专利名称：旋毛虫活体传代方法
技术领域：
本发明属于兽医领域，具体地说是一种旋毛虫活体传代操作技术。
背景技术：
旋毛虫(Trichinella spiralis)属于线虫动物门(Nemathelminthes)、线虫纲(Nematoda)、无尾感器亚纲(Aphasmidia)、毛首亚目(Trichocephalata)、毛形科(Trichinellidae)的毛形属(Trichinella)。旋毛虫于1828年首次在人尸体解剖中发现，1835年由英国动物学者命名为旋毛虫，我国在1881年首次在厦门的猪体发现。
旋毛虫是一种人畜共患的寄生性线虫，成虫寄生于肠管，幼虫寄生于横纹肌。宿主包括人、猪、鼠、犬、猫、熊、狐、狼、貂和黄鼠狼等120多种哺乳动物。人感染旋毛虫可致死亡，感染来源主要由于摄入了生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的肉类，故在食品卫生检验中将旋毛虫列为首检项目，在公共卫生上极为重要。
1972年前，人们一直认为旋毛虫只有一个种。后来学者们从形态、生态、生理、生化、免疫等不同角度对旋毛虫的研究表明，虽然世界各地分自人体或动物体的旋毛虫在形态上相似，但它们在生物性状上却存在着差异。生物化学及分子生物学等新技术的应用，使旋毛虫虫种分类鉴定进入了一个崭新时代，通过现代生物学技术对旋毛虫的遗传物质核酸及其编码产物蛋白质的分析，更进一步证实了这些差异。目前在国际上将旋毛虫分为5个隔离种(Isolates)及3个未确定分类地位的基因型，即旋毛形线虫(T.spiralis，T1)、本地毛形线虫(T.nativa，T2)、伪旋毛形线虫(T.pseuodospiralis，T3)、尼氏毛形线虫(T.nelsoni，T4)、米氏毛形线虫(T.murrelli，T5)、布氏毛形线虫(T.britovi，T7)、巴布亚毛形线虫(T.papuae，T10)、T6、T8和T9。在我国，现认为有2个旋毛虫隔离种，黑龙江省猪旋毛虫为旋毛形线虫(T.spiralis，T1，编号ISS533)，犬和猫旋毛虫为本地毛形线虫(T.nativa，T2，编号ISS531和ISS532)，现已保存在国际旋毛虫虫种保臧中心(意大利，http://www.trichi.iss.it)。
引证反映背景技术的相关文件包括[1]唐仲璋，唐崇惕.人畜线虫学[M].北京科学出版社，1987，11129-135.孔繁瑶.家畜寄生虫学[M].北京中国农业大学出版社，1997，5252-256.朱兴全龚广学薛富汉等.旋毛虫病[M].河南河南科技出版社，1993，3[4]宋铭忻，周源昌，李淑声.哈尔滨地区犬旋毛虫对猪、犬的感染性研究[J].畜牧兽医学报1995，6(26)530-533.
发明内容本发明的目的在于提供一种为了实现旋毛虫在保种、传代、维持生活循环等操作步骤的标准化，保障所保藏虫种生物性状的稳定性，为科研、教学、检疫和生产提供标准化的虫种资源而制定的以规范旋毛虫虫种质资源的保藏行为的旋毛虫活体传代操作技术。
本发明的目的是这样实现的一种旋毛虫活体传代方法为(1)选择2月龄、品种相同的健康实验动物接种，接种前停饮2～3天；(2)在生物显微镜下，将计数准确的幼虫用小型胃管经口接种给实验动物；(3)实验动物接种后放在饲养笼具中，笼具外须标明保种的虫种名称、接种日期、虫种编号、虫种来源和传代次数；(4)每天观察接种实验动物的健康状况，于接种后40～60天，按实验动物管理条理，宰杀接种小鼠，取膈肌进行压片镜检，观察到典型的虫体形态，并确为单一旋毛虫隔离种后即可进行虫体的保藏。
本发明还有这样一些结构特征1、所述的在生物显微镜下，按实验动物接种剂量为200蚴/只计数出经消化法获得的旋毛虫幼虫数量，然后接种；2、所述的经消化法获得的旋毛虫幼虫是采用下述方法获得的幼虫(1)将含有旋毛虫幼虫的实验动物按实验动物管理条例提供的方法处死，剥皮、去头尾、四爪及内脏，保留胴体肌肉；(2)将要消化的肌肉样品彻底去除筋膜和脂肪，应用旋毛虫压片法观察并计数肉样内的旋毛虫幼虫数量，根据幼虫数秤取适当重量的肉样，然后将其剪成大小合适的肌肉块放于组织捣碎机中；(3)配制人工消化液，用量筒按肌肉样品重量与水的比例为1∶15～20量取清水，再按水与胃蛋白酶和浓盐酸的比例为100∶1∶1量取胃蛋白酶和浓盐酸，然后将其用玻璃棒充分混合；(4)加适量人工消化液于组织捣碎机中捣碎，直至将肉样搅为肉液；(5)将捣碎机中的肉液转入适当的容器中，补足剩余人工消化液而成消化混合液；(6)将容器放于电热恒温振荡培养箱中作用，直至肉液中的肉样彻底消化；(7)孵育结束后，将消化混合液通过网筛，滤液进入小型瓷盆中；(8)反复洗涤沉淀直至滤液澄清为止；(9)小心倾去上清液，剩下液体注入到贝尔曼氏装置中，静置后在生物显微镜下检查旋毛虫幼虫并计数；3、所述的胃蛋白酶的活力单位为1∶3000；4、所述的加入人工消化液于组织捣碎机中时每停顿5～8秒搅拌10～20秒；5、所述的将捣碎机中的肉液转入的容器为广口玻璃容器，将广口玻璃容器放于电热恒温振荡培养箱中作用的温度为37℃，作用4～6小时；6、所述的孵育结束后，将消化混合液通过60目、孔径300μm网筛，滤液进入小型瓷盆中；7、所述的反复洗涤沉淀为2～3次，每次静止30分钟；8、所述的倾去上清液后剩下1/5的液体注入到贝尔曼氏装置中，静置30分钟后在生物显微镜下检查旋毛虫幼虫并计数。
本发明公开了旋毛虫活体传代操作的基本原则、方法及技术要求，适用于国际和国内各科研、教学、检疫和生产单位的不同旋毛虫虫种的活体传代和保存。
具体实施方式
1适用范围本发明公开了旋毛虫活体传代操作的基本原则、方法及技术要求。
本发明适用于国际和国内各科研、教学、检疫和生产单位的不同旋毛虫虫种的活体传代和保存。
2术语与定义下列术语和定义适用于本发明2.1旋毛虫(Trichinella spiralis)指可以感染宿主，主要寄生在宿主横纹肌内而引发旋毛虫病的一类寄生虫。
2.2旋毛虫虫种资源指在野外采集获得的或在实验室内已经保存的、通过动物传代或保藏、具有实际或潜在实用价值的旋毛虫。获得旋毛虫虫种资源的主要目的是为了进行虫种制备物(抗原)、血清(感染宿主血清、免疫宿主血清)、抗体、DNA、cDNA、RNA、基因克隆、基因文库等相关内容的研究与获取。
3原理旋毛虫的宿主非常广泛，人、猪、鼠、熊等120多种动物都可以感染，甚至不吃肉的鲸也能感染。旋毛虫的另一特点就是成虫与幼虫寄生于同一宿主。宿主因吞食了含有包囊型幼虫的动物肌肉而受感染，包囊在宿主胃内被溶解，释放出幼虫，到十二指肠和空肠中变为性成熟的雌、雄成虫，7～10天后雌、雄成虫交配并在粘膜中产新生幼虫，新生幼虫经淋巴和血液被带到全身，在横纹肌纤维中发育，并形成包囊。7～8周后完全形成，幼虫在囊内呈螺旋状的盘曲，发育充分的幼虫，常有2.5个盘圈，此时即有感染能力。包囊型幼虫的生存时间，随个体不同可能由数月至25年。
由于小鼠对旋毛虫各隔离种均较敏感，饲养易于标准化；旋毛虫在宿主体内繁殖力极强(1条雌虫能产1000-10000条新生幼虫)和存活时间极长(数月至25年)。因此，常采用标准化的小鼠作为旋毛虫活体传代和保存的模式动物。
4传代、保藏技术4.1传代、保藏方法虫种经小鼠接种传代、保藏。
4.2标示牌用塑料或纸质标明资源编号、虫种名称(中文和拉丁文)、代次、虫种来源(时间、地点、动物)及接种时间等信息。
4.2保藏容器小鼠饲养笼具。
4.3保藏基物接种了旋毛虫虫种的SPF小鼠。
4.3保藏方法接种了旋毛虫虫种的SPF小鼠按实验动物管理条理饲养与管理。
4.5保藏时间一般视保藏实验动物数量的多少在2个月至一年左右进行新的复壮传代、保藏。
一次要接种的旋毛虫肌幼虫一般为150～200个，最多不超过250个。在4℃冰箱中保藏含旋毛虫幼虫的肌肉可保藏7-10天，仍保持虫体的活力，但保存方式、保藏包装物等因素易影响保藏时间。
4.6保藏期间的检测定期检查饲养接种的小鼠笼具有无损坏、悬挂绳是否断落、标示牌内容是否清晰等。
4.7传代、繁殖复核大量病原体进行繁殖时，旋毛虫各隔离种的编号和所用的繁殖动物需仔细核对无误。每次繁殖培养后，对照原保藏的顺序号卡片名录，核实无误再行存放。
4.8保臧指标接种后50-60天，按实验动物管理条理，宰杀接种小鼠，取膈肌进行压片镜检，观察到典型的虫体形态，并确为单一旋毛虫隔离种后即可进行虫体的保藏。确定旋毛虫为单一隔离种是根据分子生物学的随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)或DNA探针。
5操作方法与步骤
5.1实验动物和材料5.1.1旋毛虫虫种对采集的旋毛虫虫种鉴定后标明虫种统一编号；对国际和国内赠送或交换的标准旋毛虫虫种，应根据其提供的相关资料和要求须标明虫种编号、虫种来源和保种代次后，再作进一步的传代和保藏登记；5.1.2实验动物2月龄左右、品种相同的健康SPF小鼠，须标明提供实验动物场编号和实验动物级别；5.1.3主要试剂和器材(1)胃蛋白酶(活力单位1∶3000)和浓盐酸(2)电热恒温振荡培养箱(3)高速自控组织捣碎机(4)生物显微镜(5)贝尔曼氏装置(6)旋毛虫压板(7)计数器(8)恒温水浴锅5.2旋毛虫消化法及其幼虫获取方法(1)将野外采集获得的、含有旋毛虫幼虫的动物或实验室内保种的实验动物(如小鼠)按实验动物管理条例提供的方法处死，剥皮、去头尾、四爪及内脏，保留胴体肌肉；(2)将要消化的肌肉样品彻底去除筋膜和脂肪，应用旋毛虫压片法观察并计数肉样内的旋毛虫幼虫数量，根据幼虫数秤取适当重量的肉样，然后将其剪成大小合适的肌肉块放于组织捣碎机中；(3)配制人工消化液，用量筒按肌肉样品重量(g)与水(ml)的比例为1∶15～20量取清水，再按水与胃蛋白酶(g)和浓盐酸(ml)的比例为100∶1∶1量取胃蛋白酶和浓盐酸，然后将其用玻璃棒充分混合；(4)加适量人工消化液于组织捣碎机中，每停顿5～8秒搅拌10～20秒，直至将肉样搅为肉液；(5)将捣碎机中的肉液转入适当的广口玻璃容器中，补足剩余人工消化液而成消化混合液；(6)将广口玻璃容器放于37℃电热恒温振荡培养箱中作用4～6小时，直至肉液中的肉样彻底消化；(7)孵育结束后，将消化混合液通过60目、孔径300μm网筛，滤液进入小型瓷盆中；(8)反复洗涤沉淀2～3次，每次静止30分钟，直至滤液澄清为止；
(9)小心倾去上清液，剩下1/5左右的液体注入到贝尔曼氏装置中，静置30分钟后在生物显微镜下检查旋毛虫幼虫并计数。
5.3实验动物接种与旋毛虫幼虫计算(1)2月龄、品种相同的健康小鼠接种前，停饮2～3天；(2)在生物显微镜下，按小鼠接种剂量为200蚴/只，准确计数出经消化法获得的旋毛虫幼虫数量，然后将计数准确的幼虫用小型胃管经口接种给小鼠，接种后在显微镜下检查所用器具内是否残留幼虫，以确保接种准确；(3)小鼠接种后放在饲养笼具中，笼具外须标明保种的虫种名称(中文和拉丁文)、接种日期、虫种编号、虫种来源和传代次数；(4)每天观察接种小鼠的健康状况，于接种后40～60天剖杀。以旋毛虫压片法和消化法检查幼虫，计算LPG和RCI，并记录；LPG(Larvae Per Gram)为每克肌幼虫数每克肌肉消化后获得的旋毛虫幼虫数；RCI(Reproductive Capacity Index)为繁殖力指数接种动物后所获旋毛虫幼虫数除以接种幼虫数。
6实验用品的消毒6.1保种用实验动物和一次性用具按实验动物管理条例提供的方法处理；6.2使用过的实验用具需经过先行煮沸消毒后，再行常规消毒；6.3保种使用过的动物笼具等需先用沸水消毒后，再行常规消毒。
权利要求
1.一种旋毛虫活体传代方法，其特征是(1)选择2月龄、品种相同的健康实验动物接种，接种前停饮2～3天；(2)在生物显微镜下，将计数准确的幼虫用小型胃管经口接种给实验动物；(3)实验动物接种后放在饲养笼具中，笼具外须标明保种的虫种名称、接种日期、虫种编号、虫种来源和传代次数；(4)每天观察接种实验动物的健康状况，于接种后40～60天，按实验动物管理条理，宰杀接种实验动物，取膈肌进行压片镜检，观察到典型的虫体形态，并确为单一旋毛虫隔离种后即可进行虫体的保藏。
2.根据权利要求1所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的在生物显微镜下，按实验动物接种剂量为200蚴/只计数出经消化法获得的旋毛虫幼虫数量，然后接种。
3.根据权利要求1所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的经消化法获得的旋毛虫幼虫是采用下述方法获得的幼虫(1)将含有旋毛虫幼虫的实验动物按实验动物管理条例提供的方法处死，剥皮、去头尾、四爪及内脏，保留胴体肌肉；(2)将要消化的肌肉样品彻底去除筋膜和脂肪，应用旋毛虫压片法观察并计数肉样内的旋毛虫幼虫数量，根据幼虫数秤取适当重量的肉样，然后将其剪成大小合适的肌肉块放于组织捣碎机中；(3)配制人工消化液，用量筒按肌肉样品重量与水的比例为1∶15～20量取清水，再按水与胃蛋白酶和浓盐酸的比例为100∶1∶1量取胃蛋白酶和浓盐酸，然后将其用玻璃棒充分混合；(4)加适量人工消化液于组织捣碎机中捣碎，直至将肉样搅为肉液；(5)将捣碎机中的肉液转入适当的容器中，补足剩余人工消化液而成消化混合液；(6)将容器放于电热恒温振荡培养箱中作用，直至肉液中的肉样彻底消化；(7)孵育结束后，将消化混合液通过网筛，滤液进入小型瓷盆中；(8)反复洗涤沉淀直至滤液澄清为止；(9)小心倾去上清液，剩下液体注入到贝尔曼氏装置中，静置后在生物显微镜下检查旋毛虫幼虫并计数。
4.根据权利要求3所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的胃蛋白酶的活力单位为1:3000。
5.根据权利要求3所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的加入人工消化液于组织捣碎机中时每停顿5～8秒搅拌10～20秒。
6.根据权利要求3所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的将捣碎机中的肉液转入的容器为广口玻璃容器，将广口玻璃容器放于电热恒温振荡培养箱中作用的温度为37℃，作用4～6小时。
7.根据权利要求3所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的孵育结束后，将消化混合液通过60目、孔径300μm网筛，滤液进入小型瓷盆中。
8.根据权利要求3所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的反复洗涤沉淀为2～3次，每次静止30分钟。
9.根据权利要求3所述的旋毛虫活体传代方法，其特征是所述的倾去上清液后剩下1/5的液体注入到贝尔曼氏装置中，静置30分钟后在生物显微镜下检查旋毛虫幼虫并计数。
全文摘要
本发明公开了一种旋毛虫活体传代方法。它包括首先选择2月龄、品种相同的健康实验动物接种，接种前停饮2～3天；在生物显微镜下，将计数准确的幼虫用小型胃管经口接种给实验动物；实验动物接种后放在饲养笼具中，每天观察接种实验动物的健康状况，于接种后40～60天宰杀接种实验动物，取膈肌进行压片镜检，观察到典型的虫体形态，并确为单一旋毛虫隔离种后即可进行虫体的保藏。本发明规定了旋毛虫活体传代操作的基本原则、方法及技术要求，适用于国际和国内各科研、教学、检疫和生产单位的不同旋毛虫虫种的活体传代和保存。
文档编号C12Q1/24GK1961844SQ20061015105
公开日2007年5月16日 申请日期2006年11月24日 优先权日2006年11月24日
发明者宋铭忻, 路义鑫, 韩彩霞, 袁金钱, 朱江巍, 姜曰晓, 王君, 朱艳梅 申请人:东北农业大学