绳状青霉菌的abfB-2基因的制作方法

专利名称：：绳状青霉菌的abfB-2基因的制作方法绳状青霉菌的abffi-2基因本发明涉及自绳状青霉菌(Penicilliumfuniculosum)分离的abffi-2基因及由该基因编码的具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB-2多肽。绳状青霉菌为踝节菌属(Talaromyces),属于Aspergilleae科。该微生物从许多易受空气或水污染的有机基质中分离，表明该真菌具有含量丰富的水解酶。这种酶混合物在动物饲料中的使用有助于解聚天然有机物，且可能改善其可消化性。因此W099/57325描述了称为IMI378536的产生酶混合物的绳状青霉菌林，这些酶特别适用作动物祠料。然而，绳状青霉菌产生的酶混合物尚未作重要的生化定性。的确，对获得的发酵液通常仅测得有限量的酶活性，如木聚糖酶和p-葡聚糖酶。这些活性仅反映了混合物中的一部分酶类。农业上的半分解纤维素化合物构成了继植物组织纤维素之后的第二大多糖储备物。该类特征是具有多种多样的杂多糖，主要代表有木聚糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和甘露聚糖。糠醛形式的阿拉伯糖广泛存在于杂多糖，如阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖中。阿拉伯聚糖为聚合物，以a-l-5键与阿拉伯呋喃糖残基相连接，可在0-2或0-3位被1或2个阿拉伯糖残基取代。至于阿拉伯木聚糖，a-L-阿拉伯呋喃糖残基通过a-l-3和oc-l-2键与主要的(3-l-4-吡喃木糖链连接。在这些侧链上阿拉伯糖残基的存在可限制许多工业应用(如增强动物饲料可消化性)中的半分解纤维素化合物的酶水解作用。裂解a-L-阿拉伯呋喃糖苷键的酶可与木聚糖酶协作，以允许阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖的水解。因此，阿拉伯糖酶活性(内切，外切阿拉伯糖酶以及,主要是a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性)可积极协同木聚糖酶有助于半分解纤维素化合物的解聚。半分解纤维素化合物和果胶化合物可代表植物中高达50%的总糖，它们构成动物的主要能源。这些化合物可消化性的增强与半分解纤维素化合物中阿拉伯糖残基取代程度的降低有关(Brice，R.E.，Morrison,I.M.1982,Carbohydr.Res.101:93-100)。水解L-阿拉伯糖残基之间键的酶已自微生物如细菌或丝状真菌中分离。阿拉伯糖苷酶主要由oc-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)组成，该酶能水解来自L-阿拉伯木聚糖或(如阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖的)化合物的非还原性的a-L-阿拉伯呋喃糖残基。根据它们的蛋白质序列相似性，已将a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)分为两个糖苷水解酶的家族(GH51和GH54)。这两个家族因其对包含于多糖中底物的特异性而不同。第一族(GH51)包含A型阿拉伯呋喃糖酶，该酶仅对a-l-5连接的小线性结构阿拉伯吹喃低聚糖起作用。第二族由B型阿拉伯呋喃糖酶(GH54)组成，该酶催化阿拉伯吹喃低聚糖化合物侧链的ot-l,5、a画l,3和a陽1,2键的水解。已自许多细菌及丝状真菌中将B型阿拉伯呋喃糖酶(ABFB)分离。曲霉属(Aspergillus)最具代表性，但也已将它们自木霉属(Trichoderma),青霉菌属(Penicillium)和镰孢菌属(Fusarium)中分离。WO96/29416、WO96/06935和US5,989,887描述黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖酶基因。Gielkensetal.(Microbiology,145，735-741,1999)已描述了构巢曲霉(Aspergillusnidulans)abffi基因。WO96/29416、WO96/06935、WO2004/018662和US5,989,887描述黑曲霉阿拉伯呋喃糖酶基因。蛋白质序列对比显示黑曲霉abffi蛋白与绳状青霉素(P.funiculosum)ABFB-2蛋白的同一性为50.9。/o。这些申请没有描述任何一种多肽在动物营养中应用所必需的特征。Clincheetal.(J.Agric.FoodChem.,45,2379-2383,1997)已描述三种来自土曲霉(Aspergillusterreus)的可能用于酿酒的a-L-阿拉伯呋喃糖酶。白曲霉(Aspergilluskawachii)和泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的abffi基因已寻皮Kosekietal.4^述(J.ofBioscience禾口Bioengineering,Vol.96,No.3,232-241,2003)。这些酶在日本酒shochu的发酵中具有应用。来自丝状真菌里氏木霉(Trichodermareesei)的abffi基因已被Margolles-Clarketal.描述(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,3840-3846,1996)。Panagiotouetal.也已描述了两种来自尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的细胞外ce-L-阿拉伯呋喃糖酶(CanJMicrobiol.2003:49(10):639-4)。Carvalloetal.(Mycol.Res"107(4),388-394,2003)已描述了来自产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)的B型a-L-阿拉伯呔喃糖酶。蛋白质序列比对显示产紫青霉菌abf-1蛋白与绳状青霉菌ABFB-2蛋白的同一性为51.2%。此文没有描述任何一种多肽在动物营养应用中所必需的特征。然而，Sakamotoetal,(FEBSLetters560，199-204,2004)已描述了产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)abnx基因，其仍编码与ABFB活性不同的阿拉伯糖酶活性。然而，这些ABFB酶不具备应用于动物祠料所需的最适特性。的确，为了可用于动物铜料，ABFB必须具有与处理相容的特性，可预期用于该伺料的饲料接受所述处理。特别是，所用酶的活性在处理温度和pH条件下必须稳定，而且，如果可能，其在制备这些伺料的过程中以及在消化这些饲料的动物消化系统中的条件下是最佳的。此外，这些酶必须对杂多糖(阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖)具有广语作用(去除分支)，以有效增强动物对飼料的可消化性。增强饲料可消化性可能提高它们的营养价值。因此，对天然底物阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖具有增强的的特异性(立体特异性、对映选择性)、活性或亲和力的酶对于动物飼料非常重要。此外，在水解阿拉伯呋喃糖键之前，完全有必要预先解聚复合物分子如纤维素。真菌的纤维素分解酶(纤维素酶)通常具有fCDB结构域(真菌型纤维素结合结构域)，该结构域在纤维素的解聚中起主要作用。本发明描述了一种适用于动物营养的绳状青霉菌L-阿拉伯呋喃糖酶B(ABFB-2)，及编码该酶的基因。本发明还涉及保留相同催化特性的ABFB-2的同系物、变异体和片^:。有利的是，根据本发明的ABFB酶具有极酸的最适pH(pH2.6)，且在pH1.5时保持其55%的活性。有利的是，ABFB-2酶具有真菌型纤维素结合结构域(fCBD)。已见这种类型的结构域描述于其它酶中，但未见对真菌的阿拉伯呋喃糖酶进行描述。已可能通过实验证实绳状青霉菌ABFB-2酶的纤维素结合结构域的功能。该结合结构域的存在增加酶对其底物的亲和性，从而可能增强对不能溶解的纤维素的降解。因此，由于其对纤维素的催化特性和亲和性，因此绳状青霉菌ABFB-2特别适用于动物饲料。然而，根据本发明的酶也具有其它工业或工农业用途。特别值得一提的是通过发酵处理果汁、造纸、将半分解纤维素生物质转变为燃料或化学制品、造酒。序列描述SEOIDNo.1:绳状青霉菌abffi-2基因的基因组序列。SEQIDNo.2:具有B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性的绳状青霉菌ABFB-2多肽的序列。SEOIDNo.3:绳状青霉菌ABFB-2的fCBD结构域。SEOIDNo.4:绳状青霉菌ABFB-2的低复杂性结构域。SEQIDNo.5:绳状青霉菌蓝色复合体酯酶(cyanomylesterase)fCBD结构域。SEOIDNo.6:绳状青霉菌1,4-D-木聚糖内切酶的fCBD结构域。SEOIDNo.7:绳状青霉菌木聚糖酶纤维生物水解酶的fCBD结构域。SEQIDNo.8:XbaI-abfB-2PCR引物。SEOIDNo.9:HindIII-abfB-2PCR引物。发明描述本发明涉及一种多肽，其包括一种选自以下多肽的多肽-SEQIDNo.2的多肽，-序列介于SEQIDNo.2的位置28和位置400之间的多肽，-SEQIDNo.2的多肽片段，其具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，画一种多肽，其具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且显示与SEQIDNo.2的多肽具有至少80%的同一性。本发明还涉及多核苷酸，其编码oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，选自以下多核苷酸-序列包括在SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间的多核苷酸，-序列包括在SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间的多核苷酸，-编码根据权利要求1的多肽的多核苷酸。本发明的另一个对象为一种多核苷酸，其具有SEQIDNo.1代表的序列或与SEQIDNo.1互补的序列。本发明还涉及表达盒，其在转录方向上包含-在宿主生物中有功能的启动子；-根据本发明的多核苷酸；以及-在相同宿主生物中有功能的终止序列。本发明另一个对象为载体，其包含根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的表达盒。本发明还涉及宿主生物，该生物被根据本发明的多核苷酸、根据本发明的表达盒和/或根据本发明的载体转化。在在本发明的一个实施方案中，宿主生物选自酵母和丝状真菌。优选地，宿主生物为绳状青霉菌抹。本发明还涉及动物的营养添加物，包括根据本发明的多肽、根据本发明的宿主生物或根据本发明的宿主生物的发酵液。优选地，该营养添加物为液体形式或4分末形式。本发明的另一方面为伺料，其包含根据本发明的动物营养基质和动物营养添力o物。本发明还涉及根据本发明的ABFB多肽或根据本发明的宿主生物用于制备动物营养添加物或饲料营养添加物的用途。本发明的另一个对象是根据本发明的ABFB多肽或根据本发明的宿主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a-L-阿拉伯呋喃糖键的用途。多肽本发明因此涉及具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB多肽。优选地，将这些多肽分离自绳状青霉菌。表述"a-L-阿拉伯呋喃糖酶B"应纟皮理解为a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2丄55)B型(GH54)，其催化包含于阿拉伯呋喃低聚糖化合物侧链的a-l，5、a-l,3和a-l,24建的水解。本发明的多肽适用于动物营养。表述"适用于动物营养的多肽"应被理解为其特征使得其适于动物营养的多肽。用于动物营养必需的特征特别为pH及温度，在此pH及温度下酶具有活性。的确，动物消化系统的pH为酸性，因此酶在此pH时必须保持活性，这是为了在L-阿拉伯糖残基的水解中保持其活性。此外，控制营养添加物或动物饲料中的酶的条件包括处理及高于室温的温度。所用的酶活性因此必须在处理条件下，特别是在所述温度条件下稳定。根据本发明的一个实施方案，多肽在酸性pH时，例如低于4.5,优选低于4时显示a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。而且，才艮据本发明的一个实施方案,多肽在pH1.5与pH3.5之间时显示最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。根据本发明优选的实施方案，多肽在高于室温的温度时显示a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。优选地，本发明的多肽在30。C与70°C之间，更优选40°C与60°C之间的温度下具有最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。绳状青霉菌冲朱IMI378536的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B如SEQIDNo.2所示。在优选的实施方案中，将根据本发明的多肽糖基化。特别是，SEQIDNo.2的多肽在氨基酸123和氨基酸127处具有N-糖基化位点。在优选的实施方案中，将SEQIDNo.2多肽的位置123和127处的天冬酰胺残基糖基化。绳状青霉菌的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B是由真菌分泌到其细胞外环境的酶。SEQIDNo.2的多肽因此包括27个氨基酸的信号肽。本发明的对象还为裂解信号肽后获得的成熟多肽。特别是，本发明涉及序列介于SEQIDNo.2的位置28与位置400之间的多肽。在另一个实施方案中，SEQIDNo.2多肽的信号肽可被异源信号肽取代，用于由异源宿主生物表达和分泌SEQIDNo.2的多肽。本发明还涉及具有a-L-阿拉伯呋响糖酶B活性的SEQIDNo.2的多肽的片段。术语多肽的"片^a"指下述多肽，所述多肽包括其所来源的多肽的一部分而不是全部。因此，本发明涉及一种多肽，其包括SEQIDNo.2多肽的至少100、200或300个氨基酸的片段。SEQIDNo.2的多肽的这一片段保持其a-L-阿拉伯^^喃糖酶活性。本发明因此涉及SEQIDNo.2的多肽的生物学活性片段。术语"生物学活性片段"指保持其所来源的多肽的功能的多肽片段。SEQIDNo.2的多肽的生物学活性片段因此保持绳状青霉菌ABFB-2多肽的功能。这些生物学活性片段具有ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。优选地，根据本发明的ABFB片段具有纤维素结合结构域。在优选的实施方案中，纤维素结合结构域具有SEQIDNo.3中描述的序列。优选地，这些片段在pH2.6时显示最佳a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。制备多肽片段的方法和测定a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的技术为本领域技术人员所熟知。本发明的对象还为多肽，其具有L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且显示与SEQIDNo.2的多肽至少90%的同一性。优选地，这些多肽具有与SEQIDNo.2的多肽相同的特性，特别是相同的催化特性。优选地，这些多肽分离自绳状青霉菌的其它株或其它丝状真菌。或者，这些多肽可通过例如定点诱变技术获得。本发明的对象为具有与SEQIDNo.2的多肽至少80%，90%,95%,98%以及优选至少99%相同的氨基酸的多肽。将表述相同的氨基酸理解为两条序列之间不变的或无变化的氨基酸。这些多肽与SEQIDNo.2的多肽相比可显示至少一个氨基酸的缺失、增加或耳又代。本发明的对象还为多肽，其显示与SEQIDNo.2的多肽的相似性为至少90%、95%、98%,以及优选至少99%。将表述相似性理解为蛋白质或核酸序列之间相似性的测量。这些多肽与SEQIDNo.2的多肽相比可显示出至少一个氨基酸的缺失、增加或取代。以分数定量的两条序列之间的相似程度基于序列同一性和/或序列保守取代的百分比。测量和鉴别多肽之间的相同程度和相似程度的方法为本领域技术人员所知。可使用例如载体NTi9.1.0，比对程序AlignX(聚类w算法(ClustalWalgorithm))(InvitrogenINFORMAX,http:〃www.invitrogen.com)。优选地，使用默认参数。将根据本发明的多肽自其自然环境分离或纯化。多肽可通过各种方法制备。特别是，这些方法是从自然来源(如天然表达这些多肽的细胞)中纯化、通过合适的宿主细胞生产重组的多肽及其随后的纯化、通过化学合成的生产或，最后，这些不同途径的组合。这些不同生产方法为本领域技术人员所熟知。因此，可将本发明的ABFB多肽自绳状青霉菌分离。在另一个实施方案中，本发明的ABFB多肽自表达根据本发明的ABFB多肽的重组宿主生物中分离。本发明的对象还为融合蛋白、重组蛋白或嵌合蛋白，包括根据本发明的多肽。术语"多肽"也指被修饰的蛋白质和多肽。才艮据本发明的多肽具有ABFB活性。优选地，才艮据本发明的多肽具有纤维素结合结构域。在优选的实施方案中，纤维素结合结构域具有SEQIDNo.3中描述的序列。优选地，多肽在pH2.6时显示最佳a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。优选地，多肽在50°C时显示最佳a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。多核苦酸本发明还涉及编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苦酸。优选地，这些多核香酸编码绳状青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。根据本发明，表述"多核苷酸"理解为单链核苦酸链或其互补DNA或RNA链，或可为互补或基因组DNA型的双链核芬酸链。优选地，本发明的多核苷酸为DNA型，特别是双链DNA。术语"多核苷酸"也指被修饰的多核普酸。可将本发明的多核苷酸自其自然环境分离或纯化。优选地，本发明的多核苷酸可通过Sambrooketal描述的常规分子生物学技术(MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989)或通过化学合成制备。在第一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其序列介于SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间。该多核苷酸编码SEQIDNo.2的绳状青霉菌ABFB-2酶。在第二个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其序列介于SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间。该多核香酸编码绳状青霉菌信号肽裂解后的成熟的ABFB-2多肽。本发明还涉及多核苷酸，其与序列介于SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间的多核苦酸和/或与序列介于SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%，优选地至少99%的同一性。这些多核苦酸编码a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性。优选地，这些多核苷酸编码绳状青霉菌ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相同的核苷酸理解为表示两个核苷酸序列不变或无变化。这些多核苷酸与对照多核苷酸相比显示出至少一个核苷酸的缺失、增加或取代。本发明还涉及多核苷酸，其与序列介于SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间的多核苷酸和/或与序列介于SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间的多核苦酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%，优选至少99%的相似性。这些多核苦酸编码a-L-阿拉伯p^喃糖酶B活性。优选地，这些多核苦酸编码绳状青霉菌a-L-阿拉伯吹喃糖酶B。表述相似性理解为蛋白质或核酸序列之间相同之处的测量。这些多核苷酸与对照多核苦酸相比可显示出至少一个核苦酸的缺失、增加或取代。以分数定量的两条序列之间的相似程度基于序列同一性和/或序列保守取代的百分比。测量和鉴定核酸序列之间的相同程度和相似程度的方法为本领域技术人员所熟知。可使用例如载体NTi载体NTi9.1.0,比对程序AlignX(聚类w算法)(InvitrogenINFORMAX，http:〃www.invitrogen.com)。优选地，使用默认参数。优选地，与对照多核普酸具有相似程度的多核苷酸保持对照序列的功能。在本文情况下，多核苷酸编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。本发明还涉及多核苷酸，其能与序列介于SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间的多核苷酸和/或与序列介于SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间的多核苷酸选择性杂交。优选地，将选择性杂交在一般严格性条件下完成，优选在高严格性条件下完成。这些多核苷酸编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。优选地，这些多核苦酸编码绳状青霉菌ot-L-阿拉伯呋喃^f唐酶B。表述"能选择性杂交的序列"被理解为，根据本发明，在明显高于背景噪音的水平上与对照序列杂交的序列。由能选择性杂交的序列与对照序列之间的相互作用产生的信号水平比产生背景噪音的其它DNA序列的相互作用的信号水平强，通常强10倍，优选强100倍。允许选择性杂交的严格杂交条件为本领域技术人员所熟知。通常，在给定pH和给定离子强度下，杂交和洗涤温度比对照序列的Tm至少低5°C。通常，用于15至50个核苷酸的多核苷酸的杂交温度至少为30°C，用于多于50个核苷酸的多核苷酸的杂交温度至少为60。C。举例说明，将杂交在以下緩沖液中完成6xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA、500pg/ml变性鲑鱼精子DNA。例如在低严招^性的2xSSC、0.1%SDS緩沖液中，一般严才各性的0.5xSSC、0.1%SDS緩沖液中以及高严格性的O.lxSSC、0.1%SDS緩沖液中成功地完成洗涤。当然，可将杂交根据本领域技术人员所熟知的其它常用方法完成(特别参见Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989)。优选地，与对照多核脊酸选择性杂交的多核苷酸保持对照序列的功能。在本文情况下，多核苷酸编码oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，其与序列介于SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间的多核苦酸和/或与序列介于SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间的多核芬酸选择性杂交。本发明通常涉及编码根据本发明的多肽的多核苷酸。由于遗传密码的筒并，不同多核苷酸可编码相同的多肽。本发明的另一对象为序列如SEQIDNo.1所示的多核苷酸。SEQIDNo.1的多核苦酸包括位于绳状青霉菌abffi-2基因开放读码框(ORF)侧翼的序列。特别是，它们是abffi-2基因的启动子和终止序列。可将abffi基因从其同源调控序列表达，特别是在绳状青霉菌中或其它丝状真菌中过表达。在另一个实施方案中，例如可将abffi基因在各种宿主生物如细菌、酵母和真菌中表达。在本发明的SEQIDNo.1的启动子控制下或在异源启动子的控制下，可将abffi基因在宿主生物中表达。表达盒根据本发明的一个实施方案，使用本领域技术人员所熟知的克隆技术，将编码根据本发明的多肽的多核苷酸插入表达盒。该表达盒包括转录和翻译编码根据本发明的多肽的序列所必需的元件。有利的是，该表达盒既包括可能引起宿主细胞产生多肽的元件，也包括调节该表达所必需的元件。这些表达盒在转录方向上包含-在宿主生物中有功能的启动子；-根据本发明的多核苷酸；-在相同宿主生物中有功能的终止序列。可将任何类型的启动子序列用于根据本发明的表达盒中。特别是，子允许组成型表达，而其它启动子则相反为诱导型。在真菌中有功能的启动子中，可特别提到构巢曲霉(Aspergillusnidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子(Robertsetal.,Current基因t.15:177-180,1989)。在细菌中有功能的启动子中，可特别提到T7噬箇体RNA聚合酶的启动子(Studieretal.,Methodsinenzymology185:60-89，1990)。在酵母中有功能的启动子中，可提到GAL1基因(Elledgeetal.，ProcNatlAcadSciences,USA.88:1731-1735,1991)或酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4的启动子以及ADH启动子。所有这些启动子已有文献描述，且为本领域技术人员所熟知。将选择表达盒用于绳状青霉菌中的表达，所述表达盒例如包括组蛋白H4.B启动子、天冬氨酸蛋白酶启动子或csl13启动子(WO00/68401)。根据本发明的表达盒可额外包括多肽或多核苷酸表达所必需的任何其它序列，例如允许分泌宿主生物产生的多肽的调控元件或信号序列。特别是，可能使用任何调控序列，所述调控序列可能提高插入到表达盒中的编码序列的表达水平。特别地，根据本发明，可与调控启动子序列组合使用其它调控序列，这些调控序列位于启动子与编码序列如转录激活子("增强子")之间。可将各种各样的终止序列用于根据本发明的表达盒中，这些序列可终止转录及mRNA的多腺苷酸化。可使用在所选宿主生物中有功能的任何终止序列。将选择表达盒用于在绳状青霉菌中的表达，所述表达盒例如包括组蛋白H4.B终止子、天冬氨酸蛋白酶终止子或csl13终止子的(WO00/68401)。本发明的对象还为包含根据本发明的表达盒的多核苷酸，有利的是将根据本发明的表达盒插入载体。载体本发明因此还涉及复制或表达载体，所述载体用于转化包含至少一个多核苷酸或一个根据本发明的表达盒的宿主生物。特别是，该载体可对应为已插入根据本发明的多核苷酸或表达盒的质粒、粘粒、噬箇体或病毒。构建这些载体和将本发明多核苷酸插入这些载体的技术为本领域技术人员所熟知。通常，可能使用在宿主细胞中能保持自身、自主复制或增殖的任何载体，以特别诱导多核苷酸或多肽的表达。本领域技术人员将根据待转化的宿主生物和根据所用的转化技术选择合适的载体。特别是，将本发明的载体用于转化宿主生物，用于在宿主生物中复制载体和/或表达根据本发明的多肽。本发明还涉及制备根据本发明的多肽的方法，该方法包括以下步骤核普酸转化宿主生物，-分离宿主生物产生的多肽。宿主生物本发明的对象还为转化宿主生物的方法，所述方法通过将至少一个根据本发明的多核苷酸或表达盒或载体整合入所述宿主生物来完成。可将多核苷酸整合入宿主生物的基因组，或多核苷酸能在宿主生物中稳定4艮好地描述。本发明还涉及一种宿主生物，其可被根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体转化。特别是，根据本发明，表述宿主生物理解为选自细菌、酵母和真菌的任何单或多细胞、低等或高等的生物。表述宿主生物理解为非人生物。有利的是，酵母选自毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)、Yarrowialipolytica和Schwanniomycesoccidentalis。真菌选自曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium),优选选自纟i^大青霉菌、Trichodermareesei、黑曲霉(Aspergillusniger)、；包盛曲霉(Aspergillusawamori)、白曲霉(Aspergilluskawachii)和Trichodermakoningii。在优选的实施方案中，宿主生物为绳状青霉菌株，其中根据本发明的ABFB多肽被表达或过表达。在这些生物中，用于构建载体、转化宿主生物和表达异源蛋白质的技术被广泛描述于文献中(AusubelF.M.etal.，"CurrentProtocolsinMolecularBiology"Volumes1和2,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，1989;T.Maniatis,E.F.Fritsch，J.Sambrook，MolecularCloningAlaboratoryHandbook,1982)。食品添加剂和铜料本发明因此涉及提供oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的食品添加剂。摄入这种类型酶活性可能增强食品的可消化性并提高其营养价值。表述营养添加物理解为有意地、通常以小量添加至食品以改善其可消化性或营养特性的物质。用于动物的营养添加物可包含例如维生素、无机盐、氨基酸和酶。通常，用于动物的营养添加物包括根据本发明的多肽,根据本发明的宿主生物或根据本发明的宿主生物的发酵液。因此，可将具有根据本发明的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多肽自绳状青霉菌林或自用于制备动物营养添加物的重组宿主生物中纯化或分离。或者，可将绳状青霉菌株或产生Abffi多肽的宿主生物直接用于制备动物用营养添加物。在本发明的优选实施方案中，将绳状青霉菌株或根据本发明的宿主生物的培养上清液或发酵液用于制备动物用营养添加物。当将ABFB多肽通过绳状青霉菌抹或宿主生物分泌时，该实施方案特别有利。通常，将该培养上清液浓缩或冻干以制备营养添加物。因此，本发明还涉及制备ABFB酶的方法，该方法包括以下步骤a)在用于诱导ABFB表达的条件下培养绳状青霉菌抹或根据本发明的^f皮转化的宿主生物，b)分离包括ABFB酶的培养上清液。然后可将该培养上清液或发酵液浓缩或冻干以形成食品添加剂或饲料。如果宿主生物在培养基中不分泌ABFB酶，增加打开细胞并纯化细胞提取物的步骤可能是必需的。本发明的营养添加物包含a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，但可能还包含其它营养物质如维生素、氨基酸或无机盐。根据本发明的添加剂增加饲料的可消化性，因此特别有助于更好地增强基于谷类(小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦等)和基于油渣饼(大豆、向日葵、油菜籽等)的食物的营养价值。本发明还涉及包含根据本发明的营养基质和营养添加物的祠料。通常将这些祠料以膳食或颗粒形式提供，其中加入根据本发明的添加剂。表述祠料理解为可作为食物提供给动物的任何事物。饲料包含根据本发明的多肽、根据本发明的宿主生物或根据本发明的宿主生物的发酵液。用于密集的动物育种，这些祠料通常包含营养基质和营养添加物。表述营养基质理解为构成动物饲料配给的主要部分的物质，例如由谷类、蛋白和动物和/或植物来源的脂肪的混合物组成。动物用营养基质适合用作这些动物的食物，并为本领域技术人员所熟知。通常，这些营养基质包含例如玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基质适于它们所指定的各种动物的需要。这些营养基质可能已经包含营养添加物如维生素、无机盐和氨基酸。在优选的实施方案中，本发明涉及用于单胃动物，特别是用于家禽和猪的饲料。家禽特别包括蛋鸡、broilers、火鸡和鸭子。猪特别包括成猪和小猪。附图1:真菌的纤维素结合结构域(fCBD)的组织图。附图2:在40°C下，存在5mMPNPAF时测定ABFB-2酶在Mcllvaine缓沖系列(pH2.2至8)中的最佳pH。附图3:在5mMPNPAF存在下，测定在最佳pH时ABFB-2酶的最佳温度。附图4:当PNPAF为0.5mM至5mM的范围时，在pH2.6和50。C时，测定ABFB-2的动力学常数Km和Vm(1/Vi=f(1/S)。附图5:根据绳状青霉菌生长情况评价abffi-l和abffi-2基因的差异表达。附图6:反应上清液中ABFB-2消失的动力学。酶与细胞的结合通过测量ABFB-2的游离的残余的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性来监控。实施例abffi-2基因的结构分析虽然这些酶通常相当保守，但ABFB-2显示出与丝状真菌的其它ABFB酶低于62%的同一性。通过鉴别两个不同区域解释这一同一性差异。在N-末端部分，对阿拉伯呋喃糖酶具有特异性的区域(IOaa—直到341aa)以及在C-末端区域，通过SMART(简单模块构架搜索工具)分析预域fCBD介于位置367与400aa之间。才艮据文献，这种类型的结合结构域通常在涉及纤维素降解的酶中发现，如葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4)、纤维生物水解酶(EC3.2.1.91)(葡聚糖外切酶)或木聚糖酶(EC3.2.1.8)。这是第一次发现阿拉伯呋喃糖酶的CBD结构域。从结构(初始序列)观点来看，纤维素酶和木聚糖酶由两个不同的结构域组成，即催化结构域和CBD结构域，通过富含脯氨酸和/或羟基化的氨基酸(丝氨酸和苏氨酸)的所谓的低复杂性短序列相连。已在许多真菌的纤维素酶中研究过纤维素结合结构域，它们的特征在于高达36个氨基酸的序列，该序列存在于蛋白质的N-末端(cbh-II或egl2)或C-末端(cbh-I、egll或egl5)。此外，这种类型的结构域特征在于附图1的4个半胱氨酸保守性，这可允许二硫键的形成。预测的绳状青霉菌ABFB-2的fCBD结构域由34个氨基酸组成(THWGQCGGSGYSGPTSCVAPYACTTANPYYAQCL)，包括4个保守的半胱氨酸。该结构域之前为低复杂性的23个氨基酸的特征短序列(STSPGSHTTSTTLTTITSTTAVS)，其富含带有羟基的氨基酸(10个苏氨酸和6个丝氨酸)。在绳状青霉菌中，这种类型的结构域在其它三种酶1,4-木聚糖内切酶、纤维生物水解酶和阿魏酸酯酶(蓝色复合体酯酶)中已有描述。这四种结构域的比对证实了fCBD中4个半胱氨酸的保守性及位置。绳状青霉菌中已知fCBD的比对这种类型的结合结构域在纤维素分解酶(纤维素酶)中已有广泛地描述。使用blast比对工具分析fCBD的初始序列与已知的fCBD序列，鉴绳状青霉菌ABFB—2蓝色复合体酯^1，4-木聚糖内切酶木聚糖酶纤维生物水解酶<367)T柳GQQ3QS鹏鹏TS'CV妙YAeETAN树Y;AQCIf(320)卿恥C郎I:G蹈GCIT-ACASPyTCQ,咖SQCU《374)^RHW卿C啦咖SJ3蹈I鹏PXTCQVL期yyS卿定了I和II型纤维生物水解酶的纤维素结合结构域与来源于Trichodermareesei和黑曲霉的I、II和V型葡聚糖内切酶的结构域具有非常高的同源性。已确定为对保持结构域功能必需的3个酪氨酸残基和天冬酰胺和谷氨酰胺残基在ABFB-2序列中是保守的。结构/功能关系研究显示，通过增加酶与其底物的结合亲和力，这种类型的结构域在纤维素的解聚中起主要作用(Linder,M.&Teeri,T.T.(1997)Therolesandfunctionofcellulose-bindingdomains,J.Biotechnol.5715-28)。在T.reesei中，纤维生物水解酶I(CBHI)在其fCBD结构域缺失时显示保守的催化活性，但酶与纤维素的结合亲和力明显降低。这是第一次在丝状真菌的B型阿拉伯呋喃糖酶中鉴定出这种类型的结合结构域。这种结合结构域的存在提高酶与其底物的亲和力，从而使得可能增强不溶纤维素的降解。L-阿拉伯呋喃糖酶B活性测定的发展在包含0.15%provasoy和0.3%纤维素的混合添加剂的M2培养基上将绳状青霉菌培养40小时后，测定L-阿拉伯呋喃糖酶活性。在培养48小时和72小时时收集样品。培养在200ml锥形瓶中完成，使用了50ml体积。通过在50mMpH5的乙酸钠緩沖液中水解5mM对硝基苯基-(L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)测定活性。将50ial培养上清液与在50。C预热的250pl底物孵育15分钟。加入500fil0.5MNaOH停止反应。在405nm处测定对硝基苯基(PNP)的释放，使用的摩尔消光系数为17000M-l.cm-l。将酶单位定义为在上述条件下每分钟水解1pmolPNPAF的酶的量。对于绳状青霉菌培养物，在培养48h后我们获得20mU.ml-l，在培养72h后获得112mU.ml-1。这些结果与文献一致，的确对于黑曲霉，才艮据培养中使用的诱导物，观察到100至600mU.ml-l等级的活性。克隆绳状青霉菌ab￡B-2ORF并转化进酿酒酵母中从绳状青霉菌的基因组DNA开始，借助引物(Hindin-abffi-2/Xbal-abffi-2)通过PCR扩增abfB-2基因。应用以下PCR条件(94。C30sec;62。C30sec;在72。C1min30sec)进行30个循环。将1215bp的PCR产物克隆入商品化载体pGEM-T(tm)easy中。PCR引物对的序列XbaI-abfB-2:〉5，-TCTAGAATGACGTCCAAACATAGTT-3，<HindlII陽abfB-2:>5，-AAGCTTCTAGAGACATTGAGCGTA-3，<将1215bp的HindlII/Xbal片|殳自载体pGEM-T切除，在HindlII/Xbal位点亚克隆入穿梭载体(placl95-PGK/CYCl)。对于异源表达，abffi-2基因因此受编码磷酸甘油酸酯激酶(酿酒酵母)的基因的组成性PGK启动子和编码细胞色素C氧化酶活性的基因的CYC1终止子(酿酒酵母)的控制。将新的表达载体称为pOT-02。酉良酒酵母抹JF弁1194(CEN.PK113-5D)是来源于带有ura3-52营养缺陷型的CEN.PK122抹的克隆，以表达载体pOT-02转化(乙酸锂/热激法)。在无尿嘧咬的选择性平板(URA3标记)上，以表型互补选择转化抹。选冲奪6个转化^^朱以测试培养上清液中阿拉伯吹喃糖酶B活性的存在。在50ml无尿嘧啶的基本培养基(除野生型对照株外)中，将转化抹培养24小时。以上文描述的方法测定培养上清液中的阿拉伯呋喃糖酶活性。最佳pH的确定将来源于绳状青霉菌的编码阿拉伯呋喃糖酶B活性的abffi-2基因克隆入酿酒酵母中。在几个转化林中检查阿拉伯吹喃糖酶B活性的存在后，选4奪一种转化4朱并在生长24h后测定培养上清液中的ABFB活性。在200ml锥形瓶(工作体积50ml)中完成培养。在Mcllvaine緩冲系列(pH2.2至8.0)中存在5mMp-硝基苯基-oc-L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)时测定活性。将80^1培养上清液与在40。C预热的320iil底物孵育10min。加入1ml1MNa2C03停止反应。在405nm"处测定p-硝基苯基的释放。将一个酶单位定义为每分钟水解1pmolPNPAF的酶量。活性曲线如图2所示。在pH2.6时ABFB-2具有最佳活性，并且在pH3.8时保持55。/。的活性。这是第一次观察到阿拉伯呋喃糖酶的如此低的最佳pH，并且在pH1.5的50mHHCL溶液中具有68%的活性。最佳温度的测定使用相同的流程，我们确定了ABFB-2活性的最佳温度。在pH2.6的各个温度下将酶在Mcllvaine緩沖液中孵育10min。活性曲线如图3所示。ABFB的最佳温度范围已有文献描述，介于40°C与60。C之间。绳状青霉菌ABFB-2在50°C时具有最佳活性。如果选4奪酶的最佳pH和温度(pH2.6和50°C)，则观察到ABFB-2的活性为在pH5和40°C的乙酸盐缓冲液中测定的活性的20倍(305mUvs15mU)。K二和V^的测定在上面确定的最佳条件下，通过测量PNPAF随着时间的水解测定ABFB-2的两种动力学常数(Km和Vm)。在pH2.6緩冲液中，建立0.5与5mM范围的底物(PNPAF)浓度。在50°C监控水解的动力学10分钟。为了获得两种酶的动力学常数，将结果根据双反推法(doubleinversemethod)(Lineweark和Burk)处理，如图4所示。通过在最佳条件下水解PNPAF确定动力学常数。ABFB-2的Km值为0.7mM。通过比较，文献中这类酶的Km值根据所研究的属和真菌的种类在0.05至1.2mM范围变化。在上述条件下ABFB-2具有328molPNPAF/mo1酶/min的最大水解速度(Vm)。测定ABFB-2酶的分子量为确定ABFB-2酶的分子量，将源于基本培养基的生长突变体(酿酒酵母)的培养上清液浓缩200倍，在100°C煮沸5分钟变性，然后储存于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。在野生型菌抹中观察到细胞外蛋白质的量极低。对于突变体，ABFB-2酶被分泌在培养上清液中。主要是与酿酒酵母细胞外蛋白的基本水平有关。获得的ABFB酶的电泳语带是发散的，表明酶的强糖基化。分子量的确定借助于尺寸标记物SeeBlue(Invitrogen)完成。结果表示于表1中。预测的MW在凝胶上评-f介的MWABFB-24155表l:以Kda计的ABFB-2分子量我们比较通过算法载体NTi预测的分子量与变性SDS-PAGE凝胶电泳迁移获得的分子量。我们观察到SDS-PAGE对酶分子量预测过高。凝胶上显示的发散的电泳i普带的确表明了酶的高度糖基化(O和N糖基化)。糖基化发生在正在表达的生物中的蛋白质加工过程中。绳状青霉菌中abffl-2基因的表达情况分析绳状青霉菌具有两种编码B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶的基因abffi-l和abffi-2基因。比较了这些基因在各种绳状青霉菌培养条件下的表达情况。在诱导纤维素分解的和半纤维素分解酶(M2型工业生长培养基)的条件下和非生产条件下(基本的葡萄糖培养基MO)培养绳状青霉菌。在生长40h后，停止培养，回收菌丝，然后提取总RNA。通过测定260nm和280nm处的吸光度(260/280比率>1.8),评价RNA的数量和质量。在两种各自的条件下(MO和M2),通过实时定量PCR定量编码B型阿拍:伯p夫喃^f唐酶(ABFB-1和ABFB-2)活性的转录物水平。在两种条件下以编码绳状青霉菌微管蛋白(tub-1)的基因作为对照。该基因编码对细胞完整性必需的结构蛋白。通常将这个基因用作对照基因是因为不管应用何种培养条件(普遍存在的)，其表达水平不变。为每种基因(abffi-l、abffi-2和tub-l)设计用于定量PCR的特异引物。在两种生长条件(MO和M2)下，逆转录2(ig总RNA。为了确定用于扩增目的基因的最佳条件(定量PCR法的限制以及这些引物对的效率)，连续稀释来自逆转录的互补DNA。标准化的结果如表2和图5所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表2:abffi-1和abffi-2基因的差异表达值为绳状青霉菌生长条件的函数编码分解纤维素的和半分解纤维素活性的基因的转录调控已有描述。这些基因的表达易受培养微生物的碳和氮源的性质和/或复杂性的影响。已报道在葡萄糖存在时这些基因的转录受到高度抑制。此调控通过分解代谢阻遏蛋白CreA完成，所述CreA特异地与这些基因的启动子结合并阻断其转录。在我们通过PCR定量abffi-l和abffi-2信使的试^r中，这两种基因在葡萄糖(MO)条件下的表达水平非常低。这与文献一致，因为已显示这些基因甚至在不利条件下(不存在分解纤维素的和/或半分解纤维素的底物)具有基础表达水平。在M0条件下获得的结果与文献一致。与abffi-l基因不同，abffi-2基因的表达在工业条件下不被诱导。这表明绳状青霉菌产生的酶混合物可通过在工业条件下获得真菌对ABFB-2表达或通过向产生的酶混合物中加入外源性的ABFB-2来改进。fCBD的功能性的确定为了验证fCBD结构域的功能，在微晶纤维素素上测试其与ABFB-2酶的结合。在4°C下，将酶按体积比与含0.5%微晶纤维素的pH为7.5的lOOmMTris-HCl緩冲液混合。存在PNPAF时在已确定的最佳水解条件下，通过测量残留的阿拉伯呋喃糖酶B活性来监测蛋白的结合。酶与纤维素之间多种时间接触后，将混合物离心，通过测定上清液中阿拉伯呋喃糖酶B活性监测ABFB-2蛋白浓度。存在包含ABFB-2酶的对照反应时，在无微晶纤维素的相同试验条件下进行结合试验。存在微晶纤维素时，在相同试-险条件下，通过孵化ABFB-1酶开展第二个对照反应。获得的结果如图6所示。因而，我们可观察到源于绳状青霉菌的酶ABFB-2的真菌型纤维素结合结构域(fCBD)是有功能的。接触10到45分钟后监测酶的结合。孵育IO分钟后，最初存在酶总量的70%已经结合到微晶纤维素上。45分钟后，反应中存在的总酶的80%已经与纤维素结合。这些数据表明接触反应4艮快达到平衡，相对于最初IO分钟的底物，酶结合动力学绝大多数时候确实遵循动力学第一定律。权利要求1.多肽，特征在于其包括一种选自以下多肽的多肽-SEQIDNo.2的多肽，-序列介于SEQIDNo.2的位置28和位置400之间的多肽，-SEQIDNo.2的多肽片段，具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，-一种多肽，其具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，且显示与SEQIDNo.2的多肽至少80％的同一性。2.编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苷酸，其特征在于其选自以下多核苷酸-序列包括在SEQIDNo.1的位置268与位置1470之间的多核苷酸，-序列包括在SEQIDNo.1的位置349与位置1470之间的多核苷酸，-编码根据权利要求1的多肽的多核苷酸。3.多核苷酸，特征在于其具有SEQIDNo.1的序列或与SEQIDNo.1互补的序列。4.表达盒，特征在于在转录方向上包括-在宿主生物中有功能的启动子；-根据权利要求2的多核苷酸；以及-相同宿主生物中的终止序列。5.包括根据权利要求2-3中任一项的多核苷酸和/或根据权利要求4的表达盒的载体。6.用根据权利要求2-3中任一项的多核苷酸、根据权利要求4的表达盒和/或根据权利要求5的载体转化的宿主生物。7.根据权利要求6的宿主生物，特征在于宿主生物选自酵母和丝状真菌。8.根据权利要求7的宿主生物，特征在于其为绳状青霉菌林。9.动物用营养添加物，特征在于其包含根据权利要求l的多肽。10.动物用营养添加物，特征在于其包含才艮据权利要求6-8中任一项的宿主生物和/或根据权利要求6-8中任一项的宿主生物的发酵液。11.根据权利要求9-10中任一项的动物营养添加物，特征在于其为液体形式或4分末形式。12.饲料，特征在于其包含动物用营养基质和根据权利要求9-11中任一项的动物用营养添加物。13.根据权利要求1的多肽或根据权利要求6-8中任一项的宿主生物用于制备动物用营养添加物或饲料的用途。14.根据权利要求1的多肽或根据权利要求6-8中任一项的宿主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a-L-阿拉伯呋喃糖键的用途。全文摘要本发明涉及编码B型α-L-阿拉伯呋喃糖酶并具有纤维素结合结构域的绳状青霉菌abfB-2基因。该α-L-阿拉伯呋喃糖酶可以掺入用于动物的营养添加物或食品中，因为其促进可消化性并从而促进营养价值。文档编号C12N15/56GK101171335SQ200680015038公开日2008年4月30日申请日期2006年5月3日优先权日2005年5月4日发明者奥里佛·图拉斯,奥里佛·诺尔,让-玛丽·弗朗索瓦,让-路克·帕罗申请人:安迪苏法国联合股份有限公司