专利名称：：绿脓假单胞菌iatso11血清型脂多糖(lps)特异性人单克隆抗体的制作方法绿脓假单胞菌IATSOil血清型脂多糖(LPS)特异性人单克隆抗体发明领域本发明涉及一种绿脓假单胞菌IATSOil血清型特异性人单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤、编码该抗体的核酸、和用该核酸转染的宿主细胞。而且，本发明涉及产生所述单克隆抗体的方法。另外，本发明涉及包括至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。
背景技术：
：绿脓假单胞菌是一种发现于淡水和土壤的普遍存在的革兰氏阴性环境细菌。它是一种典型的条件致病菌，通常不会对免疫力完整的宿主造成威胁，免疫力完整的宿主通过调理抗体和吞噬作用将其清除。但囊性纤维化患者和免疫缺失个体——包括烧伤患者、ICU中被插管的患者、癌症和AIDS患者以及接受器官移植的患者——发生医院内感染的风险特别高。在全部医院内感染中绿脓假单胞菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素耐药肠球菌(VRE)所占的比例高达34%，医院内感染已经从1975年的7.2/1000患者'天增加至1995年的9.8/1000患者'天。最经常观察到的医院感染的形式是血流感染和肺炎。为防止囊性纤维化患者的慢性绿脓假单胞菌感染，已经建立了用于主动免疫的由结合有绿脓假单胞菌脱毒毒素A的绿脓假单胞菌的8种最相关的LPS血清型组成的八价结合疫苗。对该疫苗的长期研究已经表明，18岁时临床感染的患者的比例从约72%降低至32%。但是，主动免疫接种仅对于免疫力完整的患者以及在可预测的情况下才是有可能进行的。因此，大多数绿脓假单胞菌患者不能用八价疫苗进行主动免疫。由于这一点，并且由于大多数绿脓假单胞菌菌株耐受多种药物这一事实，需要有一种可选择的治疗手段来治疗绿脓假单胞菌感染患者。一种尝试是通过经典的杂交瘤技术或噬菌体展示抗体库克隆来产生人单克隆抗体。这两种方法及由此产生的抗体均表现出一些严重的缺陷。经典的杂交瘤技术("Kohler和Milstein"方法)基于通过用选择的抗原主动免疫以及通过与骨髓瘤配体融合，从而产生具有所需特异性的鼠B细胞。之后，需要通过基因工程对产生抗体的克隆的基因信息进行人源化，并在合适的表达系统中产生抗体。同样，噬菌体展示抗体库克隆需要复杂的抗体基因工程，并要建立合适的表达系统。己知针对细菌LPS的鼠单克隆抗体能识别与人抗体不同的表位。因此，在小鼠体内产生单克隆抗体之后进行人源化并非必然分离到其特异性与人类应用相关的抗体。因此，IgM同种型抗体由于与IgM关联的效应器机制对于抗细菌免疫是最佳的，因而最为有效。但由于该分子复杂的五聚形式，迄今尚未实现IgM抗体的重组表达。因此，通过噬菌体展示技术分离的抗体的表达局限于IgM以外的同种型。作为另外的选择方案，在产生绿脓假单胞菌LPS部分的人单克隆抗体方面进行了不同的尝试。但是，或是产生所述抗体的方法没有优势(由于类淋巴母细胞的不稳定性)，或是抗体表现出非人糖基化方式，或是需要非常大量的抗体。而且，现有技术中描述的许多抗体缺乏效应器功能，从而不具保护性。
发明内容因此，本发明要解决的一个技术问题是提供一种对绿脓假单胞菌特定血清型的LPS特异的人单克隆抗体，其中该抗体表现出很高的保护能力，尤其是在体内。人单克隆抗体解决的技术问题如下定义。根据本发明，提供了对绿脓假单胞菌IATSOil血清型的LPS特异的称为lBOll的人单克隆抗体，其中该抗体轻链的可变区包括CDR1区中的SEQIDNO:1、CDR2区中的SEQIDNO:2和CDR3区中的SEQIDNO:3中的至少一个，并且其中该抗体重链的可变区包括CDR1区中的SEQIDNO:4、CDR2区中的SEQIDNO:5禾口CDR3区中的SEQIDNO:5中的至少一个；或者其能够结合所述LPS的片段或衍生物。本发明进一步提供能够产生单克隆抗体的杂交瘤和分别编码该抗体轻链和重链的核酸。而且，本发明提供包括该核酸的载体和宿主细胞。此外，提供了该单克隆抗体的生产方法。此外，提供了包括至少一种抗体和/或至少一种核酸的药物组合物及其第二医药用途。出人意料地，已经发现根据本发明的人单克隆抗体表现出很高的保护能力。特别是人单克隆抗体证实在体外是可调理吞噬作用的。更为重要的是，如实施例中所示，如通过在鼠烧伤模型中保护免受血流感染以及在小鼠急性肺感染模型中保护免受呼吸道感染确定，根据本发明的单克隆抗体表现出体内保护能力，。与Collins等人描述的人单克隆抗体(CollinsMS等人，1990.FEMSIM64:263-268)相比，本发明的人单克隆抗体在低得多的剂量下实现调理吞噬作用，并且保护能力更高。与现有技术中所描述的单克隆抗体相比(HarrisonFJJ等人，1997.Hybridoma16(5):413-420;ZweerinkHJ等人，1988.InfectionandImmunity56(8):1873-1879)，根据本发明的人单克隆抗体进一步从用结合疫苗主动免疫的健康个体的血液中产生。通常已知，由于缺乏T细胞的辅助，针对多糖的抗体质量非常低(即亲和性低，效应器能力很低)。仅通过使用结合疫苗，可以产生有价值的具有高活性、强效应器能力的针对多糖靶标的抗体。而且，与现有技术中所描述的单克隆抗体的产生速率相比(Zweerink等人，1988.InfectionandImmunity56(8):1873-1879)，根据本发明的人单克隆抗体的产生速率较高。现有技术中没有述及显示对绿脓假单胞菌所致肺感染有保护能力的人单克隆抗体。根据本发明，抗体对绿脓假单胞菌IATSOil血清型具有特异性，并在低至0.1ng/ml的浓度下表现出调理吞噬的活性，如使用荧光-细菌结合物进行测定。现有技术中没有报道在该低剂量下表现调理吞噬活性的抗体。根据本发明的单克隆抗体以很高的特异性识别临床分离株。使用该抗体识鉴别了18-20份感染IATSOil血清型绿脓假单胞菌的患者的标本。不拘泥于任何理论，推测单克隆抗体能够识别现有技术中已知的所有IATSOil绿脓假单胞菌株。这一特性使该抗体尤其适用于诊断和治疗。因此，根据本发明的抗体表现出难以超越的可靠性。本文所用的术语"人单克隆抗体"包括任何部分或完整的人单克隆抗体，不管单克隆抗体是从何来源获得的。优选通过杂交瘤产生人单克隆抗体。还可以通过基因工程得到单克隆抗体，尤其是通过将背景抗体的CDR区替换以权利要求中定义的特定CDR片段，将权利要求中定义的CDR片段CDR移植在市售的单克隆抗体上。术语"CDR区"是指抗体的互补性决定区，即决定抗体对特定抗原的特异性的区域。轻链和重链上的3个CDR区(CDR1-CDR3)均对抗原结合具有重要作用。CDR区在重链中的位置如下CDR1区vh外显子内的氨基酸31-35，CDR2区vh外显子内的氨基酸50-65，CDR3区vh外显子内的氨基酸95和随后的氨基酸。CDR区的位置不依赖于抗体类型，即IgG的IgM、IgA。CDR区在k轻链中的位置如下CDRA区Vx外显子内的氨基酸24-34，CDR2区Vx外显子内的氨基酸50-56，CDR3区Vx外显子内的氨基酸89和随后的氨基酸。CDR区在人轻链中的位置如下CDR1区VX外显子内的氨基酸24-34，CDR2区VX外显子内的氨基酸50-56，CDR3区V人外显子内的氨基酸89和随后的氨基酸。VH、禾BV人的氨基酸排列可以从Vbaseindex中得到(http:www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.phpmenu=901)。术语"血清型"是指绿脓假单胞菌的任何已知血清型。目前用于不同绿脓假单胞菌血清型的不同名称的索引表显示于说明书中的表I中。术语"片段"是指任何能够结合LPS血清型的抗体片段。片段长度至少为IO个氨基酸，优选20个，更优选50个。优选片段包括抗体的结合区。优选片段为Fab或F(ab')2片段或其混合物。术语"衍生物"包括通过至少添加、缺失、和/或置换至少一个氨基酸改变的人单克隆抗体的任何突变蛋白。优选地，衍生物为如下的人单克隆抗体突变蛋白其中突变蛋白在重链和/或轻链中的任意CDR中携带至少一个保守置换，如权利要求所示。更优选，突变蛋白具有不多于5个保守置换，特别优选不多于2个保守置换。抗体片段或衍生物结合特定LPS血清型的能力通过直接ELISA测定，如材料和方法章节中所描述将特定LPS固定在ELISA板的固相上。将抗体片段或抗体衍生物与固化的LPS—起孵育，结合的抗体或其衍生物通过合适的酶联二抗进行显像。根据本发明，术语"保守置换"是指将属于特定物化类别的一个氨基酸替换成属于相同物化类别的氨基酸。物化类别定义如下非极性氨基酸类别包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。具有不带电极性侧链的氨基酸类别包括天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸和胱氨酸。具有带正电极性侧链的氨基酸物化类别包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。具有带负电极性侧链的氨基酸物化类别包括天冬氨酸和谷氨酸，也称为天冬氨酸盐和谷氨酸盐。根据本发明，提供了上文概述的对绿脓假单胞菌IATSOll血清型的LPS特异的抗体。根据本发明的另一实施方案，提供了对绿脓假单胞菌IATSOll血清型的LPS特异的人单克隆抗体，其中该抗体轻链的可变区具有氨基酸序列SEQIDNO:7，重链可变区具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或者能够结合所述LPS的所述抗体的变体，其中该抗体轻链氨基酸序列的可变区与SEQIDNO:7的同源性至少为85%,并且抗体重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:8的同源性至少为85%。本领域技术人员已知的术语"同源性"是指两种或多种多肽分子之间的关联程度，其通过序列之间的一致性来确定。从两个或多个序列中同源区的百分比来发现"同源性"百分比，并考虑空隙或其它序列特征。互相关联的多肽的同源性可以通过己知方法测定。通常，使用特殊的计算机程序，其具有考虑到特殊要求的算法。优选地，测定同源性的步骤首先在所考察的序列之间产生最大的一致性。测定两段序列之间的同源性的计算机程序包括，但不限于，GCG程序包，其包括GAP(DevereuxJ等人，NucleicAcidsResearch]2(12):387(1984);GeneticsComputerGroupUniversityofWisconsin,Madison(WI);BLASTP,BLASTN和FASTA(AtschulS等人，J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。BLASTX禾呈序可以获自NationalCentreforBiotechnologyInformation(NCBI)和其它来源(BLASTHandbook,AltschulS等人，NCBNLMNIHBethesdaMD20894;AltschulS等人，J.Mol.215:403-410(1990))。还可以使用公知的SmithWaterman算法来测定同源性。序列比较的优选参数包括以下算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453比较矩阵BLOSUM62，出自Henikoff&Henikoff,PNASUSA89(1992),10915-10919空隙罚分12空隙长度罚分2GAP程序也适于使用上述参数。上述参数是氨基酸序列比较的标准参数(缺省参数)，其中末端处的空隙不会降低同源性的数值。与参比序列对比的序列非常小时，需要进一步将预期值增加至100,000，在某些情况下是将字长(字节长度)降低至2。可以使用其它模型算法、空隙开放罚分、空隙延伸罚分和比较矩阵，其包括1997年9月的ProgramHandbook,WisconsinPackage,第9版中所命名的那些。选择将取决于将要进行的对比，并进一步取决于对比是否在序列对之间进行，这时优选GAP或BestFit,还是在一个序列和大的序列数据库之间进行，这时优选FASTA或BLAST。上述算法测得一致性为85%则被称作同源性85%。更高程度的同源性同样适用。在优选的实施方案中，根据本发明的突变蛋白的同源性为85%或更高，例如，高于90%或95%。进一步优选根据本发明的人抗克隆抗体的轻链是k型或X型的。特别优选地，轻链是k型的。轻链可以是天然存在的链包括(天然重排的)、基因修饰或合成型的轻链。如果根据本发明的对IATSOll特异的抗体是k型的，则优选轻链源自种系DPK18(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIG画ENTS.phpmenu=901#VKEX)。根据另一个优选实施方案，本发明的人单克隆抗体的重链选自所有的人同种型，即IgM、IgA或IgG。优选地，重链为IgM型。如果抗体是IgM型的，则其表现出对绿脓假单胞菌LPS亲和力高，与补体有效结合，从而介导直接杀灭细菌和/或有效地调理细菌被吞噬的有利特性。而且，IgM能耐受绿脓假单胞菌弹性蛋白酶的蛋白溶解降解作用，而其它同种型如IgG或IgA则可以被降解。IgM抗体在很小的量下即有效。在鼠烧伤创面脓毒症模型中l-4ng/鼠是完全有保护性的。优选可变重链源自种系DP-53(http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.phpmenu=901#VKEX)。轻链和重链可以共价连接成单链抗体(例如二价scFv、双功能scFv和双特异性scFv)，或者彼此非共价连接。根据本发明的优选实施方案，人单克隆抗体完全由人氨基酸序列组成。"完全由人氨基酸序列组成"是指人单克隆抗体的氨基酸序列源自人生殖种系。这可以通过不同方式来实现。例如，由人氨基酸序列组成的人单克隆抗体可以通过杂交瘤获得，其中B-细胞是人B-细胞。可选的方案是，人单克隆抗体可以通过将如权利要求所示的CDR区CDR移植到市售的人单克隆抗体上获得，从而产生根据本发明的对绿脓假单胞菌LPS血清型特异的人单克隆抗体。人单克隆抗体完全是人氨基酸序列避免了有害副作用如排斥反应或过敏性休克的发生。进一步优选地，人单克隆抗体表现为基本上识别人抗原。"基本上识别人抗原"是指根据本发明的人单克隆抗体的抗原识别基本上等同于人类健康个体的抗原识别。具体来说，这要求人单克隆抗体轻链和重链的Fc部分是人型的，以保证与人免疫系统的相互作用，并降低产生所谓HAMA(人抗鼠抗体)的风险。根据另一个优选实施方案，本发明的人单克隆抗体是从人B-细胞或者将所述人B-细胞与骨髓瘤或杂合骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤获得的。人B-细胞可以通过如下方法得到将健康个体或患者进行免疫，随后抽取血液标本中，从中可通过已知方式分离B-细胞(CurrentProtocolsinImmunology.Chapter7.1.Isolationofwholemononuclearcellsfromperipheralbloodandcordblood.Wiley&sons出版，JCColigan等人编著)。通过根据经典Kohler和Milstein方法的已知技术，可以将人B-细胞与骨髓瘤或杂合骨髓瘤(heteromyeloma)融合，产生杂交瘤。合适的骨髓瘤是P3X63的衍生物如P3X53Ag8.653(ATCCCRL-1580)或SP2/0(ATCCCRL-1646)。生成的杂交瘤可以根据已知方法进行选择。将杂交瘤在合适的培养基中进行培养，从上清液中回收产生的抗体。而且，本发明提供了分别编码本发明的人单克隆抗体的轻链和重链的核酸。核酸可以是源自种系或者B-细胞中发生重排的天然核酸。可选的方案是，核酸可以是合成的。合成核酸还包括具有修饰的核苷酸间连接(包括硫代磷酸酯)以增加核酸对降解的耐受性的核酸。核酸可以通过基因工程产生，或者完全通过核苷酸合成来人工制成。本发明进一步提供如下载体其包括至少一种编码本发明人单克隆抗体轻链的核酸和/或至少一种编码本发明人单克隆抗体重链的核酸。核酸可以存在于同一载体中，或者可以双元载体的形式存在。载体优选地包括与核酸可操作地连接以促进编码轻链和/或重链的核酸表达的启动子。优选地，载体还包括用于在宿主细胞内复制和维持的起始点。载体也可包括位于编码轻链和/或重链的核酸5'的编码信号序列的核苷酸序列。信号序列可以促进所编码的链分泌至培养基中。优选地，载体源自腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、SV40病毒、逆转录病毒、植物病毒或细菌噬菌体例如、衍生物或M13。特别优选的载体是含有人Ig重链和人轻链的恒定区的载体，例如Persic等人描述的用于免疫球蛋白真核表达的联合载体系统(Persic等人，1997.Gene.187(1):9-18)。载体可以进一步包括编码His-标记的核苷酸序列，从而表达一种构建物以产生特定的融合产物，该融合产物在人单克隆抗体轻链和/或重链的N端处具有His-标记，这有助于在镍柱上通过螯合物的形成来纯化蛋白质。而且，本发明提供了包括载体和/或适合于表达该载体的核酸的宿主细胞。本领域中已知有许多种原核和真核表达系统，其中优选真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，例如HEK293-细胞、PerC6-细胞、CHO-细胞、COS-细胞或HELA-细胞及其衍生物。特别优选人生产细胞系。优选转染的宿主细胞将产生的抗体分泌至培养基中。如果实现了细胞内表达，则根据标准方法进行复性，所述方法例如BenettiPH等人，ProteinExprPurifAug;13:283-290,(1998)。本发明还提供了产生人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，通过培养上述的杂交瘤产生人单克隆抗体。产生的单克隆抗体分泌到上清液中，并通过采用传统色谱技术从其中纯化。可选的方案是，人单克隆抗体由包括根据本发明的载体的宿主细胞产生，并将宿主细胞在适合于编码的抗体链的重组表达的条件下培养。优选地，宿主细胞包括至少一种编码轻链的核酸和至少一种编码重链的核酸，并且能够组装人单克隆抗体，使得产生的三维结构与人-B细胞产生的人单克隆抗体的三维结构相同。如果轻链独立于重链产生，则可以纯化两条链，随后将其组装，产生基本上具有人B-细胞所产生的人单克隆抗体的三维结构的人单克隆抗体。人单克隆抗体也可通过所编码轻链和/或重链的重组表达获得，其中通过以已知方式分离编码人单克隆抗体的核酸，将编码权利要求中定义的CDR的核酸序列移植在分离的核酸上，从而产生核酸。根据另一个优选的实施方案，根据本发明的人单克隆抗体是被修饰的。修饰包括单体形式的二聚、低聚或聚合，例如，通过使用二环己基碳化二亚胺进行交联。由此产生的二聚体、低聚体或聚合物可以通过凝胶过滤彼此分离。进一步修饰包括侧键修饰，例如，s-氨基-赖氨酸残基的修饰，或者氨基和羧基端的分别修饰。进一步修饰包括翻译后修饰，例如，蛋白的糖基化和/或部分或全部去糖基化，以及二硫键的形成。抗体也可与标记物如酶标记、荧光标记或放射性同位素标记相结合。本发明进一步提供了包括至少一种人单克隆抗体和/或至少一种编码人单克隆抗体轻链和/或重链的核酸的药物组合物。药物组合物可以进一步包括本领域已知的制药学可接受的成分。优选地，药物组合物用于治疗绿脓假单胞菌感染引起的疾病，例如血流感染、肺炎、慢性支气管炎、局部感染，其包括创口感染和关节侵袭性感染，主要见于免疫受损患者和/或呼吸功能受损的患者。药物组合物进一步用于，但不限于，预防和/或治疗医院内获得性(医院内)感染。由于绿脓假单胞菌感染的主要受害者是囊性纤维化患者、烧伤受害者、插管患者、手术室和/或重症监护室中的患者、癌症和AIDS患者、免疫受损的患者、免疫抑制的患者、糖尿病患者，以及静脉内药物滥用者，药物组合物尤其适用于预防和/或治疗所述类型患者中绿脓假单胞菌所致的疾病。药物组合物可以进一步包括抗生素药物，优选与新的单克隆抗体抄厶知口o药物组合物包括浓度范围为0.1-30mg/kg体重的新的单克隆抗体。药物组合物可以通过任何已知方式给药，例如经静脉内、肌肉内、真皮内、皮下、腹膜内、局部、鼻内给药，或者吸入喷雾给药。本发明还提供用于诊断绿脓假单胞菌感染的检测试剂盒，其包括至少一种本发明的人单克隆抗体，任选进一步包括甩于进行诊断检测的合适成分。检测试剂盒适用于绿脓假单胞菌感染的特异性可靠诊断。测定试验可以基于液相或膜结合形式的传统ELISA试验。如本领域所知，检测可以是直接或间接的，其中抗体任选地结合有酶标记、荧光标记或放射性同位素标记。以下实施例对本发明进行说明，但并非要限制本发明的范闺。当阅读说明书并参考公知常识时，其它实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。图1涉及lBOll重链可变区的DNA和氨基酸序列。图2涉及lBOllk轻链可变区的DNA和氨基酸序列。图3a涉及单克隆抗体lBOll对IATSOil血清型的临床绿脓假单胞菌分离株的识别图谱。图3b涉及单克隆抗体lBOll对其它血清型的临床绿脓假单胞菌分离物的识别图谱，与对所述其它血清型特异的单克隆抗体进行比较。与lBOll的结合通过全细胞ELISA检测。图4涉及单克隆抗体lBOll针对绿脓假单胞菌IATSOil血清型的调理吞噬活性。图5涉及单克隆抗体lBOll在小鼠中的药代动力学。lBOll的体内保护能力在鼠烧伤创面脓毒症模型中进行验证。将不同剂量的lBOll通过腹腔注射或静脉注射给予NMRI小鼠。显示了免疫激发3天后的生存率。图6涉及单克隆抗体lBOll在小鼠中的药代动力学。肺感染之后lBOll介导从肺和脾中清除绿脓假单胞菌的能力在小鼠急性肺感染模型中进行验证。在使用绿脓假单胞菌进行肺感染之前将lBOll经静脉注射给药。感染之后的6、12、24和48小时，检验肺和脾中的荷菌量。图7涉及单克隆抗体lBOll的补体活化。图中显示了体外试验的结果，该试验测定了将1B011与人正常血清混合时的补体成分C4d的生成情况。产生的C4d通过ELISA进行检测。检测两种不同的血清浓度100吗/mg和10吗/ml的两批lBOll。单独为血清的对照物记为0[ig/ml。具体实施方式材料和方法实施例中使用如下材料和方法。测定细胞上清液中的LPS-特异性和对IgM定量为了对细胞培养物上清液中的抗体进行筛选和分析，如他处所述进行ELISA(Cryz，S.J.等人，1987.J.Clin.Invest.80(1):51-56)，并加以一些变化。简言之，制备绿脓假单胞菌脂多糖(自制)LPS储存液，其浓度为在2mg/ml(在36mM三乙胺中)。为进行涂层，将溶液在含有0.02X叠氮化钠(PBS-Az)的PBS中稀释至10jig/ml。通过将该溶液与等体积IO吗/ml甲基化人血清白蛋白(HSA;如下自制将2g冻干的HSA溶解在200ml无水甲醇中。加入1.68ml37.%HC1后，将溶液在室温下在暗处、间或振荡的条件下存储至少3天。通过10min离心(4500rpm，GS1转子)收集沉淀物，通过将沉淀团悬浮在溶剂中，将其用无水甲醇洗涤两次，用无水乙醚洗涤两次。将沉淀在干燥器中干燥2小时，干燥的沉淀团悬浮在H20中，以等份形式存储于-20"C下。蛋白浓縮物为8.05mg/ml)在PBS-Az中混合，在室温下轻轻搅拌5分钟。将NUNC⑧ELISA板涂以100pl/孔LPS-HSA溶液，在室温下过夜。将板用300pipH7.4的含有0.05%Tween20(#93773;FlukaChemieAQSwitzerland)的PBS(PBS-T)(自制)洗涤3次之后，将细胞培养上清液在PBS中k2稀释，在37'C下孵育2小时。将板用PBS-T洗涤3次之后，用含有5%(v/v)FCS的在PBS中1:2000稀释的辣根过氧化物酶-交眹的羊抗人IgM抗体(#074-1003;KPL;Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.Gaithersburg，MD)来检测结合的抗体。将板在37°C下孵育1小时，用PBS-T洗涤3次。通过以100^/孔加入含有0.0012%(V/V)11202底物溶液的OPD(在24mM柠檬酸和52mM磷酸氢二钠中的0.4mg/ml邻苯二胺)，对抗体的结合进行显色。2-3分钟后以50pi/孔加入1MHC1来终止显色反应。使用SoftmaxPro⑧软件在ELISA读数器上读取490nm下的光密度。为了对细胞培养物上清液中的IgM进行定量，将ELISA板涂以1[ig/ml未交联羊抗人IgM抗体/PBS，在4。C下过夜。将板用PBS-T洗涤3次，将细胞上清液和标准品以2倍稀释液进，孵育。使用起始浓度为0.5吗/ml的标准人血清(Behring)作为标准品。所有稀释液均使用PBS-T来完成。将板在振动台上在室温下孵育2小时。将板用PBS-T洗涤3次后，用在含有5%(Wv)FCS的PBS中以1:2000稀释的辣根过氧化物酶-交联的羊抗人IgM抗体(KPL)检测结合的抗体。将板在振动台上在室温下孵育1小时，用PBS-T洗涤3次。以150pl/孔加入OPD底物溶液，对抗体、的结合进行显色。1分钟后以50nl/孔加入1MHC1终止显色反应。使用SoftmaxPro⑧软件在ELISA读数器上读取490nm下的光密度。序列分析使用获自Qiagen的RNeasy-试剂盒分离杂交瘤钾胞的RNA。通过SMART技术(BectonDickenson)合成cDNA。对于第二条链的PCR，使用如下引物(表III):(1)IgM反向恒定区(con:5，陽GCCACGCTGCTCGTATCCGACG-3，(SEQIDNO:11);(2)k反向恒定区(conk):5，-AGCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCC画3，(SEQIDNO:12)。正向引物包括在SMART-试剂盒中。为进行测序，使用以下引物(3)IgM序列(n序列)5,-GCTGCTCGTATCCGACGG-3，(SEQIDNO:13)和(4)Kappa序列(k序列):5,-CACAACAGAQGCAGTTCC-3,(SEQIDNO:14)。测序在MicrosynthAG(Balgach,Switzerland)上进斗亍，并4吏用V-BaseDNAplot软件(http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/DNAPLOT.phpmenu=901)将序列与现有种系的序列进行比较。表I绿脓假单胞菌IATS血清型参考菌株IATS血清型说明01PA53(IT4)02E576(IT3)036510(Habs3)046511(Habs4)06PA220(IT1)07Fisher6(IT6)O10Fisher5(IT5)011Fisher2(IT2)016Fisher7(IT7)表II绿脓假单胞菌IATSOil血清型的临床分离株分离株编号分离株来源2309.36尿2309.38耳2309.58血2309.60尿2309.61尿2309.65气管分泌物2310.49尿2310.55血2311.58气管分泌物2312.25气管分泌物V02610胆囊VA1014耳VA26939月巿(BAL)VA28/1创面VA2813创面VA3348月市(BAL)VA3805眼VA4156/1创面VA695创面VA843气管分泌物FT-2参考菌株全细胞ELISA将来自不同临床分离株(见表II)的细菌在Luria肉汤培养基中在37X:下培养至600nm下的光密度为1，并用37%福尔马林(福尔马林最终浓度0.5X)在37i:下固定过夜。将固定的细菌以PBS1:50稀释，并在ELISA板上固定化。将板用含有5%(v/v)胎牛血清封闭后，将单克隆抗体lBOll与固定的细菌一起在37"C下孵育2小时。可选的方案是，对其它血清型的分离株进行上述培养，并与单克隆抗体lBOll孵育，或者与对各个血清型特异的单克隆抗体孵育(图3b，血清型特异的阳性对照单克隆抗体，统称为"阳性对照")作为阳性对照。将板用PBS-T洗涤3次以后，用在含有5%(v/v)FCS的PBS中1:2000稀释的辣根过氧化物酶-交联的羊抗人IgM抗体(#074-1003;KPL;Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.Gaithersburg,MD)来检观!j结合的抗体。将板在37t:下孵育1小时，用PBS-T洗涤3次。通过以100/孔加入含有0.0012%(V/V)H202底物溶液的OPD(在24mM柠檬酸和52mM磷酸氢二钠中的0.4mg/ml邻苯二胺)，对抗体的结合进行显色。2-3分钟后以50^/孔加入1MHC1来终止显色反应。使用SoftmaxPro⑧软件在ELISA读数器上读取490nm下的光密度。调理吞噬作用测定为了测定生物活性，对单克隆抗体IBOII的调理吞噬活性进行检测。为此目的，将根据表I的绿脓假单胞菌IATSOll血清型在TSBG(30g/l含有l。/。(w/v)葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤)培养基中培养过夜。将细菌用冷PBS洗涤两次之后，将细菌沉淀团重新悬浮在5m10.1M的碳酸氢盐缓冲液中，加入pH8.0的50[il5-沐-6)-羧酸荧光素、琥珀酰亚胺基酯(5(6)-FAM,SE;MolecularProbes,Eugene,OR;二甲亚砜中10mg/ml)，在37'C下孵育1小时。加入100|il37%福尔马林将细菌固定，在37t:下孵育过夜。为去除未结合的染料，通过将在20ml冷无菌PBS中的再悬浮液离心，将细菌洗涤6次。将标记的细菌在4"C下储存备用。为进行检测，将等份细菌稀释至550nm下的光密度为1，然后以HBSS-BSA(含有0.1BSA的Hanks平衡盐溶液)进行1:50稀释。将20细菌分别与10jal含有单克隆抗体lBOll的杂交瘤细胞培养物上清液的不同稀释液，或与非特异性单克隆对照抗体混合。在37。C下孵育30分钟后，加入10pl仔兔血清(CharlesRiverLaboratories,Germany)作为补体源，将探针在37。C下继续孵育30分钟。向受调理的细胞中加入40pi分化的HL-60细胞(通过将细胞在添加了10%(v/v)胎牛血清和100mM二甲基甲酰胺的IscovesModifiedDulbecco，s培养基(IMDM;Sigma)中孵育，前髓细胞细胞系HL-60分化成粒细胞)，得到的最终浓度为1.25乂106细胞/匕在振荡器上在37。C下孵育90分钟后，转移至2ml细胞冲洗缓冲液(含有0.02%(v/v)叠氮化物的PBS;BectonDickenson)收获细胞。在250xg下离心5分钟之后，将细胞沉淀团重新悬浮在150pl细胞冲洗缓冲液中，通过流式细胞术进行分析。通过与背景染色对比分析HL-60细胞的绿色荧光来检测阳性的调理吞噬活性。通过将荧光素结合的细菌在存在补体的条件下与HL-60细胞孵育，测定背景染色。感染绿脓假单胞菌的小鼠的体内保护小鼠烧伤创面模型1B011的体内保护能力在鼠烧伤创面脓毒症模型中进行测定。NMRI-小鼠(18-20g;CharlesRiverLaboratories)在免疫激发之前的4小时静脉内接受0.16-10(ig(对应于大约0.4-0.006mg/kg体重)体积为0.1ml的单克隆抗体lBOll。作为对照，注射O.lml非特异性抗体上清液。为进行免疫激发，将每组IO只的雌鼠用1大气压的3-氯-1,1，2-三氟乙基-二氟甲基醚(Ethrane,AbbottLab.,Chicago,IL)麻醉。对小鼠背部2cm2的部位进行10秒乙醇灼烧。将悬浮在0.5mlPBS中的激发生物体(绿脓假单胞菌IATSOll;临床分离株2310.55，见表2)以2xl07cfu/鼠立刻皮下注射到烧伤部位中。对动物观察7天。作为保护作用的指标，显示了免疫激发3天后的生存率。急性肺感染模型为了评价lBOll针对绿脓假单胞菌感染的保护能力，使用急性肺感染模型。将10吗(0.4mg/kg)1B011静脉下注射给BALB/c小鼠。之后，在深度麻醉下使用弯的珠头针(bead-tippedneedle)将40pl4.0xl()7/ml菌株2310.55(表2)的溶液(对应于1.6乂106/鼠)经气管内应用于左下支气管。选取该剂量是由于其仅引起很低的死亡率。在6、12、24和48小时之后，将小鼠处死，在无菌条件下摘除肺和脾。将器官悬浮在3mlPBS中，用搅拌器在冰上匀浆45秒。将连续稀释的组织匀浆(0.1ml)在ModifiedConradiDrigalski's琼脂上点板，测定CFU/肺或CFU/脾。测定单克隆抗体活化的经典补体途径为了测定下游进程中形成的IgM-聚集体最终自行触发的经典补体途径，将预定浓度的1B011抗体在37'C下在来自健康捐赠者的血清中孵育30分钟。然后在10mMEDTA中终止反应，补体活化片段C4d通过市售的ELISA(QuidelCorp,SanDiego)进行检测。作为阳性对照，使用由1B011抗体及其同族LPS抗原组成的IgM-抗原复合物。实施例实施例l:lBOll的DNA和氨基酸序列抗体特异性分别通过DNA-和氨基酸序列测定。测定重链和轻链的可变片段的DNA序列。简言之，分离杂交瘤细胞的总RNA，并用SMART技术(BectonDickinson)将其逆转录到完整的cDNA中。通过该方法，在cDNA的5'端加上通用引物。使用该引物和表III中所述的Ck和Cp-特异性引物，通过PCR对IgM和k可变区和部分恒定区进行扩增。然后通过从琼脂凝胶中切除，获得PCR片段，作为用表m所述引物测序的模板。表III<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>随后将可变区的序列与VbaseIndex比较。与种系序列比较的结果表示为"置换和沉默"突变数(R:S)，如表IV所示。DNA序列和氨基酸序列描绘于图l和图2。表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例2:单克隆抗体lBOll对绿脓假单胞菌IATSOil血清型临床分离株的识别通过将健康志愿者用八价OPS-ToxinA疫苗免疫，产生lBOll。疫苗含有IATSOil参考株FT-2。为了研究针对该菌株LPS产生的lBOll是否也会识别IATSOil血清型的其它分离株，从不同医院中收集了大量的临床分离株(见表2)。所有分离株的血清型使用市售的血清型凝集试剂盒测定。通过PCR确认血清型。然后通过全细胞ELISA对IATSOil血清型(图3a)以及其它血清型(图3b)的不同临床分离株进行IBOII结合试验。除由于这些分离株表面上LPS的低表达产生的两个弱反应之外，]BOll与所有被检测的IATSOil分离株均呈强烈反应。而且，只有在IATSOil血清型中观察到结合，在Ol、02、03、06或O10血清型的多种分离株中均没有发生结合。使用针对各个血清型的其它单克隆抗体作为阳性对照，以确保这些分离株的完整性。实施例3:lBOll的体外活性调理吞噬活性使用基于流式细胞术的调理吞噬作用测定评价lBOll的体外生物学活性。将FITC-结合的绿脓假单胞菌IATSOil血清型与连续稀释的lBOll在正常家兔血清作为补体源的情况下孵育。经调理的细胞与分化的HL-60细胞孵育(前髓细胞系，ATCC:CCL-240;加入0.1M二甲基甲酰胺，3天完成向单核细胞的分化)。通过FACS分析调理吞噬作用。通过与背景染色(在不存在血清但存在补体的情况下HL-60细胞和FITC-结合细胞的染色)对比分析HL-60细胞的绿色荧光来测定阳性调理吞噬活性。结果示于表4。1B011介导的绿脓假单胞菌IATSOil血清型的吞噬作用是剂量依赖方式的(实心圆圈)。如果使用热灭活的补体，则观察不到吞噬作用(空心圆圈)。1B011的调理吞噬活性(OA5())定义为导致FITC-阳性HL-60细胞的半数最大百分比的浓度，其为O.lng/ml。如此低剂量下的活性表明lBOll的效应器能力很高。实施例4:单克隆抗体lBOll的体内保护能力lBOll的体内保护能力在鼠烧伤创面脓毒症模型中进行验证。将不同剂量的lBOll腹腔或静脉内给予NMRI小鼠。3小时后，造成2x2cm的烧伤创面，在烧伤的皮肤部位皮下注射2x107CFU绿脓假单胞菌菌株2310.55(011)。整个实验过程中小鼠施以麻醉。监控生存情况每天3次。免疫激发后3天的生存率显示于图5。包括了来自4项独立实验(标记为A-D)的综合数据。剂量>0.2mg/kg体重对70-100%的假单胞菌全身激发产生了保护作用。给药剂量减少导致生存率降低。死亡是假单胞菌感染的直接结果，因为有烧伤创面但未感染假单胞菌的小鼠生存率为100%。这些数据证明了lBOll在体内针对绿脓假单胞菌全身感染的功效。实施例5:急性呼吸系统激发之后细菌从肺和脾的清除增加为了评价lBOll是否能够清楚呼吸系统的绿脓杆菌感染，使用小鼠急性肺感染模型。为此目的，在用绿脓假单胞菌株2310.55进行气管内肺激发之前，静脉内给予lBOll(0.4mg/kg体重)。选取该激发剂量仅是为了达到最小的死亡率。之后，选择细菌从肺中的清除率作为评价参数。应用lBOll能够迅速地将绿脓假单胞菌从肺中清除(图6)。这一发现是出人意料的，因为IgM抗体一般不会渗透入肺组织中。48小时后细菌被完全清除，而这时在未经处理的动物中感染仍在迸行。与人绿脓假单胞菌肺炎的进程类似，细菌感染可发展成为全身性的，在该实验中反映为脾中出现绿脓假单胞菌。全身感染的完全消退由1B011介导的，而未经处理的小鼠中仍存在细菌(图6)。这些结果说明了lBOll具有治疗呼吸系统绿脓假单胞菌感染如医院性肺炎的能力。实施例6:单克隆抗体IBOII对人的组织的交叉反应性为了排除不希望发生的1B011与人组织的非特异性结合，根据"FDAPointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse(FDA对用于人的单克隆抗体产品的制造和检测的观点)(1997)"和"TheRulesGoverningMedicinalProductsintheEuropeanCommunity(欧盟医药产品管理条例)Vol.3a(1994)"对IBOII进行交叉反应性检测。所用的组织列于下表。组织均获自3名不相关的捐赠者，以尽量减小捐赠者的特殊因素对抗体结合的影响。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>内膜)*仅有来自一名捐赠者的组织可用没有观察到与这些组织中任一个的交叉反应性(数据未显示)。基于这些结果，似乎不会在体内发生非特异性结合，因此引起的炎性副作用很小。实施例7:单克隆抗体lBOll的补体活化体内给予的人抗体可以通过补体的自发活化引起不良反应。这种经典补体途径的活化可以通过体外试验来检测，该体外试验测定当lBOll与人正常血清混合时补体成分C4d的生成情况并通过市售的EUSA(QuidelCorp.，SanDiego)来检测C4d。在GMP条件下产生两批次1B011(称为"第1批"和"第2批")，以在血清中的不同浓度(100pg/ml和10pg/ml)来进行检验。单独血清的对照物记为0jug/ml。结果显示于图7。在血清中1B011没有触发C4d的自发生成(白色条)，而在存在10pg/ml绿脓假单胞菌IATS011血清型LPS的情况下产生了水平很高的C4d(黑色条)。这些结果表明，当用于人时，lBOll表现的自发性炎性副作用的程度将是最小的。权利要求1.一种对绿脓假单胞菌LPSIATSO11血清型的脂多糖(LPS)特异的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链可变区具有氨基酸序列SEQIDNO7，重链的可变区具有氨基酸序列SEQIDNO8；或者能够结合所述LPS的所述抗体的变体，其中所述抗体轻链的可变区的氨基酸序列与SEQIDNO7的同源性至少为85％，并且所述抗体重链的可变区的氨基酸序列与SEQIDNO8的同源性至少为85％。2.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，其中所述的轻链是K型的。3.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，其中所述的轻链是人型的。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的人单克隆抗体，其中所述的重链是IgM、IgA或IgG型的。5.根据权利要求4所述的人单克隆抗体，其中所述的重链是IgM型的。6.根据权利要求1-4中任意一项所述的人单克隆抗体，其中所述的抗体完全由人氨基酸序列组成。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体表现为基本上是识别人抗原的。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的人单克隆抗体，其中所述抗体是N-端、内部、和/或C-端修饰的。9.根据权利要求8所述的人单克隆抗体，其中所述修饰选自低聚、和与药物和/或标记物结合中的至少一种。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的人单克隆抗体，其是从人B-细胞、或者是所述人B-细胞与骨髓瘤或杂合骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤获得的。11.一种杂交瘤，其能够产生根据权利要求1-7或10中任意一项所述的人单克隆抗体。12.—种核酸，其编码根据权利要求1-7或10中任意一项所述的人单克隆抗体的轻链。13.—种核酸，其编码根据权利要求1-7或10中任意一项所述的人单克隆抗体的重链。14.一种载体，其包括至少一种编码权利要求12所述轻链的核酸和/或至少一种编码权利要求13所述重链的核酸。15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体还包括与所述核酸可操作连接以促进其表达的启动子。16.—种宿主细胞，其包括权利要求14所述的载体和/或权利要求12或13所述的核酸。17.—种产生权利要求1-7或10中任意一项所述的人单克隆抗体的方法，其包括将权利要求11所述的杂交瘤在使其分泌抗体的条件下培养，或者将权利要求16所述的宿主细胞在适合其表达人单克隆抗体的条件下培养，和任选地包括从培养物上清液中纯化所述的抗体。18.—种药物组合物，其包括至少一种权利要求1-10中任意一项所述的人单克隆抗体和/或至少一种权利要求12或13所述的核酸，和任选地包括制药学可接受的成分。19.权利要求1-10中任意一项所述的人单克隆抗体和/或权利要求12或13所述的核酸在预防和/或治疗人患者绿脓假单胞菌感染中的用途。20.根据权利要求19所述的用途，其中所述的绿脓假单胞菌感染是医院内获得性感染。21.—种用于诊断标本中绿脓假单胞菌感染的试验试剂盒，其包括至少一种权利要求1-10中任意一项所述的人单克隆抗体和/或至少一种权利要求12或13所述的核酸，并任选地进一步包括进行诊断试验的合适成分。全文摘要本发明涉及一种对绿脓假单胞菌IATSO11血清型特异的人单克隆抗体、产生其的杂交瘤、其编码核酸、以及用其转染的宿主细胞。而且，本发明涉及产生所述单克隆抗体的方法。此外，本发明涉及包括至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。文档编号C12N15/79GK101120018SQ200680004847公开日2008年2月6日申请日期2006年2月13日优先权日2005年2月14日发明者A·B·朗,A·齐歇尔,M·A·英博登,M·P·霍恩申请人:肯塔生物技术有限公司