专利名称：鉴别显著影响断奶仔猪腹泻抗性的muc4单核苷酸多态位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个鉴别显著影响断奶仔猪腹泻抗性和可用于种猪遗传改良的MUC4单核苷酸多态位点。
背景技术：
畜禽传染病每年给全世界畜禽生产造成巨额的经济损失，发达国家由此造成的损失占年交易额的17％(17亿英磅)，在发展中国家高达35％-50％。仔猪腹泻病是最普遍而且非常重要的疾病，因腹泻病引起的仔猪死亡率达11.5％-29.5％，其中因大肠杆菌引起的发病率和死亡率占整个猪腹泻发病率与死亡率的56.2％和24.7％。大肠杆菌病严重影响仔猪生长发育，导致饲养成本增高，给养猪业带来巨大经济损失，采用疫苗接种或采用抗菌类药物对该病进行防治，一方面长时间使用容易引起耐药，另外药物的滥用将导致畜产品药物残留而成为药物食品，最终影响人类的健康。值得一提的是致病性大肠杆菌(Eschoerchia coli，E.coli)的抗原特性是可变的，已发现的E.coli菌体O抗原血清型就有164种，给研制疫苗及药物治疗带来很大困难，因此从根本上开展猪对E.coli抗性的遗传机制研究，将开辟仔猪腹泻抗病育种新途径。
Soderlind O等的研究表明，大肠杆菌病中又主要是由产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Eschoerchia coli ETEC)F4引起，ETEC F4经黏附定居于宿主小肠上皮细胞后，发挥空间阻碍作用，不被肠蠕动或分泌物的清洗而排除，并大量繁殖，分泌肠毒素，导致细胞吸收障碍，引起腹泻，甚至致死。F4黏附素由Rskov等发现并命名，根据其免疫学特征可分为F4ab、F4ac、F4ad。
Sellwood等首次报道了1头对E.coli F4ac黏附素引起的腹泻具有抗性的猪，其抗性是由于小肠粘膜缺乏相应的受体。E.coil F4 ac黏附的受体遵循孟德尔遗传，显性基因S表达有受体蛋白，猪只表现为对E.coli F4ac敏感，隐性基因s不表达受体蛋白，表现为抗性。Bijlsma发现一个位点同时编码F4ab和F4ac两种黏附素的受体，而且两个受体的遗传较紧密连锁(θ＝0.02)，同时报道转铁蛋白位点(Tf)与F4ac受体位点的连锁。Edfors-Lilja等用瑞典约克夏×欧洲野公猪资源家系为材料，经过三代系谱的连锁分析，将F4ab和F4ac受体定位于13号染色体，并确定了F4ab和F4ac受体位点紧密连锁(θ＝0.01)。Grange等对F4受体的性质做了一系列详细的研究，在猪小肠上皮细胞分离到两种粘液型唾液糖蛋白(Intestinemucus glycoprotein)，分子量分别210kDa(IMTGP-1)和240kDa(IMTGP-2)，这两种蛋白被认为是猪对F4ab和F4ac易感性和抗性重要的决定因子。丹麦等5个国家的科研单位合作通过进一步精细定位将肠毒素大肠杆菌F4ab和F4ac受体的QTL位点定位于猪13号染色体q41上的一段长7cM区域。MUC4基因位于该区域，结合其生理生化功能分析，认为MUC4基因极有可能是肠毒素大肠杆菌F4ab和F4ac受体的一个重要候选基因。鉴于此，申请人深入开展了猪MUC4基因的SNPs(单核苷酸多态性)的搜寻、鉴定及其影响仔猪腹泻病性状的研究，以期建立标记辅助选择技术开展断奶仔猪腹泻病的抗病育种工作。
发明内容
本发明的目的是提供一个鉴别显著影响断奶仔猪腹泻抗性的MUC4单核苷酸多态位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
本发明的目的是这样实现的(1)单核苷酸多态性(SNP)A243G的鉴别根据猪MUC4基因一段560 bp EST(表达序列标签)序列(序列号BF075199)，用公用的Primer 5.0或Oligo 6.0软件设计引物F1和R1(F15’-CAG GAT GCC CAA TGG CTC TAC-3’和R15’-CCC CGA AGTTGT GAA AGG AAG-3’)扩增猪基因组DNA(脱氧核糖核酸)。25μL的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括25ng猪基因组DNA，1.0mM MgCl，100mM dNTP，正反向引物各10pmol，2单位DNA聚合酶(Taq酶)及1×PCRbuffer(缓冲液)(中国上海生工)。扩增条件为95℃3min；94℃30s，65.5℃30s，72℃45s，共35个循环；最后在72℃延伸10min。538bp的扩增片段采用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN，德国)纯化，由北京华大中生科技发展有限公司测序。对测序结果采用公用的SEQMAN软件分析，揭示该片段含有一个内含子，其两侧有部分外显子，两侧的外显子与猪EST序列的同源性分别为98％和97％，说明此段序列是猪的MUC4基因的一部分。通过与人的MUC4基因组序列比较发现，该内含子为第18内含子。用公用的DNAStar的SeqMan软件分析测序结果时，发现在内含子18中存在一个单核苷酸多态位点(SNPs)，即SNP A243G位点。
(2)位于猪MUC4序列的第243个核苷酸位点为1caggatgccc aatggctcta ctctttcccc acggagctcc gaggagaccc tttttcagta61 tggaatgacc tgtgagtctg gtcctcagag tcctcgggta gatgggcagg gctgctgcat121 ggtctccctc aggcctgtgg gaaccagacc tctgtccttt gtgagagagg ggtagaaagg
181 aagagatcta aagatgctgg tgctaccccc agatttgtcc cctctgtccc caacccacct241 gcacctctct acctgggaga ggggacaagg gaggtgggtg gccctcagtc actagagtga301 ggatttccag actcagaagc tggaagtcac tctgtctctc cacatcccct gccccaaccc361 caaaccatat aagggtaagg ggtggacaca acagaaatac agccagaggc ccaccctggt421 aacaccacca tcatgccttg tgtgttttag gggagatcaa cggaaccagc ctccttggca481 agaggaatga ccatgtgtct tataacttca cccctgtctt cctttcacaa cttcgggg(3)SNP A243G的判型该多态位点改变了HhaI限制性内切酶的酶切位点，可采用PCR-HhaI-RFLP(Restriction fragment length polymorphism，RFLP限制性片段长度多态性)法判定该位点的基因型。HhaI限制性内切酶酶切F1/R1引物扩增个体基因组DNA所得目的片段，20μL酶切体系中含15μL PCR产物，0.2μL(10U/μL)HhaI限制性内切酶，2μL 10×buffer(100mM Tris-HCLpH 7.5，100mM MgC12，10mM DTT，500mM NaCL)，2.5μL dd-H2O(双蒸水)。体系混匀后，置于37℃温浴4～6小时或过夜。向每管酶切反应体系中加入2μL内切酶试剂盒附带的10×loading buffer，混匀，于2.5％琼脂糖凝胶上以5V/cm电压电泳1～2hr，紫外透照台观察结果并拍照。
具体判型方法如附图2所示。
本发明的另一个目的是这样实现的本发明利用这个多态位点及侧翼DNA序列信息，采用分子生物技术鉴别个体基因型，针对抗腹泻病性状选育种猪。
本发明鉴别了一个影响断奶仔猪抗腹泻病性状的MUC4单核苷酸多态性(SNP)位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
图1为本发明鉴别的猪MUC4 SNP A243G突变位点的序列峰图；图2为SNPA243G位点的PCR-HhaI-RFLP判型图，其中1和3为AG型；2、4和6为GG型；5和7为AA型；8为分子量标记；图3为ECF18ab与刷状缘的黏附检测结果，(a)为不黏附型，(b)为黏附型。
具体实施例方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
选择种猪核心群个体，利用上述的PCR-HhaI-RFLP方法鉴别MUC4 SNPA243G位点的基因型，选择有利的等位基因型个体留种，群体继代选育后改良种群的抗仔猪腹泻病性能。
实施例利用自身构建的、以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本、用于功能基因定位的猪资源家系为实验动物。795头资源家系第二代(F2代)公猪个体饲养到240日龄屠宰，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E.coli F4ab、F4ac和F4ad菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10％以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10％，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10％，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。黏附效果图如附图3所示。
采用上述PCR-Hha I-RFLP方法对795头F2代个体进行SNP A243G基因型判定，用SAS软件包(SAS9.0.2002.SAS institute Ine.Cary.NC.USA.)的Freq过程，对各SNP位点的基因型与ETECF4ab/ac体外黏附猪小肠刷状缘的表型进行相关性统计分析。其中SNP A243G多态性与ETEC F4ab/ac的侵染易感性呈极显著的相关，A等位基因为易感基因，G等位基因为抗性基因；基因型AA和AG个体对ETEC F4ab/ac的侵染易感，GG型个体对ETECF4ab/ac的侵染具有抵抗性(p＜0.0001)。GG型个体是抗腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育GG型个体，可以进一步改良种群的抗腹泻病性状，减少仔猪的死亡率。
表1SNP A243G多态性与ETEC F4黏附表型的相关性
注x2表示卡方值；df表示自由度；RR表示相对风险率；95％L表示置信区间下限；95％U表示置信区间上限；p＜0.01表示差异极显著；p＞0.05表示差异不显著；+表示细菌黏附猪小肠的刷状缘，-表示细菌不黏附猪小肠的刷状缘。
权利要求
1.一个鉴别显著影响断奶仔猪腹泻抗性的MUC4单核苷酸多态位点，其特征在于该多态位点如下1 caggatgccc aatggctcta ctctttcccc acggagctcc gaggagaccc tttttcagta61 tggaatgacc tgtgagtctg gtcctcagag tcctcgggta gatgggcagg gctgctgcat121 ggtctccctc aggcctgtgg gaaccagacc tctgtccttt gtgagagagg ggtagaaagg181 aagagatcta aagatgctgg tgctaccccc agatttgtcc cctctgtccc caacccacct241 gcacctctct acctgggaga ggggacaagg gaggtgggtg gccctcagtc actagagtga301 ggatttccag actcagaagc tggaagtcac tctgtctctc cacatcccct gccccaaccc361 caaaccatat aagggtaagg ggtggacaca acagaaatac agccagaggc ccaccctggt421 aacaccacca tcatgccttg tgtgttttag gggagatcaa cggaaccagc ctccttggca481 agaggaatga ccatgtgtct tataacttca cccctgtctt cctttcacaa cttcgggg
2.MUC4单核苷酸多态位点在选育改良种猪抗腹泻病性状中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个鉴别显著影响断奶仔猪腹泻抗性、可用于种猪遗传改良的MUC4单核苷酸多态位点及应用，它先进行单核苷酸多态性(SNP)A243G的鉴别，再采用PCR－Hha I－RFLP方法进行SNPA243G基因型判定。本发明通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
文档编号C12Q1/68GK1974769SQ20061012451
公开日2007年6月6日 申请日期2006年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者黄路生, 晏学明, 任军, 郭源梅, 麻骏武, 彭秋玲 申请人:江西农业大学