专利名称：对癌特异的基因和采用该基因的诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及对癌特异的基因和采用该基因制备的试剂盒，还涉及应用该基因的方法。
背景技术：
癌症的早期发现，是癌症对策最重要的课题。特别是发生在大肠上部的癌症，由于很少有自觉症状，发现时病情正在发展，危险性较高，因而早期发现尤为重要。
对于大肠癌，一直采用的方法是通过便潜血反应进行筛选，用CEA或CA19-9等血清标记进行诊断，同时在治疗过程中进行诊断。但是这些方法都是在进行性癌症中阳性率高的诊断方法，而在早期癌症中的阳性率极低，因而难于正确诊断。
另一方面，已经提出了用癌组织特异性蛋白质标记的分子生物学诊断方法，这种方法有可能既简便又确切地早期诊断恶性肿瘤。这种方法不需要大型设备，被检测对象的负担较少，因而可以广泛地对多数没有自觉症状的对象进行检验。例如在日本特开平7-51065号公报中，公开了利用糖蛋白39作为肿瘤标记物的方法。
同时，在国际上公布的第2004/018679号单行本中，记述了有关采用CENP-A(着丝粒蛋白A)制备癌诊断试剂盒的技术。
然而，单靠上述专利文献1中记述的技术，还不能完全确诊癌的表达，仍存有课题，必须采用多种手段才能作出更确切的判断。
本发明以提供新的与癌症表达有关的基因的进一步鉴定，并采用该基因的诊断试剂盒为目的。
发明的公开根据以上情况，本发明采取了以下具体手段。
首先第一种手段是下述(a)至(c)所述之任何一种多核苷酸。
(a)由序列编号1所述的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸、(b)由相似性与序列编号1所述的碱基序列或其互补序列至少在70％以上的碱基序列组成的多核苷酸、(c)编码由序列编号2所述的氨基酸序列或该该氨基酸序列中一个至数个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
在采用这一手段时，应该使用检测癌症的标记。为了确认这一手段中多核苷酸会在癌组织中高度表达，可以主要靠使用标记来诊断癌症。而且与序列编号1所述的碱基序列的相似性应该在70％以上，较好的应在80％，最好的应在90％以上。
第二种手段是含有第一种手段中的多核苷酸的核酸分子。
第三种手段是采用了对第一种手段中的多核苷酸特异的因子的癌症诊断试剂盒。本说明书中所谓“特异的基因”，是指对多核苷酸的亲和性比对无关的(特别是相似性低于30％的)多核苷酸的亲和性明显要高的基因。
亲和性可以借助诸如杂交检测、结合性检测等来测定。
同时，在这种手段中，特异性因子是包括核酸分子、多肽、脂类、糖链、有机低分子，以及由它们组成的复合分子在内的一群物质中至少任何一种。上述癌症诊断试剂盒诊断的癌症，最好是直肠癌或结肠癌。
第四种手段是序列编号3所述碱基序列组成之引物。
第五种手段是序列编号4所述碱基序列组成之引物。
第六种手段是序列编号3所述碱基序列组成之引物和序列编号4所述碱基序列组成之引物组成的引物对。
第七种手段是包括求出分别从两种细胞取得的样品中的由序列编号2所述氨基酸序列组成的蛋白质表达量，以及计算出表达量之比等两个步骤的方法。此时一种样品采自非癌组织，另一种样品采自疑似癌组织，当两者的表达量不同时，可以判定高危的可疑癌症患者。
在此过程中，还应该包括采用蛋白质印迹法求得蛋白质表达量的步骤，取样的两种细胞中(其中之一是取自非癌组织中的细胞，另一种是取自癌组织中)计算出的表达量之比是否在1.7以上的判定步骤。
通过以上手段，可以提供一种新的与癌症表达有关的基因的进一步鉴定，以及采用了该基因的诊断试剂盒。
图1是表示对CENP-H进行蛋白质印迹的结果的图。
图2是表示对hMis12进行蛋白质印迹的结果的图。
图3是表示用抗人CENP-H多克隆抗体对直肠癌组织及与其邻接的非直肠癌组织切面进行染色的结果的图。
图4是表示用RT-PCR和实时定量PCR分别检测直肠癌组织和正常组织表面的CENP-H的mRNA含量的结果的图。
图5是表示用RT-PCR和实时定量PCR分别检测直肠癌组织和正常组织表面的CENP-H的mRNA含量的结果的图。
为实施发明的最佳方式以下就本发明的一个实施例加以详细说明。
(组织的取样)用外科方法取得15名早期结肠直肠癌患者的身体组织。分别采集癌的组织(以下简称“癌组织”)和距离癌组织5～10厘米部分的组织(以下简称“非癌组织”)。需要说明的是，将采集的组织立即浸入液氮中，-80℃冷冻保存。
(蛋白质的提取)然后向冷冻保存的组织中加入裂解缓冲液[lysis buffer，(7M urea、2M thiourea、2％3-[(3-cholamidopropyl)Dimethylammonio]-1-Propane-sulfonate、0.1M DTT、2％IPG buffer(AmershamPharmacia Biotech公司出品)、40mM Tris)，用Polytron匀浆器(Kinematica公司出品)裂解，4℃下10000×g离心分离1小时后，取上清液，提取出蛋白质。
(免疫印迹)蛋白质在槽式转录装置(Bio-Rad公司出品)中转录到聚偏二氟乙烯膜上，该膜先用含5％脱脂牛奶的由磷酸盐缓冲液(PBS)中封闭，然后将分别在封闭缓冲液中以1∶5000稀释的兔抗CENP-H、以1∶100稀释的兔抗hMis12、以1∶500稀释的羊抗β肌动蛋白抗体作为一次抗体、将分别在封闭缓冲液中以1∶3000稀释的羊抗兔IgG HRP、以1∶500稀释的兔抗羊IgG HRP作为二次抗体。
另外，用强化化学发光检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech公司出品)检测抗原膜上的抗体。并且，各条带的强度通过NIH图像进行测定。
(PCR及实时定量PCR)用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen公司出品)分别由癌组织和非癌组织中抽提总RNA。并且，以适用于RT-PCR的第一链cDNA合成试剂盒(1stStrand cDNA synthesis kit for RT-PCR，Roche公司出品)分别由总RNA合成cDNA。
然后，通过上述合成获得的各自的cDNA作为模板，用PCR扩增CEMP-H的cDNA。需要说明的是，使用PCR时，将含有序列编号3所述碱基序列的引物作为正向引物，将含有序列编号4所述碱基序列的引物作为反向引物，用GAPDH的cDNA或β肌动蛋白作为对照进行扩增。
然后，在LightCycler毛细管中进行CENP-H的cDNA的实时定量PCR。在此反应中，PCR反应混合液采用LightCycler DNA Master SYBRGreen I(快速启动Taq DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、SYBR Green I)，向其中加入3.0mM MgCl2、序列编号3所述引物和序列编号4所述引物各0.5μM，总体积2.0μl。
然后用LightCycler软件3.3(Roche公司出品)进行分析。
(免疫组织染色法)冷冻的组织切片在载波片上干燥后，于4℃的丙酮中固定。然后，用PBS洗涤3次后，在封闭缓冲液(10％牛胎血清/PBS)中封闭1小时。
样品采用以1∶2000稀释的兔抗CENP-H抗体和以1∶1000稀释的抗人CENP-A的单克隆抗体，或其二者之一，在3％的牛血清白蛋白/PBS中保温1小时。用PBS洗涤后，将样品与1∶1000稀释的结合了AlexaFluorTM488或594的羊抗兔抗鼠IgG二次抗体(Molecular Probes公司出品)和/或结合了Alexa FluorTM594的羊抗鼠IgG二次抗体一起保温1小时。
用DAPI III对比染色剂(Vysis公司出品)对DNA进行对比染色。用荧光显微镜(Leica QFISH公司出品)观察样品。需要说明的是，为了进行苏木精-伊红(HE)染色，将组织切片在苏木精中染色30分钟，用100％的乙醇和二甲苯干燥，用Permount(一种封埋胶)将其封固。
(结果)图1中表示用蛋白印迹法获得的结果。如图1所示，在15个病例中，在癌组织中都表达出非常多量的CENP-H。特别是在非癌组织和癌组织中的CENP-H的表达量之比为1.7～9.6，在癌组织和非癌组织中可见到很大的差异。另一方面，当为着丝粒蛋白hMis12时，则在癌组织和非癌组织中则未能见到特别的差异(参考图2，图中病例编号与图1中病例的组织编号相同。)然后，为了确定CENP-H不是在间质细胞，而是在癌细胞中表达的，对大肠直肠癌组织和与其邻接的非癌部位的组织的切面用抗人CENP-H多克隆抗体进行染色。图3中表示了其结果。需要说明的是，图3(a)显示癌症部位的HE染色图像、图3(b) (c) (d)显示癌症部位CENP-H抗体免疫染色图像、图3(e)显示非癌症部位的HE染色图像、图3(f)显示非癌症部位CENP-H染色图像。
这些结果，肯定了CENP-H、CENP-A或CENP-C等着丝粒蛋白一样，与着丝粒保持一致，在细胞核的中心部位，呈较小的斑点状存在。确认了CENP-H在癌部分比起非癌组织(图3(f))中，在数量和大小上有所增加(参看图3(c)和(d))。而且还确认了，染色后的CENP-H不是在间质细胞中，而是在癌的上皮部位。并且，在各种组织切片中进行了本实验，都表现同样的结果。
根据以上结果，可以肯定CENP-H是在癌细胞内表达。
其次，为了确认CENP-H的过量表达是由于转录增加引起的结果，用RT-PCR和实时定量PCR对大肠直肠癌组织中的CENP-H的mRNA含量和非癌组织中CENP-H的mRNA含量的进行了分析。图4和图5表示了分析结果。
如图4所示，得知癌组织中CENP-H的mRNA的表达水平比非癌部位组织的增加得非常多。而且，得知CENP-H的mRNA表达水平，和图1所示的非癌组织与癌组织的CENP-H表达量之比呈现显著的相关性。而用作对照的GAPDH中已经确认，癌组织和非癌组织中未见差异。
图5是将图4所示的mRNA表达水平在非癌组织和癌组织之间进行比较用Stat View软件进行统计分析求出的结果。由图5可见，癌组织(Cancer)是非癌组织(Normal)表达量的约5倍。据此得知通过检测CENP-H的表达可以肯定癌的存在。
产业上应用可能性通过以上所述之本发明，可以鉴定新的与癌症表达有关的基因，而且能够采用该基因提供出诊断试剂盒。
序列表<110>国立大学法人千叶大学(Chiba University)<120>对癌特异的基因和采用该基因的诊断试剂盒(A gene in a cancer and a diagnostic kit using the same)<160>4<210>1<211>744<212>DNA<213>Homo sapiensatggaggagc agccccagat gcaagacgcc gacgagcccg cggactccgg aggggaaggc60cgggcaggcg ggccaccgca ggtcgccggc gcccaggcgg cgtgcagcga ggaccgcatg120accctgctcc tcaggctgag agcacagaca aaacaacaac tcttagaata taaatcaatg180gttgatgcaa gtgaagaaaa aactccagaa caaattatgc aagaaaagca aatcgaagct240aaaattgaag acctggaaaa tgaaattgaa gaggtaaaag ttgcttttga gataaaaaag300cttgcattag acaggatgag actttcaact gcacttaaaa aaaacctgga gaaaattagc360agacagtcta gtgtgctcat ggataacatg aaacacctat tagagctaaa taaattaata420atgaaatcac agcaggaatc ttgggattta gaggaaaaac tgcttgatat tagaaagaag480agattgcaat taaaacaagc ttcagaaagt aagcttttag aaatacagac tgaaaagaac540aaacagaaga ttgatttgga cagtatggaa aactcagaga ggataaagat catacgacaa600aacctacaga tggagataaa aattactact gttattcaac atgtgttcca gaaccttatt660ttggggagta aagtcaattg ggcagaggat cctgccctta aggaaattgt tctgcagctt720gagaagaata ttgacatgat gtaa 744<210>2<211>247<212>PRT<213>Homo sapiens<400>
Met Glu Glu Gln Pro Gln Met Gln Asp Ala Asp Glu Pro Ala Asp Ser1 5 10 15Gly Gly Glu Gly Arg Ala Gly Gly Pro Pro Gln Val Ala Gly Ala Gln20 25 30Ala Ala Cys Ser Glu Asp Arg Met Thr Leu Leu Leu Arg Leu Arg Ala35 4045Gln Thr Lys Gln Gln Leu Leu Glu Tyr Lys Ser Met Val Asp Ala Ser50 55 60
Glu Glu Lys Thr Pro Glu Gln Ile Met Gln Glu Lys Gln Ile Glu Ala65 70 75 80Lys Ile Glu Asp Leu Glu Asn Glu Ile Glu Glu Val Lys Val Ala Phe85 9095Glu Ile Lys Lys Leu Ala Leu Asp Arg Met Arg Leu Ser Thr Ala Leu100 105 110Lys Lys Asn Leu Glu Lys Ile Ser Arg Gln Ser Ser Val Leu Met Asp115 120125Asn Met Lys His Leu Leu Glu Leu Asn Lys Leu Ile Met Lys Ser Gln130 135140Gln Glu Ser Trp Asp Leu Glu Glu Lys Leu Leu Asp Ile Arg Lys Lys145 150155 160Arg Leu Gln Leu Lys Gln Ala Ser Glu Ser Lys Leu Leu Glu Ile Gln165 170175Thr Glu Lys Asn Lys Gln Lys Ile Asp Leu Asp Ser Met Glu Asn Ser180 185190Glu Arg Ile Lys Ile Ile Arg Gln Asn Leu Gln Met Glu Ile Lys Ile195 200205Thr Thr Val Ile Gln His Val Phe Gln Asn Leu Ile Leu Gly Ser Lys210 215220Val Asn Trp Ala Glu Asp Pro Ala Leu Lys Glu Ile Val Leu Gln Leu225 230 235 240Glu Lys Asn Val Asp Met Met245<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>cagtctagtg tgctcatgga t 21<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>tccatctgta ggttttgtcg20
权利要求
1.下述(a)至(c)中任何一项所述的多核苷酸(a)由序列编号1所述的碱基序列或其互补序列组成的多核苷酸；(b)由相似性与序列编号1所述的碱基序列或其互补序列至少在70％以上的碱基序列组成的多核苷酸；(c)编码由序列编号2所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，为用于癌症检测的标记。
3.一种核酸分子，包含如权利要求1所述的多核苷酸。
4.一种癌症诊断试剂盒，采用与权利要求1所述的多核苷酸有特异性的因子。
5.如权利要求5所述的癌症诊断试剂盒，其中所述特异性因子是由核酸分子、多肽、脂类、糖链、有机低分子，以及它们的复合分子组成的组中的至少任何一种。
6.如权利要求5所述的癌症诊断试剂盒，所述癌症诊断试剂盒所诊断的癌症是直肠癌或结肠癌。
7.由序列编号3所述的碱基序列组成的引物。
8.由序列编号4所述的碱基序列组成的引物。
9.引物对，由权利要求7所述的引物和权利要求8所述的引物组成。
10.一种方法，包括如下步骤分别求出所采集的两种细胞中由序列编号2所述的氨基酸序列组成的蛋白质表达量以及计算出所求得的表达量之比。
11.如权利要求10所述的方法，其特征是所述求出蛋白质表达量的步骤采用蛋白质印迹法。
12.如权利要求10所述的方法，所述采集的两种细胞中，其中之一是非癌组织中的细胞。
13.如权利要求10所述的方法，所述采集的两种细胞中，其中之一是癌组织中的细胞。
14.如权利要求10所述的方法，包括判定所述计算出的表达量之比是否在1.7以上的步骤。
全文摘要
本发明提供一种新的与癌症表达有关的基因的进一步鉴定，以及采用了该基因的诊断试剂盒。
文档编号C12N15/09GK101090965SQ200680001350
公开日2007年12月19日 申请日期2006年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者岛田英昭, 朝长毅, 松下一之, 落合武德, 野村文夫 申请人:国立大学法人千叶大学