专利名称：一种中温型虾青素产生菌及其培养方法
技术领域：
本发明涉及虾青素生产领域，具体地涉及一种中温型虾青索产生菌及其培养方法。
背景技术：
法夫酵母于1967年初被分离，1976年被命名为Phaffia rhodozyma。1995年部分菌株被发现其有性循环，重新定位于担子菌门(Xanthophyllomycesdendrorhous)。其生物学特性主要有枯红色菌落，在细胞单个位点反复出芽，细胞壁含有木糖，重氮B染色阳性，特有的18S rRNA序列，产生3R、3′R′构型的虾青素。
虾青素是一种类胡萝卜素，化学名称为3，3’-二羟基-B，B-胡萝卜素-4，4’二酮。虾青素是一种脂溶性色素，不溶于水，易溶于四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂。天然虾青素具有特殊的分子结构，体外实验发现它是单线态氧的强大淬灭剂，具有清除氧自由基的强大能力，是一种极有效的抗氧化剂。近年来的研究表明，虾青素具有抗癌、增强免疫系统功能、抗感染等活性。虾青素不但可以作为人类的保健品，还可作为蛋禽业的饲料添加剂，目前主要作为着色剂广泛用于水产养殖业。
虾青素的生产具有人工合成和生物获取两种方式。美国食品与药物管理局(FDA)已禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场。天然虾青索的米源主要是雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和法夫酵母(Phaffia rhodozyma)。利用法夫酵母(P.rhodozyma)发酵生产虾青素，具有细胞生长速度快、发酵周期短、易于工业化等优点。且酵母中含有丰富的蛋白质、脂类和维生素，可直接作为饲料添加剂使用。但由于法夫酵母原始菌株的虾青素细胞含量很低，而且要求培养温度偏低，导致生产工艺复杂，目前只有少数国外大公司能够生产。法夫酵母合成虾青素一般需要低温培养(20-22℃)，发酵培养过程必须冷却降温，消耗能源较多。这些缺点限制了虾青素生产工业的发展，中温型虾青素产生菌的获得及其培养方法的建立必将为该领域的发展带来新的契机。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种中温型虾青素产生菌，本发明的另一目的是提供该中温型虾青素产生菌的培养方法。
(二)技术方案定义在本发明的意义上，中温型虾青素产生菌特指最适生长温度为23-26℃的虾青素产生菌，低温型虾青素产生菌特指最适生长温度为20-22℃的虾青素产生菌。
本发明的发明人通过化学、物理诱变技术，配合添加抑制剂的筛选策略，选育出一种中温型虾青素产生菌法夫酵母(Phaffia rhodozyma)A-1，该菌株已于2006年10月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1837。
本发明所述的虾青素产生菌的形态学特征为个体形态特征以卵圆形单细胞为主，大小3～6μm×5～12μm。有时几个细胞连在一起的，有时细胞呈假菌丝状，长×宽为3～5μm×10～17μm。
平板培养特征该菌在YM(酵母粉和麦芽糖)培养基上的菌落直径为1.0～5.0mm，橘红色至深红色，菌落红色色度越深越有光泽，其所含虾青素的量越多。
本发明所述的虾青素产生菌的生理生化特征为好氧菌，需在有氧环境中才能生长。最适生长pH为6.0，色素形成的最适pH为5.0。属于兼性嗜冷的低温型微生物。最适生长温度为23～26℃。当葡萄糖或蔗糖浓度大于8％以上时，生物量、色素量均明显下降。酵母膏既利于菌体的生长也利于色素形成。以(NH4)2SO4为唯一氮源，色素含量较高，但菌体量不高。尿素作为唯一氮源既有利于该菌生长又有利于色素的积累。
本发明所述的虾青素产生菌的营养学特征为葡萄糖、酵母粉、尿素，再加适量的磷酸盐和镁盐即可满足该菌株色素积累和细胞生长的需要。
本发明所述的虾青素产生菌的选育技术路线为新鲜活化30h的细胞经离心弃去上清，用生理盐水悬浮，加入亚硝基胍(NTG)生理盐水饱和溶液，充分混合，作用0-20分钟。诱变结束后，反应液充分离心并洗涤，适当稀释后涂布于PDA培养基平板，平板内含有适当浓度的抑制色素积累或细胞生长的筛选剂(辛伐他汀或牦牛儿基牦牛儿醇)。平板在23～26℃避光倒置培养7天。选择深红色细胞继续培养稀释进行物理诱变，采取60Co照射，照射剂量为4kGy。将诱变后的菌液涂布于上述含有抑制剂的平板，23～26℃避光倒置培养7天，挑选肉眼观察明显红于出发菌株的单菌落，进入摇瓶复筛。
初筛平板长出的菌落，接种于装有5ml液体培养基(葡萄糖40g/L，酵母粉4g/L，尿素3.6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.0)试管。活化培养30h后直接转入装有50ml液体培养基的500ml的三角瓶中培养。培养120h后，收集细胞，破壁提取色素，液谱测定纯虾青素的含量。选取复筛后表现最优的突变子3-5株，进入下一轮诱变。
本发明所述的虾青素产生菌的培养方法，包括以下步骤(1)发酵罐种子培养挑取该虾青素产生菌的单菌落，接入到50mL液体种子培养基中，在23-26℃，200-260r/min下培养36-40h，培养液OD600＝7.5-8.5；再按照5％接种量将上述种子培养液接入到所述的液体种子培养基中，在23-26℃，200-260r/min下培养36-60h，培养液OD600＝7.5-8.5；然后按照5％接种量将得到的种子培养液转入到所述的液体种子培养基中，在23-26℃，200-260r/min下培养36-60h，培养液OD600＝7.5-8.5；(2)补料发酵按照5％接种量将所述步骤(1)得到的种子液接入到装有液体分批基础培养基的发酵罐中进行分批培养；用体积比为10％的HCl和10mol/L的NaOH将所述基础培养基的pH控制在4.8-5.2，通气量为0.7-0.9L/L/min；通过调节转速将溶氧控制在20-70％；当所述基础培养基的葡萄糖浓度降至20g/L时第一次补料，使葡萄糖浓度恢复到40g/L，始终控制所述基础培养基的葡萄糖浓度在20-40g/L，总葡萄糖用量达到100g/L；培养时间为60-80h。
本发明所述的虾青素产生菌的培养方法，所用到的培养基的组成为所述的种子培养基葡萄糖40g/L，酵母粉4g/L，尿素3.6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.0；所述的基础培养基葡萄糖40g/L，酵母粉10g/L，尿素3.6g/L，硫酸铵5.0g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.0；所述的补料培养基40％葡萄糖(W/V)补料液。
采用本发明所述的方法培养60-80h小时，虾青素的产量达到30-35mg/L。而以上述方法采用20-22℃培养，则细胞生长和色素合成都比在23-26℃培养慢，且色素合成量未见增多。
(三)有益效果本发明提供的中温型虾青素生产菌法夫酵母(Phaffia rhodozyma)A-1营养要求简单，在23-26℃下培养细胞生长迅速，且虾青素大量积累，相对于目前工业上普遍应用的低温型(20-22℃)虾青素生产菌而言，有效降低了生产能耗，从而达到降低生产成本的目的。
本发明提供的中温型虾青素生产菌的培养方法与目前的工业生产方法相比，工艺简便，培养周期短，虾青素产量高，培养60-80h小时虾青素的产量达到30-35mg/L，对工业化生产极为有利。
本发明所述的中温型虾青素产生菌法夫酵母(Phaffia rhodozyma)A-1，该菌株已于2006年10月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No1837。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1中温型虾青素产生菌的诱变筛选一、化学诱变(1)取活化30h的新鲜菌体(出发菌株为Phaffia rhodozyma JMC9042，购于日本理化所)，离心，弃去上清，用0.5ml生理盐水悬浮，加入0.1ml的NTG生理盐水饱和溶液，作用10分钟；(2)反应液经离心，生理盐水洗涤三次；(3)脱毒后的菌体用1ml的生理盐水悬浮，稀释适当浓度(稀释度为106-108)后涂布于PDA平板(部分PDA培养基含有适当浓度的筛选剂辛伐他汀4-8mg/L)，pH＝6.0。平板避光，24℃，倒置培养7-10天；(4)诱变后的细胞经平板倒置培养7-10天后，挑选肉眼观察明显红于出发菌株的单菌落重新接种于新的平板(不加筛选剂)。在经过5-7天的倒置培养，新长出的菌落如果依然红于出发菌株，则进入摇瓶复筛；(5)初筛平板长出的优秀菌落，接种于装有5ml液体培养基试管。活化培养48h后直接转入装有50ml液体培养基的500ml的三角瓶中培养(培养基组成为葡萄糖40g/L，酵母粉4g/L，尿素3.6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.0)。培养120h后，收集细胞，破壁提取色素，液谱测定纯虾青素的含量。选取复筛后表现最优的突变子3-5株，进入下一轮诱变。
二、物理诱变(60Co)物理诱变的过程与化学诱变相似，不同之处在于诱变剂由NTG改为60Co照射，照射剂量为4kGy。
经多次筛选，得到中温型虾青素产生菌法夫酵母(Phaffia rhodozyma)A-1。
实施例2中温型虾青素产生菌的培养及虾青素含量测定
1.中温型虾青素产生菌的培养(1)发酵罐种子培养挑取该虾青素产生菌的单菌落，接入到50mL液体种子培养基中，在23℃，200r/min下培养36h，培养液OD600＝7.5；再按照5％接种量将上述种子培养液接入到50mL所述的液体种子培养基中，在23℃，200r/min下培养36h，培养液OD600＝7.5；然后按照5％接种量将得到的种子培养液转入到100mL所述的液体种子培养基中，在23℃，200r/min下培养36h，培养液OD600＝7.5；(2)补料发酵按照5％接种量将所述步骤(1)得到的种子液接入到装有4.0L液体分批基础培养基的7.5L发酵罐中进行分批培养；用体积比为10％的HCl和10mol/L的NaOH将所述基础培养基的pH控制在4.8，通气量为0.7L/L/min；通过调节转速将溶氧控制在20％；当所述基础培养基的葡萄糖浓度降至20g/L时第一次补料，使葡萄糖浓度恢复到40g/L，始终控制所述基础培养基的葡萄糖浓度在20-40g/L，总葡萄糖用量达到100g/L；培养时间为60h。
2.虾青素含量测定(1)虾青素的提取取1.0ml上述培养60h的菌液，离心，弃去上清，加入70℃的二甲亚砜0.2ml，旋涡振荡30秒，加入1ml甲醇-二氯甲烷(3∶1)混合有机溶剂来提取色素。离心，收集上清(含有色素)。如果沉淀还有颜色，重复上述过程，直到沉淀无色，合并上清，离心(120,000r/min，10分钟)，-20℃避光保存，待测(样品可直接检测)。
(2)高压液相色谱法测定虾青素Waters 600E高压液相色谱仪；ZY1104型液相色谱柱(填料C-18，dp10μm)，柱长25cm，内径4mm；2487双光束紫外检测器。流动相为甲醇-二氯甲烷(9∶1)；流速1.0mL/min；检测波长476nm。
测定结果为虾青素的产量达30mg/L。测定结果表明采用本发明所述的中温型虾青素生产菌的培养方法，培养周期短，虾青素产量高。
实施例3中温型虾青素产生菌的培养及虾青素含量测定1.中温型虾青素产生菌的培养(1)发酵罐种子培养挑取该虾青素产生菌的单菌落，接入到50mL液体种子培养基中，在24℃，220r/min下培养40h，培养液OD600＝8.0；再按照5％接种量将上述种子培养液接入到50mL所述的液体种子培养基中，在24℃，220r/min下培养36h，培养液OD600＝8.0；然后按照5％接种量将得到的种子培养液转入到100mL所述的液体种子培养基中，在24℃，220r/min下培养36h，培养液OD600＝8.0；(2)补料发酵按照5％接种量将所述步骤(1)得到的种子液接入到装有4.0L液体分批基础培养基的7.5L发酵罐中进行分批培养；用体积比为10％的HCl和10mol/L的NaOH将所述基础培养基的pH控制在5.0，通气量为0.8L/L/min；通过调节转速将溶氧控制在40％；当所述基础培养基的葡萄糖浓度降至20g/L时第一次补料，使葡萄糖浓度恢复到40g/L，始终控制所述基础培养基的葡萄糖浓度在20-40g/L，总葡萄糖用量达到100g/L；培养时间为70h。
2.虾青素含量测定(1)虾青素的提取取1.0ml上述培养70h的菌液，离心，弃去上清，加入70℃的二甲亚砜0.2ml，旋涡振荡30秒，加入1ml甲醇-二氯甲烷(3∶1)混合有机溶剂来提取色素。离心，收集上清(含有色素)。如果沉淀还有颜色，重复上述过程，直到沉淀无色，合并上清，离心(120,000r/min，10分钟)，-20℃避光保存，待测(样品可直接检测)。
(2)高压液相色谱法测定虾青素Waters 600E高压液相色谱仪；ZY1104型液相色谱柱(填料C-18，dp10μm)，柱长25cm，内径4mm；2487双光束紫外检测器。流动相为甲醇-二氯甲烷(9∶1)；流速1.0mL/min；检测波长476nm。
测定结果为虾青素的产量达32mg/L。测定结果表明采用本发明所述的中温型虾青素生产菌的培养方法，培养周期短，虾青素产量高。
实施例4中温型虾青素产生菌的培养及虾青素含量测定1.中温型虾青素产生菌的培养(1)发酵罐种子培养挑取该虾青素产生菌的单菌落，接入到50mL液体种子培养基中，在25℃，200r/min下培养40h，培养液OD600＝8.0；再按照5％接种量将上述种子培养液接入到50mL所述的液体种子培养基中，在25℃，200r/min下培养48h，培养液OD600＝8.0；然后按照5％接种量将得到的种子培养液转入到100mL所述的液体种子培养基中，在25℃，200r/min下培养48h，培养液OD600＝8.0；(2)补料发酵按照5％接种量将所述步骤(1)得到的种子液接入到装有4.0L液体分批基础培养基的7.5L发酵罐中进行分批培养；用体积比为10％的HCl和10mol/L的NaOH将所述基础培养基的pH控制在5.2，通气量为0.9L/L/min；通过调节转速将溶氧控制在50％；当所述基础培养基的葡萄糖浓度降至20g/L时第一次补料，使葡萄糖浓度恢复到40g/L，始终控制所述基础培养基的葡萄糖浓度在20-40g/L，总葡萄糖用量达到100g/L；培养时间为72h。
2.虾青素含量测定(1)虾青素的提取取1.0ml上述培养72h的菌液，离心，弃去上清，加入70℃的二甲亚砜0.2ml，旋涡振荡30秒，加入1ml甲醇-二氯甲烷(3∶1)混合有机溶剂来提取色素。离心，收集上清(含有色素)。如果沉淀还有颜色，重复上述过程，直到沉淀无色，合并上清，离心(120,000r/min，10分钟)，-20℃避光保存，待测(样品可直接检测)。
(2)高压液相色谱法测定虾青素Waters 600E高压液相色谱仪；ZY1104型液相色谱柱(填料C-18，dp10μm)，柱长25cm，内径4mm；2487双光束紫外检测器。流动相为甲醇-二氯甲烷(9∶1)；流速1.0mL/min；检测波长476nm。
测定结果为虾青素的产量达33mg/L。测定结果表明采用本发明所述的中温型虾青素生产菌的培养方法，培养周期短，虾青素产量高。
实施例5中温型虾青素产生菌的培养及虾青素含量测定1.中温型虾青素产生菌的培养(1)发酵罐种子培养挑取该虾青素产生菌的单菌落，接入到50mL液体种子培养基中，在26℃，260r/min下培养40h，培养液OD600＝8.5；再按照5％接种量将上述种子培养液接入到50mL所述的液体种子培养基中，在26℃，260r/min下培养60h，培养液OD600＝8.5；然后按照5％接种量将得到的种子培养液转入到100mL所述的液体种子培养基中，在26℃，260r/min下培养60h，培养液OD600＝8.5；(2)补料发酵按照5％接种量将所述步骤(1)得到的种子液接入到装有4.0L液体分批基础培养基的7.5L发酵罐中进行分批培养；用体积比为10％的HCl和10mol/L的NaOH将所述基础培养基的pH控制在5.2，通气量为0.9L/L/min；通过调节转速将溶氧控制在70％；当所述基础培养基的葡萄糖浓度降至20g/L时第一次补料，使葡萄糖浓度恢复到40g/L，始终控制所述基础培养基的葡萄糖浓度在20-40g/L，总葡萄糖用量达到100g/L；培养时间为80h。
2.虾青素含量测定(1)虾青素的提取取1.0ml上述培养80h的菌液，离心，弃去上清，加入70℃的二甲亚砜0.2ml，旋涡振荡30秒，加入1ml甲醇-二氯甲烷(3∶1)混合有机溶剂来提取色素。离心，收集上清(含有色素)。如果沉淀还有颜色，重复上述过程，直到沉淀无色，合并上清，离心(120,000r/min，10分钟)，-20℃避光保存，待测(样品可直接检测)。
(2)高压液相色谱法测定虾青素
Waters 600E高压液相色谱仪；ZY1104型液相色谱柱(填料C-18，dp10μm)，柱长25cm，内径4mm；2487双光束紫外检测器。流动相为甲醇-二氯甲烷(9∶1)；流速1.0mL/min；检测波长476nm。
测定结果为虾青素的产量达35mg/L。测定结果表明采用本发明所述的中温型虾青素生产菌的培养方法，培养周期短，虾青素产量高。
权利要求
1.一种中温型虾青素产生菌法夫酵母(Phaffia rhodozyma)A-1 CGMCCNo.1837。
2.一种根据权利要求1所述的虾青素产生菌的培养方法，其特征在于它包括下述步骤(1)发酵罐种子培养挑取该虾青素产生菌的单菌落，接入到50mL液体种子培养基中，在23-26℃，200-260r/min下培养36-40h，培养液OD600＝7.5-8.5；再按照5％接种量将上述种子培养液接入到所述的液体种子培养基中，在23-26℃，200-260r/min下培养36-60h，培养液OD600＝7.5-8.5；然后按照5％接种量将得到的种子培养液转入到所述的液体种子培养基中，在23-26℃，200-260r/min下培养36-60h，培养液OD600＝7.5-8.5；(2)补料发酵按照5％接种量将所述步骤(1)得到的种子液接入到装有液体分批基础培养基的发酵罐中进行分批培养；用体积比为10％的HCl和10mol/L的NaOH将所述基础培养基的pH控制在4.8-5.2，通气量为0.7-0.9L/L/min；通过调节转速将溶氧控制在20-70％；当所述基础培养基的葡萄糖浓度降至20g/L时第一次补料，使葡萄糖浓度恢复到40g/L，始终控制所述基础培养基的葡萄糖浓度在20-40g/L；培养时间为60-80h。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于培养过程中所用到的培养基组成为所述的种子培养基葡萄糖40g/L，酵母粉4g/L，尿素3.6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.0；所述的基础培养基葡萄糖40g/L，酵母粉10g/L，尿素3.6g/L，硫酸铵5.0g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH6.0；所述的补料培养基质量体积比为40％的葡萄糖补料液。
4.根据权利要求2或3所述的虾青素产生菌的培养方法，其特征在于培养60-80h小时，虾青素的产量达到30-35mg/L。
全文摘要
本发明提供了一种中温型虾青素产生菌法夫酵母(Phaffia rhodozyma)A－1 CGMCC No.1837。本发明还提供了该中温型虾青素产生菌的培养方法。本发明提供的中温型虾青素生产菌营养要求简单，工业生产的能耗相对低温型生产菌大为降低。本发明所述的虾青素生产菌的培养方法，工艺简便，培养周期短，虾青素产量高，有利于工业化生产。
文档编号C12P23/00GK1986773SQ20061014088
公开日2007年6月27日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者李颖, 王永星, 孟永宏, 徐志文 申请人:秦皇岛领先科技发展有限公司