嘧啶类抗代谢化疗药物疗效预测试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：嘧啶类抗代谢化疗药物疗效预测试剂盒及其应用的制作方法
专利说明嘧啶类抗代谢化疗药物疗效预测试剂盒及其应用 本发明涉及一种检测人核苷酸还原酶M1亚基((ribonucleotide reductase M1，RRM1)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，以此在临床上预测对嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨治疗疗效好的患者。属于生物技术和临床医学检验领域。随着全球工业化水平提高带来的空气污染及吸烟等因素，肺癌已成为目前全世界范围内发生率及死亡率最高的肿瘤。在我国，近二十年来肺癌发病率年增长达11％，预计到2025年我国每年新增肺癌患者超过100万。根据病理学的分型，确诊的肺癌中约有80％为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，由于早期诊断的困难，在每年新确诊的NSCLC中，大部分患者的病程已到晚期而无法行手术治疗，化疗及放疗是针对这部分患者的主要治疗方法。
抗代谢类药物是能干扰细胞正常代谢过程的药物，这类药物与正常代谢物质相似，在同一系统酶中互相竞争，与其特异酶相结合，使酶反应不能完成，从而阻断代谢过程，阻止核酸合成，抑制肿瘤细胞的生长与增殖。化疗中常用的有三类(1)叶酸类抗代谢药物；(2)嘌呤类抗代谢药物；(3)嘧啶类抗代谢药物。抗代谢类药物为细胞周期特异性药物，主要抑制细胞DNA的合成。S期细胞对它们最敏感。有时也可能抑制RNA与蛋白质的合成。故对G1期或G2期细胞也有一定作用。
最新一代抗代谢类药物包括吉西他滨、卡培他滨和去氧氟尿苷三个药物。其中吉西他滨是重要的嘧啶类抗代谢化疗药物，属细胞周期特异性抗肿瘤药，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，作为晚期非小细胞肺癌及胰腺癌的一线治疗药物在临床上有广泛应用。吉西他滨在细胞内经过核苷激酶的作用转化成具有活性的吉西他滨二磷酸核苷(dFdCDP)及吉西他滨三磷酸核苷(dFdCTP)，通过抑制DNA合成而发挥细胞毒作用。吉西它滨已经被广泛用于肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的化疗。
核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RR)是DNA合成过程中重要的限速酶，它能使二磷酸核苷酸转化为二磷酸脱氧核苷酸，后者是DNA合成和修复所必不可少的原料。RR包括2个亚单位RRM1和RRM2，RRM1是核苷酸结合位点，控制底物的特异性和整个酶的活性，同时也是核苷类似物系的化疗药物的结合位点，RRM2是一个金属结合位点，有携带接触抑制区，控制底物转化的功能。其中的RRM1基因定位于染色体11q15.5区域，这是一个可出现于多种恶性肿瘤的杂合子丢失(loss of heterozygosity LOH)区域，称为LOH11A。该区域与恶性肿瘤的转移有关系。吉西他滨对核苷酸还原酶活性具有抑制作用从而影响DNA的合成。
根据临床试验的结果，含吉西他滨的化疗方案对晚期非小细胞肺癌有效率在30％左右，即使分期、身体状况、体重等基本临床因素相似，不同患者对于含吉西他滨化疗方案的反应率仍有较大差别。说明个体差异性对化疗疗效有着较大的影响。随着人类基因组学和蛋白质组学的发展，不同个体间基因表达的细微差别越来越多地被发现，其中许多基因的表达差异对疾病的发生发展及治疗转归有明确的影响。
随着个体基因表达与临床治疗间的关系逐渐被揭示，当前的肿瘤治疗已进入一个规范化、个体化治疗的新时期。以不同个体的基因表达差异为基础制定的有针对性的治疗方案能够尽可能地为患者提供最有效治疗并将毒副作用减至最小，同时避免不必要的医疗费用的支出。在最新的靶向药物治疗领域，例如针对gefitinib这种表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂临床已发现能特别获益的人群。而在传统化疗方面也观察到许多有意义的现象，ERCC1低表达者对铂类药物反应性较好，β-tubulinIII低水平表达时对紫杉类药物反应性较好，同样也有研究表明患者对吉西他滨治疗的敏感性与肿瘤组织核苷酸还原酶M1亚基的表达水平相关，高表达RRM1的患者接受吉西他滨治疗时预后较差。因此，通过检测肿瘤组织中RRM1基因的表达水平来筛选对吉西他滨治疗敏感的患者不失为一项有益的措施。
荧光定量PCR技术是当前检测基因表达水平的较精确的方法之一，技术成熟规范适合于临床标准化的检测，对于活组织切除，纤支镜检查及手术中取得的肿瘤组织标本均可进行检测。其检测结果将有益地指导晚期及术后的非小细胞肺癌患者的治疗。本发明的目的在于应用Real-Time PCR技术，设计出一种检测人核苷酸还原酶M1亚基(ribonucleotide reductase M1，RRM1)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒。该试剂盒包括Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品，其中RT-PCR检测试剂是oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RT buffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTMIII RT。T-载体连接试剂是2X Rapid Ligation Buffer，pGEM-T Vector，T4 DNA连接酶。荧光实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织RRM1试剂是SYBRPremix Ex Taq(2X)，Rox reference dye，引物。
目标基因RRM1上下游引物分别是forward5’-TCT GCT GGA GGA ATT GGT GTT-3’reverse5’-GAC GCT TGT TCC CAC CTT GA-3’；看家基因Beta-Actin上下游引物分别是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’。
目标基因RRM1标准品序列为TCTGCTGGAGGAATTGGTGTTGCTGTGAGTTGTATTCGGGCTACTGGCAGCTACATTGCTGGGACTAATGGCAATTCCAATGGCCTTGTACCGATGCTGAGAGTATATAACAACACAGCTCGATATGTGGATCAAGGTGGGAACAAGCGTC；看家基因β-Actin标准品序列为GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
该试剂盒采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR对临床能取得肿瘤组织的患者进行检测；检测方法简单可行，检测结果稳定可靠，具有高特异性、高灵敏度的特点，而且非常适于批量样本检测，可以用来筛选对吉西他滨治疗有效的晚期或术后非小细胞肺癌患者。

图1为β-actin标准曲线；图2为β-actin扩增曲线；图3为RRM1标准曲线；图4为RRM1扩增曲线。实施例1组织RNA的提取1.新鲜组织取下后，立即置于液氮中，然后存于-80℃冰箱中保存待检测。
2.取适当大小组织标本(约100毫克)用研铂在液氮中磨碎，移入装有1000ul Trizol的预冷的1.5毫升离心管中，冰上放置10分钟。
3.加入200ul的氯仿。
4.用镊子取子弹头，盖上盖子，上下颠倒混匀，15S左右。
5.静置5min。
6.离心，12000RPM/min，4℃，15min。
7.取上层。(中下层为蛋白质和DNA的混合物)8.加入异丙醇1000ml Trizol加入500ul异丙醇.
9.混匀，静置10min。离心，12000RPM/min，4℃，15min。
10.直接将上清液弃掉，可以看见壁上有少许白色沉淀黏附。
11.75％酒精洗涤加入量与Trizol一样。混匀。离心，8000g/min，4℃，15min。
12.弃上清。
13.真空干燥，约10min。
14.用20ul DEPC-水溶解RNA(用Tip头反复吹打)。
15.55℃-60℃水浴5min。
16.1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取情况完整的RNA在紫外分析仪下可见三条带，分别为28S，18S，5S。28S的亮度应该为18S的两倍，5S带一般较弱，如有降解可见5S带增强。
17.测定所提RNA的OD260和OD280值，计算总RNA的浓度以及纯度OD260/OD280应在1.8-2.1之间实施例2RT-PCR合成cDNA1.将试剂盒中的所有试剂混匀并快速离心收集；2.在0.2ml PCR反应管中加入以下反应物1ug总RNA nul50uM oligo(dT)20 1ul10mM dNTP mix1ulDEPC-treatedwater 补足到 10ul3.65℃孵育5分钟，立即置于冰上至少1分钟。
4.再在此管中加入以下反应物，混匀。
10XRT buffer2ul25mM MgCl2 4ul0.1M DTT2ulRNASEOUTTM(40U/ul) 1ulSuperScriptTM III RT(200U/ul) 1ul5.50℃孵育50分钟，然后85℃反应5分钟。立即置于冰上。
6.离心收集产物。加入1ul RNase H，37℃孵育20分钟。
7.cDNA合成以后置于-20℃保存待下游工作。
实施例3标准品的构建1.快速离心PGEM-T Vector，收集反应物于管低。
2.建立连接体系在0.2mlL离心管中以下反应物2X Rapid Ligation Buffer 5ulpGEM-T Vector1ulPCR Product 2ulT4DNA连接酶(3U/ul) 1ul无菌水 1ul3.混匀，室温1小时或4℃孵育过夜。
4.准备两个AMP LB平板，室温放置备用。
5.将连接体系中的反应物取2ul于7ml的离心管中。
6.取50ul感受态细胞于7ml管中，轻弹混匀，冰浴30分钟。
7.42℃水浴热休克90秒。立即置于冰中2分钟。
8.加950ul soc培养基于管中。37℃，150rpm培养1个半小时。
9.离心，1000g/min，10min后弃上清收集细胞。
10.加入100ul或200ul的SOC培养基，重新悬浮细胞，轻弹混合。
11.于每个平板中加入100ul混合细胞液，用接种环铺开反应液。
12.37℃孵育过夜。
13.观察菌的生长情况，将单个菌落用枪头挑出后放进含100ulSOC培养液的0.5ml的离心管中反复吹打，将菌落洗脱。
14.PCR进行菌落的挑选，挑选目标菌落。
15.取PCR结果合适的SOC培养基加入(5ml+50ulAmp)的LB培养肉汤中，150rpm培养过夜。
16.提取质粒，测OD值，计算此标准品的拷贝数。
17.按照所需浓度稀释成工作液。
18.测定标准品的序列，验证转入序列的正确性。
实施例4荧光定量检测包括标准曲线的制作和未知样品的检测1.确定未知样品的位置和重复数，最好每个样品重复三次。
2.将质粒标准品ERCC1和看家基因标准品B-actin倍比稀释成6个浓度108，107，106，105，104，103，确定每个标准品的位置和重复数。
3.在反应板的每个反应孔中加入以下体积的液体SYBRPremixEx12.5ulTaq(2X)10uM sense primer 0.5ul10uM antisense primer 0.5ulRox reference dye 0.5ulTemplate DNA1ul无菌水 10ul4.盖上热反应膜，将反应板装入定量分析仪。
5.按仪器操作创建定量反应板。
6.指定热循环的条件并开始运行反应板聚合酶的活化20秒@95℃PCR扩增(40个循环)5秒@95℃，31秒@60℃7.保存文件，单击start开始。
8.待反应完毕，分析数据，以B-actin作为标准，计算每个细胞的ERCC1的表达水平，如在中位数以上定为阳性，如在中位数以下定为阴性。
实施例5、检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测非小细胞肺癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨治疗的疗效我们对60例服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的非小细胞肺癌患者进行了检测肿瘤组织RRM1表达水平，并根据检测结果预测患者对嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的疗效，其准确率达82％，假阴性率为8％，假阳性率为10％。
实施例6、服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的乳腺癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效80例乳腺癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对吉西他滨的疗效，其预测准确率达80％，假阴性率为10％，假阳性率为10％。
实施例7、检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测结直肠癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨疗效我们对80例服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的结直肠癌患者进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对吉西他滨的疗效，其预测准确率达85％，假阴性率为6％，假阳性率为13％。
实施例8、检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测转移性肾癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的疗效30例服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨治疗的转移性肾癌患者接受了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对吉西他滨的疗效，其准确率达73％，假阴性率为13％，假阳性率为14％。
实施例9、头颈部肿瘤患者检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的疗效35例头颈部肿瘤患者接受嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨的治疗，我们对这35例患者进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对吉西他滨的疗效，其准确率达77％，假阴性率为10％，假阳性率为13％。
实施例10、服用嘧啶类抗代谢化疗药物卡培他滨的乳腺癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效50例乳腺癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对卡培他滨的疗效，其预测准确率达86％，假阴性率为10％，假阳性率为4％。
实施例11、服用嘧啶类抗代谢化疗药物卡培他滨的胃癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效40例乳腺癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对卡培他滨的疗效，其预测准确率达80％，假阴性率为14％，假阳性率为6％。
实施例12、服用嘧啶类抗代谢化疗药物卡培他滨的直肠癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效36例直肠癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对卡培他滨的疗效，其预测准确率达78％，假阴性率为10％，假阳性率为12％。
实施例13、服用嘧啶类抗代谢化疗药物卡培他滨的晚期胰腺癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效24例晚期胰腺癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药物吉西他滨，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对卡培他滨的疗效，其预测准确率达70％，假阴性率为20％，假阳性率为10％。
实施例14、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的乳腺癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效100例乳腺癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达85％，假阴性率为10％，假阳性率为5％。
实施例15、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的胃癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效20例胃癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达90％，假阴性率为5％，假阳性率为5％。
实施例16、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的直肠癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效40例直肠癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达80％，假阴性率为10％，假阳性率为10％。
实施例17、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的鼻烟癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效20例鼻烟癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达90％，假阴性率为5％，假阳性率为5％。
实施例18、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的宫颈癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效25例宫颈癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达80％，假阴性率为10％，假阳性率为10％。
实施例19、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的膀胱癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效30例膀胱癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达90％，假阴性率为5％，假阳性率为5％。
实施例20、服用嘧啶类抗代谢化疗药物去氧氟尿苷的结肠癌患者行检测肿瘤组织RRM1表达水平用于预测其疗效40例结肠癌患者服用嘧啶类抗代谢化疗药去氧氟尿苷，进行了肿瘤组织RRM1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对去氧氟尿苷的疗效，其预测准确率达70％，假阴性率为20％，假阳性率为10％。
虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。
嘧啶类抗代谢化疗药物疗效预测试剂盒及其应用<110>广东省人民医院<120>嘧啶类抗代谢化疗药物疗效预测试剂盒及其应用<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>miSC feature<223>引物<400>1tctgctggag gaattggtgt t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>miSC feature<223>引物<400>3
gccaaccgcg agaagatga 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>miSC feature<223>看家基因β-Actin标准品序列为<400>6gccaaccgcg agaagatgac ccagatcatg tttgagacct tcaacacccc agccatgtac 60gtggccatcc aggcagcgct gtccctgtac acctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 120
权利要求
1.一种嘧啶类抗代谢化疗药物疗效预测试剂盒，它包括Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光定量PCR试剂、引物、Taq酶、标准品，其特征在于目标基因RRM1上下游引物分别是forward5’-TCT GCT GGA GGA ATT GGT GTT-3’reverse5’-GAC GCT TGT TCC CAC CTT GA-3’；看家基因Beta-Actin上下游引物分别是forward5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’reverse5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’。目标基因RRM1标准品序列为TCTGCTGGAGGAATTGGTGTTGCTGTGAGTTGTATTCGGGCTACTGGCAGCTACATTGCTGGGACTAATGGCAATTCCAATGGCCTTGTACCGATGCTGAGAGTATATAACAACACAGCTCGATATGTGGATCAAGGTGGGAACAAGCGTC；看家基因β-Actin标准品序列为GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCTGTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RT-PCR检测试剂是oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RTbuffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTMIII RT。
3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于T-载体连接试剂是2X Rapid Ligation Buffr，pGEM-T Vector，T4DNA连接酶。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于荧光实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织RRM1试剂是SYBR Premix Ex Taq(2X)，Rox reference dye，引物。
5.权利要求1所述试剂盒应用于嘧啶类抗代谢化疗药物对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的疗效预测。
全文摘要
本发明属于生物技术和临床医学检验领域，公开了一种检测核苷酸还原酶M1亚基(ribonucleotide reductase M1，RRM1)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，该试剂盒可以用来有效筛选对抗代谢药治疗有效的恶性肿瘤患者。
文档编号C12Q1/68GK1975388SQ20061012245
公开日2007年6月6日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者吴一龙, 董嵩, 郭爱林, 陈志红, 张绪超, 林嘉颖, 谢至, 陈世良, 聂强 申请人:广东省人民医院