专利名称：一种嗜冷谷胱甘肽还原酶及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物学、生物化学、酶学、极地生物学领域，特别是涉及到一种嗜冷谷胱甘肽还原酶及其制备方法。
背景技术：
由于极地独特的地理和气候特征，形成了一个干燥、酷寒、强辐射、高盐度和低光照的自然环境，能够生存于其中的生物必然具备了相应独特的生理生化和分子机制，以适应极端的环境。南极微藻的独特的生理生化特性、对极端环境胁迫的适应性及其机理，在基础研究和开发应用等方面具有广阔的前景，它已成为研究极端环境生物学的良好试验材料。
谷胱甘肽系统在生物体内维持还原缓冲状态有着非常重要的地位，主要成分是还原型谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽合成酶系，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR)等。
谷胱甘肽还原酶(GR)是谷胱甘肽抗氧化系统的主要酶之一，它对谷胱甘肽的恢复起到重要的作用，同时它对抗坏血酸的循环再生也是不可缺少的。GR在还原辅酶II NADPH存在的情况下使氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成谷胱甘肽，以维持细胞内的还原状态和保持正常的GSH/GSSG比例，及对抗氧化胁迫。防止氧化型谷胱甘肽、蛋白-SSG和其它二硫化合物的积累，对细胞膜、核酸、脂类、血红蛋白和酶的稳定是必需的，对那些不能合成大分子的细胞如眼纤维细胞和成熟红细胞的保护尤为重要。各种胁迫因子如低温、辐射、化学毒物、病原等能诱导生物体内自由基的产生，从而通过脂质过氧化对机体造成伤害。研究表明谷胱甘肽还原酶的活力与各种胁迫呈相关性，说明它在保护各类生物免受不同胁迫伤害中具有重要作用，并且具有很大的应用价值。
虽然许多常温生物的谷胱甘肽还原酶已被分离纯化，这些研究对其在常温生物中的地位具有较大的意义。但是低温谷胱甘肽还原酶的分离纯化、性质及研究还未涉及，尤其是关于南极微藻的这种酶。
发明内容
本发明的目的是为了弥补上述现有技术的不足，提供一种嗜冷谷胱甘肽还原酶及其制备方法。它是以南极微藻为材料，分离到一种嗜冷谷胱甘肽还原酶，并涉及其性质较详细的说明，为对其充分利用提供科学依据，解决低温谷胱甘肽还原酶的纯化问题。
为实现上述目的，本发明的主要内容和采取的技术方案是该嗜冷谷胱甘肽还原酶，(1)由2个相同的亚基构成，亚基的表观分子量为54.6kDa，总分子量为105kDa；(2)动力学参数表观米氏常数Km还原辅酶II NADPH、Km氧化型谷胱甘肽GSSG、Km还原辅酶I NADH分别为23.3μmol/L、66.0μmol/L、83.8μmol/L；(3)最适pH为7.5，强碱性对其活性影响比较大；(4)最适温度为25℃，属于一种低温酶或嗜冷酶，在0℃还具有一定的活力；对高温具有不稳定性，与低温酶相同；活化能为3.7kJ/(mol·K)，-78℃保藏是最佳的保藏方法；(5)最适Mg2+为7.5mmol/L，Ca2+、Mg2+对其活性具有促进作用；(6)螯合剂EDTA乙二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸等、重金属离子如Cd2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+等不同程度地抑制其活力。
嗜冷谷胱甘肽还原酶的制备方法，是将南极微藻低温培养收获后，先用液氮研磨、反复冻融破细胞、酶提取液初提后，以硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析和凝胶过滤4步法，对南极微藻谷胱甘肽还原酶进行分离纯化，其比活力达到178.8U/mg，纯化倍数达10000倍以上，回收率为25％，SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳表明达到均一性。
该嗜冷谷胱甘肽还原酶的制备方法和条件如下如下硫酸铵沉淀饱和度区间为40％-90％，以12000转/分钟的转速离心20分钟；离子交换层析平衡缓冲液为，50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液(含5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L EDTA乙二胺四乙酸、0.1mmol/L DDT二硫苏糖醇)，填料为二乙基氨乙基葡聚糖凝胶DEAE-Sephadex A50，氯化钾梯度洗脱；亲和层析条件为，填料为腺苷二磷酸葡聚糖凝胶2’，5’-ADPSepharose 4B，用含5mmol/L的NADP+氧化性辅酶II的缓冲液进行洗脱，流速控制为0.25ml/分钟，按1ml/管分部收集；凝胶过滤层析条件为，填料为葡聚糖凝胶Sephadex G-200，用50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液洗脱，洗脱流速为0.25ml/分钟，按2.5ml/管分部收集。
在整个纯化过程中温度的控制，适当的酶保护剂的使用，以及酶液的适当保存方法等的掌握非常重要，本发明表明最终酶活力的保持效率极好。纯化的酶可以用于性质与应用研究。采用酶活测定方法(郭丽红，2002)研究它的各种性质，采用Bradford法(1976)测定蛋白质浓度，十二烷基磺酸钠变性凝胶电泳采用Laemmli(1970)的方法。
本发明可以解决以下问题(1)有效地阐明南极微藻对低温等胁迫的适应性，完善其适应机制。
(2)能为抗逆性新品种改良提供新的思路，如通过转其基因等方式提高冷水性水生生物的抗逆能力。
(3)与其激活剂一起使用可以用于人类常见疾病如艾滋病、老年痴呆病等，及水生生物疾病的辅助预防和治疗。
(4)可以作为低温酶催化机理研究的极好材料，进一步阐明低温酶的催化机制。
(5)作为一种低温酶，对它的研究不仅可以丰富生物谷胱甘肽还原酶的普遍性和多样性，而且可以应用于生物系统发育与分类等的研究。
(6)纯化方法可以进行该酶的规模化制备，并可以应用于其他低温谷胱甘肽还原酶的分离纯化。
(7)可以完善谷胱甘肽的酶法测定法，降低温度，减少因加温等造成的影响。
(8)可以通过抑制剂造成该酶活性低下或缺失的南极微藻，为科学研究提供具有独特意义的实验材料。
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明。
酶液的初提谷胱甘肽还原酶纯化的操作均在4℃进行。将冷冻干燥的南极微藻称重，共20g，加石英砂和液氮研磨数次后，加入4倍约80ml的酶提取液(含0.1mol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液，5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DDT、1％PVP聚乙烯吡咯烷酮)，反复冻融3次，四层纱布过滤；含脂类较多时使用0.22μm滤膜抽滤除脂；然后以14000转/分钟的转速离心15分钟，除去不溶性淀粉，上清液再以11000转/分钟的转速离心15分钟，弃沉淀，保留上清液。上清液在酶提取液中透析2天，透析期间更换缓冲液数次。
硫酸铵沉淀将透析过的含谷胱甘肽还原酶的上清液，先用量筒量好体积，缓慢逐步加入硫酸铵至40％饱和度，在冰浴中进行，边加边搅拌。加完后用浓氨水调pH至7.0，再继续搅拌2小时，不要起泡；以12000转/分钟的转速离心20分钟，取上清液继续加入硫酸铵至90％饱和度，边加边搅拌，浓氨水调pH至6.0左右，置于冰箱中过夜；同样转速离心，将沉淀悬于40ml酶提取液，重复上面步骤再沉淀1次，最终沉淀溶于离子交换平衡缓冲液(缓冲液A，含50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液，5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DDT)，且对缓冲液A透析2天。
离子交换层析填料用二乙基葡聚糖凝胶DEAE Sephadex A50；先用平衡缓冲液平衡；上样后，用平衡缓冲液洗涤，再用氯化钾梯度洗脱，分部收集。
亲和层析将离子交换的收集样在缓冲液C(50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液，含0.1mol/L KCl、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DDT)透析浓缩后，进行亲和层析。称取1.5g 2’，5’-ADP Sepharose 4B溶胀后装柱，柱大小为0.9cm×5cm，用缓冲液C平衡过夜，上样总蛋白为1.5mg，用缓冲液C洗柱至吸光度OD280nm小于0.02为止。然后用含5mmol/L的NADP+的缓冲液C进行洗脱，流速为0.25ml/分钟，每1ml/管收集，分别测定蛋白质吸收值和谷胱甘肽还原酶相对活力。将具有酶活力的管收集在一起，并测定酶的相对活力、蛋白质含量和总体积。柱的再生用含0.5mol/L氯化钾KCl、pH8.5的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸Tris-HCl和含0.5mol/L KCl、pH4.5的乙酸钠缓冲液交替反复洗脱3次，每次洗脱约2-3倍柱体积。
凝胶过滤填料为葡聚糖凝胶Sephadex G-200，上样后，用50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液洗脱，洗脱流速成为0.25ml/分钟，按2.5ml/管分部收集。
权利要求
1.一种嗜冷谷胱甘肽还原酶，其特征是(1)由2个相同的亚基构成，亚基的表观分子量为54.6kDa；(2)动力学参数表观米氏常数Km还原辅酶II NADPH、Km氧化型谷胱甘肽GSSG、Km还原辅酶I NADH分别为23.3μmol/L、66.0μmol/L、83.8μmol/L；(3)最适pH为7.5，强碱性对其活性影响比较大；(4)最适温度为25℃，属于一种低温酶或嗜冷酶，在0℃还具有一定的活力；对高温具有不稳定性，与低温酶相同；活化能为3.7kJ/mol·K，-78℃保藏是最佳的保藏方法；(5)最适Mg2+为7.5mmol/L，Ca2+、Mg2+对其具有促进作用；(6)螯合剂乙二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸EDTA等、重金属离子如Cd2+、pb2+、Cu2+、Zn2+等不同程度地抑制其活力。
2.一种嗜冷谷胱甘肽还原酶的制备方法，其特征是将南极微藻低温培养收获后，先用液氮研磨、反复冻融破细胞、酶提取液初提后，以硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析和凝胶过滤4步法，对南极微藻谷胱甘肽还原酶进行分离纯化，其比活力达到178.8U/mg，纯化倍数达10000倍以上，回收率为25％，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳表明达到均一性。
3.据权利要求2所述嗜冷谷胱甘肽还原酶的制备方法，其特征是硫酸铵沉淀饱和度区间为40％-90％，以12000转/分钟的转速离心20分钟；离子交换层析平衡缓冲液为，50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液含5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L乙二胺四乙酸EDTA、0.1mmol/L二硫苏糖醇DDT；填料为DEAE-Sephadex A50，氯化钾梯度洗脱；亲和层析填料为2’，5’-ADP Sepharose 4B，用含5mmol/L的氧化辅酶IINADP+的缓冲液进行洗脱，流速控制为0.25ml/分钟，按1ml/管分部收集；凝胶过滤层析填料为Sephadex G-200，用50mmol/L pH7.8的磷酸钾盐缓冲液洗脱，洗脱流速为0.25ml/分钟，按2.5ml/管分部收集。
全文摘要
一种嗜冷谷胱甘肽还原酶及其制备方法，以南极微藻为材料，用硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析和凝胶过滤4步法对该酶进行分离纯化。该酶由2个相同的亚基构成，亚基的表观分子量为54.6kDa，最适温度为25℃，最适pH为7.5，最适Mg
文档编号C12N9/02GK101020901SQ20061012433
公开日2007年8月22日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者丁燏, 简纪常, 吴灶和 申请人:广东海洋大学