基因具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(Hilder等，1995;Powell等，1993，1995;)，故推测此基因具有相同的功能。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的龟背竹t-lectin蛋白的全长编码基因的核酸序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物MDAF1:5'-TAGCAATAGTATTGTACACTAAC-3'(SEQIDN0.3)为正向引物，寡核苷酸MDAR1:5'-GGGGAAATGTTTCTAACGTTC-3'(SEQIDN0.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94°C5分钟，随之以94°C1分钟、60。C1分钟和72°C2分钟进行35个循环，最后以72。C延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1186bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQIDNO.1所示的序列。实施例2龟背竹凝集素基因的序列信息与同源性分析本发明新的龟背竹凝集素全长cDNA的长度为1186bp，详细序列见SEQIDN0.1，其中开放读框位于49-900位核苷酸。根据全长cDNA推导出龟背竹凝集素的氨基酸序列，共283个氨基酸残基，分子量31.656KD，pl为8.34。详细序列见SEQIDNO.2。将龟背竹凝集素的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与雪花莲凝集素(GNA)基因存在一定的同源性。在氨基酸水平上，它与雪花莲凝集素(GenBankAccessionNo丄07475)的第14-142位氨基酸残基有36%的相同性和52%的相似性(见表2)。由上可见，龟背竹凝集素基因与雪花莲凝集素基因在蛋白水平上存在较高的同源性，故可以认为凝集素在提高植物的抗虫性上也具有相似的作用。表2.本发明的龟背竹凝集素蛋白与雪花莲凝集素氨基酸序列的同源比较(FASTA)表Query14LVLLHAVLLALLTPARAGEQVLIANRTLYAGQSLYSMNRNYRFIMQWDCSLALYEFQKPL73L++l_+l_++TP+E+1_+Tl_GSLS++FIMQDC+LLYKP+Sbjct6LLILTTIFLGVITPSCLSENILYSGETLPTGGSLTS——GSFVFIMQQDCNLVLYNVDKPI63Query74WISTTDRQPGTFCDATLDAGSARLAVTQRNTNKQVWSSTTSFYAFKYVLVLQTDLNWIY133W+TGD+++V+NK+W+STYV+LQDNWIYSbjct64WATNTG---GLSSDCSISLQTDGDLWYTPSNKPIWASNTDGQNGNYVCILQKDRNWIY120Query134SRPVWSTNT142W+TTSbjct121GTNRWATGT129其中，Query表示龟背竹m-lectin蛋白氨基酸序列；Sbict表示雪花莲g隱Lectin蛋白氨基酸序歹U(GenBankAccessionNo.AAL07475);相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。实施例3龟背竹md-lectin蛋白的结构和功能研究1.龟背竹md-lectin蛋白的氨基酸序列的前体蛋白和成熟蛋白分析。通过对龟背竹md-lectin蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比较分析，发现龟背竹md-lectin蛋白基因编码一前体蛋白含有信号肽序列、成熟蛋白序列，按vanHeijne(1986)等预测凝集素蛋白信号肽的规则和对龟背竹md-lectin蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比较，鉴定出龟背竹md-lectin蛋白的信号肽剪切位点在第30氨基酸(A)和第31氨基酸(G)之间，该位置也符合目前已知的大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA，VanDamme等，1991)、君子兰凝集素(VanDamme等，1994)等的凝集素蛋白的信号肽剪切位点。2.龟背竹md-lectin蛋白的专一结合糖基化分析。通过对龟背竹md-lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等的专一结合糖基化分析，发现龟背竹md-lectin蛋白同大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA)等相似，具有2个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)，见表3。因此证明龟背竹md-lectin蛋白也同雪花莲凝集素(GNA)等类似，为甘露糖专一结合的凝集素蛋白。表3.龟背竹md-lectin蛋白甘露糖专一结合位点盒(表中甘露糖专一结合位点盒QDNY用方框框住)MAATSLLFSAAPLLVLLHAVLLALLTPARAGEQVLIANRTLYAGQSLYSMNRNYRFIMQW60DCSLALYEFQKPLWISTTDRQPGTFCDATLDAGSARLAVTQRNTNKQVWSSTTSFYAFKY120VLVL§T§L§VVlgSRPVWSTNTGVWDSVEFQNGDQILLSSGTLKVGQYLSNNELNFRF頂180QDDCDLVLYDDDRRIWSSETSGKGTGCNAKLNGLTGQL1VRDNNGRIVWSSKNRAVPIKK240HILLL|P§R§VV勢GRVWASDTSIPENQGGLQDAGRIEMVTN283实施例4龟背竹凝集素蛋白或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯在该实施例中，将全长的龟背竹md-lectin编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。将龟背竹md-lectin多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据龟背竹md-lectin的氨基酸序列，设计扩增出切除信号肽后的蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将龟背竹md-lectin基因在保证阅读框正确的前提F克隆至pET32a(+廣体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-md-lectin表达载体的工程菌BL21國pET32a(+)-md-lectin。表达Trx-md-lectin重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-md-lectin工程菌于3ml含100|ig/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1:100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100ng/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至00600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37。C分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2xSDS上样缓冲液50pl，蒸馏水45…，二巯基乙醇5nl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12%SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-md-lectin融合蛋白的工程菌。Trx-md-lectin融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达Trx-md-lectin融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-md-lectin，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体口J用溶解缓冲液(50mMCAPS,pH11.0,0.3Q/0N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mMTris-HCI,pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His*Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1Mimidazole,500mMNaCI，20mMTris-HCIpH7.9)洗脱来收集Trx-md-lectin融合蛋白。融合蛋白经肠激酶2CTC酶切16小时后即可分离获的md-lectin的表达蛋白。实施例5龟背竹凝集素蛋白或多肽在烟草中进行真核细胞表达及转基因植株的抗虫性鉴定含目的基因(龟背竹凝集素基因)的表达载体的构建,根据龟背竹凝集素蛋白的全长基因序列(SEQIDNO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将龟背竹凝集素基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架￡确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落,接种于2mlYEB液体(Sm+,Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4，000g离心10min;3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600-0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28。C暗培养48小时；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6—BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28°C光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。利用Westernblot检测MDA蛋白在转基因烟草植株中的表达1.蛋白的提取a)取50mg叶片，加入100ul"PBS(KH2P040.2g/l，Na2HP041.15g/l,KCI0.2g/l，NaCI8g/l)于1.5mlEppendorf管中研磨；b)13000rpm，4。C离心10分钟；c)取上清，备用。注以上过程于冰上进行。2.蛋白的定量参考Bradford法(Bradford,1976)。取2ul蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测00595;蛋白含量计算1OD595=28.57|ag。3.SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989);a)加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液:甘油2.4g,1MTris-HCIpH6.81ml;溴酚兰0.01%,H2O定容至20ml)，煮沸10分钟；b)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmolTrisBase,0.037%SDS，20%甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h,凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；5.膜上蛋白的检测a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37。C缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml1*PBS(含0.5g叠氮钠)；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37°C洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗龟背竹md-Lectin的抗体)，37°C温育30分钟；d)同步骤b，洗涤三次；e)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37°C温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；f)加入底物显色观察蛋白条带。含龟背竹凝集素基因(MDA)的转基因植株的抗虫性鉴定鉴于编码甘露糖专一结合的植物凝集素如雪花莲凝集素(GNA)的基W已被证明对病虫害如刺吸式口器类昆虫如蚜虫(Hilder等，TransgenicRes，1995,4:1825)、飞虱(Tang等，PlantBreeding,2002，121:9395)及咀嚼式口器类昆虫如番茄蛾Z_a/aAo/7/ao/emcea(Gatehouse等，MolecularBreeding,1997，3:4963)都具有抗性，而龟背竹凝集素(MDA)也为甘露糖专一结合的凝集素且与雪花莲凝集素(GNA)具有较高的同源性，因此编码龟背竹凝集素的基因(M/^)同雪花莲凝集素基因(gna)相似，也应具有抗虫功能。我们进一步对表达龟背竹凝集素基因(MDA)的转基因植株进行抗虫性鉴定。按Hilder等(TransgenicRes,1995,4:1825)的方法对表达龟背竹凝集素基因(Ma4)的转基因烟草植株(20—30厘米高)进行蚜虫(桃蚜)抗性鉴定，研究其对蚜虫存活率和发育进度的影响。对蚜虫存活率的研究中，在每株植株上接种10头蚜虫一龄若虫后每2天测定魅虫存活数(共测定14天)。对蚜虫发育进度的研究中，在每株植株上接种5头蚜虫一龄若虫，13天后测定存活的蚜虫成虫数和若虫数。结果表明，在表达龟背竹凝集素基因(MDA)的转基因烟草植株上存活的蚜虫数量同非转基因对照上的相比显著减少(P<0.05)，同时，在表达龟背竹凝集素基因(MDA)的转基因烟草植株h存活的蚜虫其发育进度同非转基因对照上的相比也被显著减缓(P<0.05)，其13天后发育成成虫的数量也显著减少(P<0.05)。因此抗虫性结果证明，龟背竹凝集素基因(MDA)对昆虫(如蚜虫)确有抗性，龟背竹凝集素基因(MCW)可用于利用转基因技术控制植物虫害的研究和产业化中。核苷酸序列表SEQUENCELISTING〈110〉上海师范大学〈120〉龟背竹凝集素基因及其编码的蛋白质与应用<160>4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211>1186〈212〉賺<213〉龟背竹(Monsteradeliciosa)<220>〈221〉CDS〈222〉(49)..(900)〈223><400>1tsgcaatagtattgtacactaacac犯gttcagatttggcattccccaatggcagcaact60tcccttcttttttcagcagctcctctcctcgtcctcctccstgcggtcctcctcgccctc120ttaacacccgccagggcgggggagcaggtcctcatcgccaaccgcacgttgtatgccgga180cagtccctgtacagcatgaaccgcaactac已ggttcatcatgc敏gggactgctccttg240gccctgtacgagttccagaagcccctctggatctcgaccaccgatcggcagccgggcac.t300ttctgcgacgccactctcgatgccggctccgcccgcctcgcggtcacgcagcggaacacc360tctggtcgagcaccacgagtttctacgcattcaagtacgtcctcgtcctg42021cagaccgacctgaacgtggtcatctacagcagacctgtctggtccaccaacacgggcgtc■tgggactccgtggagttccag组gg卿ccagatcttgttgtcctccggcacgctcaag540gttgggcagtacctgtccaac朋cgagctcaacttcsggtttattatgcaggacgactgc600gacctggtcctctacgacgacgaccggcgcatctggagctcggagacctccggcaagggc660accggctgcaacgcaaagttgaacggtctcaccggccagctcatcgtccgggacaacaac720ggcaggatcgtatggagcagcaagaaccgcgccgtcccaattaag犯gcacatcctgctg780ctgcagcccgatcggaacgttgtcgtctacaccggacgcgtctgggcctccgacacgagc840atcccggagaacca鄉agggctgcaggatgctgggcggatcg聊tggt900attagcgtgcctcgtgtactgctcatcgtgcggccaltt.gcgttatttac9603Ctt皿t3Ctgtcggggctggtgcgtcgtcacgtctgtatctcgttttcg1020cggccgtcatgata犯ctatcctttgtgcgatgtttctatggcgtgagct1080tcacttggcgtgtaccttgtccata犯g朋a已gtttgcatctgttcattt1140acgtacgaactttcccccaa1186〈210〉2<211〉283〈212〉PRT<213>龟背竹(Monsteradeliciosa)〈400>2MetAlaAlaThrSerLeuLeuPheSerAlaAlaProLeuLeuValLeu151015LeuHisAlaValLeuLeuAlaLeuLeuThrProAlaArgAlaGlyGlu202530GinValLeulieAlaAsnArgThrLeuTyrAlaGlyGinSerLeuTyr354045SerMetAsnArgAsnTyrArgPhelieMetGinTrpAspCysSerLeu505560AlaLeuTyrGluPheGinLysProLeuTrplieSer6570GinProGlyThrPheCysAspAlalieSerThrThr75AspA〗aG]ySerPheCysAspAlaThrLeu8590LeuAlaValThrGinArgAsnThrAsnLysGinValTrp100105Ser110AspArg80AlaArg95SerThrThrSerPheTyrAlaPheLysTyrValLeuVaJLeuGinThrAspLeu115120125AsnValVallieTyrSerArgProValTrpSerThrAsnThrGlyVal130135140TrpAspSerValGluPheGinAsnGlyAspGin〖LeLeuLeu145150155G丄yThrLeuLysValGlyGinTyrLeuSerAsnAsnGluLeuVal165ArgPhelieMetGinAspAspCysAspLeuValLeuTyrMet180ArgArglieTrpSerSerGluLeuSer170AspLeuValLeuTyrAsp18590SerGlyLysGlyThrGlyCysAsnSerSer160AsnPhe175AspAsplieTrpSerSerGluThrSerGlyLysGlyThr195200205AlaLysLeuAsnGlyLeuThrGlyGinLeulieValArgAspAsnAsn210215220GlyArglieValTrpSerSerLysAsnArgAlaValProlie225230235LysLys240HislieLeuLeuLeuGinProAspArgAsnValValValTyrThrGly245250255ArgValTrpAlaSerAspThrSerlieProGluAsnGinGlyGlyLeu260265270GinAspAlaGlyArglieGluMetValThrAsn275280<210>3〈211〉23<212>DNA〈213〉龟背竹(Monsteradeliciosa)〈400〉3tagcaatagtattgtacactaac23<210>4〈211〉21〈212〉腿〈213〉龟背竹(Monsteradeliciosa)<400〉4ggggaaatgtttctaacgttc2权利要求1.一种龟背竹凝集素基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2.—种龟背竹凝集素蛋白质，由权利要求1所述的基因序列所编码。3.根据权利要求2所述的龟背竹凝集素蛋白质，其特征在于，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。4.一种含有权利要求1所述的龟背竹凝集素基因全序列或部分片段的质粒。5.—种含有权利要求1所述的龟背竹凝集素基因全序列或部分片段的植物表达载体。6.—种宿主细胞，该细胞含有权利要求1或4或5中任一项所述的基因序列，7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞为大肠杆菌细胞。8.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞为农杆菌细胞。9.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞为烟草细胞。10.—种龟背竹凝集素基因的应用，包括用权利要求5所述的表达载体转化烟草细胞、或者用权利要求8所述的农杆菌与烟草细胞共培养、或者用权利要求9所述的烟草细胞培育烟草植株。全文摘要本发明公开了一种龟背竹凝集素基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，以及由SEQIDNO.1所编码或者有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的龟背竹凝集素蛋白质。本发明还公开了上述的龟背竹凝集素基因在烟草中进行真核细胞表达及在转基因植株中提高抗虫性的应用，显著地提高了植物的抗虫性，可用于农作物抗虫的品种改良。文档编号C12N15/29GK101597609SQ20061011892公开日2009年12月9日申请日期2006年11月30日优先权日2006年11月30日发明者伟周,周根余,开国银,钱忠英,杨陆申请人:上海师范大学