将基因转移入脂肪细胞或祖代脂肪细胞的方法

专利名称：：将基因转移入脂肪细胞或祖代脂肪细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及以高效率将基因转移入脂肪细胞或前脂肪细胞的技术，其在药物、细胞技术、遗传工程等等领域是有用的。
背景技术：
：在基因治疗中，难治的疾病例如由于细胞中"遗传信息错误"的遗传性疾病，或癌症，例如通过提供正确的遗传信息来修复所述细胞的功能，或通过添加细胞原先没有的新的"保护性基因"，被治疗或预防。在基因治疗中用作治疗基因的基因通常被转移到需要该基因的表达的组织或器官中。这种情况的例子为其中CFTR基因被转移到患有嚢性纤维化的患者中的呼吸上皮细胞内的治疗。在另一种情况中，可以不考虑组织或器官来表达基因。例如，已经进行了尝试来将编码因子VII的基因转移入骨骼肌细胞来在该细胞中产生因子vn以将其供应给血浆(非专利文献1)，因子VII是血浆中的血液凝固因子，已知在肝脏中产生。其中在存在与逆转录病毒结合的功能性物质的情况下用逆转录病毒感染目标细胞的方法，已经作为使用逆转录病毒载体以高效率感染目标细胞的方法来开发(专利文件2、3和4;非专利文献2)。在这种方法中使用与目标细胞结合的物质或具有目标细胞结合位点的物质。对于脂肪细胞或前脂肪细胞，没有已知的功能性物质来提高逆转录病毒的感染性。本发明的主要目的是开发有效地将外源基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中的方法，以及提供生产在治疗或预防疾病中有效的转化细胞的方法。解决问题的手段本发明人发现，当使用功能性物质将脂肪细胞或前脂肪细胞以及逆转录病毒载体共同局部化(colocalized)时，脂肪细胞或前脂肪细胞被逆转录病毒有效地感染，所述功能性物质具有结合VLA-5和/或VLA-4的区域。因而，完成了本发明。本发明概述如下。本发明涉及将基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中的方法，所述方法包括，在存在在单个分子中具有逆转录病毒结合位点和目标细胞结合位点的物质、或存在具有逆转录病毒结合位点的物质与另一种具有目标细胞结合位点的物质的混合物的情况下，用具有外源基因的逆转录病毒载体感染脂肪细胞或前脂肪细胞，其中所述目标细胞结合位点含有能够结合VLA-5的区域和/或能够结合VLA-4的区域。例如，根据本发明使用的逆转录病毒结合位点可以来自选自由纤连蛋白的肝素-n结构域、成纤维细胞生长因子、V型胶原的胰岛素结合位点、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖构成的组的物质。来源于纤连蛋白的与VLA-5和/或VLA-4结合的区域可以用作根据本发明的目标细胞结合位点。具有逆转录病毒结合位点和目标细胞结合位点的物质例如是具有SEQIDNO:1的氨基酸序列以及SEQIDNO:2的氨基酸序列和/或SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽。根据本发明使用的逆转录病毒载体可以是复制缺陷的逆转录病毒载体。本发明的效果根据本发明，有可能有效地生产其中人工地掺入了有用的外源基因的脂肪细胞或前脂肪细胞。这种细胞可以用于各种疾病的治疗，并且在医学上是非常有用的。实施发明的最佳方式本发明提供了使用逆转录病毒载体、通过将逆转录病毒载体和细胞共同局部化，来提高将基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中的效率的方法。在单个分子中具有逆转录病毒结合位点以及脂肪细胞或前脂肪细胞结合位点的物质，或具有逆转录病毒结合位点的物质与另一种具有脂肪细胞结合位点的物质的混合物可以根据本发明来使用。对于逆转录病毒结合位点没有特别的限制，只要它具有与逆转录病毒载体结合的活性。例如，可以使用纤连蛋白的肝素-n结构域、成纤维细胞生长因子、V型胶原的胰岛素结合位点、聚赖氨酸、DEAE-葡聚糖，等等。特别地，由具有来自纤连蛋白的肝素II结构域的逆转录病毒结合位点的SEQIDNO:1(H-271)的氨基酸序列组成的多肽可以优选地使用。含有结合VLA-5和/或VLA-4的区域的物质可以用作脂肪细胞或前脂肪细胞结合位点。对于所述区域的来源没有特别的限制。可以使用VLA-5或VLA-4的已知配体，或识别VLA-5或VLA-4的抗体。可以优选地使用来自纤连蛋白的结合VLA-5或VLA-4的位点。含有SEQIDNO:2(C-274)的氨基酸序列的多肽，或含有SEQIDNO:3(CS-1)的氨基酸序列的多肽是上述的例子。同时具有逆转录病毒结合位点以及脂肪细胞或前脂肪细胞结合位点的功能性物质，或含有逆转录病毒结合位点的功能性物质与另一种具有脂肪细胞或前脂肪细胞结合位点的功能性物质的混合物，可以#4居本发明使用。在特别优选的实施方式中，使用纤连蛋白衍生的重组多肽，例如以下的CH-296(SEQIDNO:4),其具有SEQIDNO:1、2和3的所有氨基酸序列；H-296(SEQIDNO:5),其具有SEQIDNO:l和3的氨基酸序列；或CH-271(SEQIDNO:6),其具有SEQIDNO:l和2的氨基酸序列。做为另一种选择，可以使用H-271(SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽)和C-274(SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽)的混合物。CH-296、H-296、CH-271、H-271和C-274可以如J.Biochem.，110:284-291(1991)中描述的来制备。CH-296可以以商品名RetroNectm(注册商标)从TakaraBio商业上获得。对于使用所述功能性物质的方法没有特别的限制。例如，所述功能性物质可以用来包一皮器皿的表面，所述器i用于逆转录病毒载体对细胞的感染。可以使用已知的方法用于包被。对于根据本发明使用的逆转录病毒载体没有特别的限制。对于基因转移，通常根据本发明使用人工修饰的重组逆转录病毒(即，逆转录病毒载体)。特别地，为了防止不受限制的感染或基因转移，复制缺陷的逆转录病毒载体是优选的。这种载体被制成复制缺陷的，使得它不能在受感染细胞中自主复制，因而是无毒力的。这种载体可以侵入宿主细月包，例如脊推动物细胞(特别是哺乳动物细胞)，来将插入到所述载体中的外源基因稳定地整合到染色体DNA中。已知的复制缺陷逆转录病毒载体的实例包括逆转录病毒载体(例如，MFG载体、cc-SGC载体(WO92/07943)、pBabe(NucleicAcidsResearch,18:3587-3596(1990》、pLXIN(Clontech)或pDON-AI(TakaraBio))、t曼病毒载体(人类免疫在夹陷病毒(HIV)衍生的载体、猿免疫缺陷病毒(SIV)衍生的载体，等等)和其修饰体。对于逆转录病毒载体携带的外源基因没有特别的限制。期望在目标细胞中表达的任何基因可以被插入。其实例包括编码多肽(酶、激素、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白质，等等)、反义RNA、核酶、decoys和引起RNA干扰的RNA的基因。如果本发明是用于基因治疗来进行的，编码对于疾病的治疗或预防有用的物质的基因被转移到目标细胞中。编码在细胞中产生然后转运出细胞(例如，当在血管中循环时)之后发挥作用的多肽，例如分泌的酶、激素、生长因子或细胞因子的基因，作为根据本发明转移到用作目标细胞的脂肪细胞或前脂肪细胞中的基因，是优选的。根据本发明可能使用外源基因，所述外源基因被插入到逆转录病毒载体中处于合适的启动子(例如，逆转录病毒载体中的LTR启动子或外源启动子)的控制下。与启动子和转录起始位点共同作用的另一种调节元件(例如增强子序列)可以存在于载体中，以实现外源基因的转录。优选的，转移的基因可以含有置于下游的终止子序列。此外，可以包括合适的标记基因，其允许选择具有转移的基因的细胞(例如，抗药性基因、编码荧光蛋白的基因、编码可以用作报告物的酶，例如P-半乳糖苷酶或荧光素酶的基因、编码受体蛋白的基因)。根据已知方法制备的逆转录病毒载体可以根据本发明使用。对于制备方法没有特别的限制。从适合于所使用逆转录病毒载体的逆转录病毒生产细胞培养物收集的培养物上清液可以根据本发明使用。逆转录病毒生产细胞可以是在上清液中稳定地产生逆转录病毒颗粒的细胞，或在用逆转录病毒载体质粒转染时短暂地产生逆转录病毒颗粒的细胞。已知的包装细胞系，例如PG13(ATCCCRL-10686)、PA317(ATCCCRL画9078)、GP+E-86或GP+envAm-12(US5,278,056)或Psi-Crip(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:6460-6464(1988))可以用于制备逆转录病毒生产细胞。转染效率高的293细胞、293T/17细胞或G3T-hi细胞可以用于制备逆转录病毒生产细胞。根据本发明，还可能的是使用通过伪型包装(pseudotypedpackaging)制备的逆转录病毒，其具有来自一种病毒的包膜，所述病毒不同于衍生出所述逆转录病毒载体的基因组的病毒。例如，可以使用具有来自Moloney鼠白血病毒(MoMLV)、长臂猿白血病毒(GaLV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)或猫科内源病毒的包膜，或可用作包膜的蛋白质的伪型逆转录病毒。此外，人们可以制备在其表面具有经历了糖链修饰的蛋白的逆转录病毒载体。可以使用逆转录病毒生产细胞制备逆转录病毒载体，所述逆转录病毒生产细胞具有涉及糖基化等等的酶的转移基因。也可以根据本发明使用这种逆转录病毒载体。人们不仅可以使用成熟的脂肪细胞(白色脂肪细胞、棕脂肪细胞，等等)，还可以使用能够分化成脂肪细胞、属于前脂肪细胞的细胞作为根据本发明的目标细胞。前脂肪细胞(Preadipocytes)包括能够直接分化成脂肪细胞的细胞，和保持了分化成各种细胞包括脂肪细胞的能力的间质干细胞或基质细胞。细胞可以是从人类或非人哺乳动物的脂肪组织等釆集的原代培养细胞，或是建立的培养细胞系。用于脂肪组织收集的来源的实例包括但不限于，皮下脂肪和内脏脂肪。脂肪组织作为收集目标细胞的来源是优选的，因为由这种收集对个体造成功能障碍的风险是很低的。间质干细胞或基质细胞可以从骨髓或其他组织收集。具有转移的基因的脂肪细胞或前脂肪细胞可以通过在存在上述功能性物质的情况下用逆转录病毒载体感染脂肪细胞或前脂肪细胞来高效地获得。如果基因根据上述方法转移到了前脂肪细胞中，具有转移基因的脂肪细胞可以通过根据已知方法将产生的具有转移基因的细胞分化成脂肪细胞来获得。做为选择，具有转移基因的前脂肪细胞可以移植到活体中，用于将其分化成脂肪细胞。虽然不意图限制本发明，例如，人们可以在表面包被了上述功能性物质的器皿中用逆转录病毒载体感染细胞来实施本发明。对于容器没有特别的限制，只要它可以用于维持或培养细胞。可以使用陪氏培养亚、细胞培养平板、烧瓶、细胞培养袋等等。利用适合于要使用的功能性物质的已知过程，进行功能性物质对器皿表面的固定。例如，RetroNectin可以溶解在无菌蒸馏水、緩冲液、盐水等等中用于固定化。使用逆转录病毒载体感染的方法的实例包括但不限于以下两种方法。(1)将脂肪细胞或前脂肪细胞和逆转录病毒载体(例如，逆转录病毒生产细胞的上清液)添加到包被有功能性物质的器皿中，并孵育。(2)将逆转录病毒载体添加到包被有功能性物质的器皿中并孵育，洗涤所述器皿来除去逆转录病毒生产细胞衍生的混杂物等等，然后向其中添加脂肪细胞或前脂肪细胞并孵育。后者的特征在于能够除去感染抑制物质，其可能存在于逆转录病毒生产细胞中，虽然不一定需要遵循这种方法。根据要使用的载体或细胞，可以从上述方法或其他方法中选择合适的感染方法。将细胞与逆转录病毒载体培养，在这期间培养基可以被替换，或者必要时可以添加其他载体。在培养之后，收集器皿中的细胞，任选的洗涤细胞。然后，该细胞可以用于各种目的。如果前脂肪细胞经历了基因转移，该细胞可以」法原才羊维持，或可以经历分化i秀导成为成熟细胞。例如，通过添加合适的生长因子或分化诱导物质的培养，间质千细胞可以分化为成熟的脂肪细胞，可以选择合适的细胞培养培养基，用于目标细胞的培养和逆转录病毒载体的感染。例如，可以使用商业上可获得的培养基或其改进型。培养基可以含有生长因子、细胞生长因子等等作为其成分。任选的，可以从经历了根据本发明的逆转录病毒载体感染的细胞中仅选择具有转移基因的细胞。例如，使用转移的外源基因(例如，上述标记基因)的表达作为指标、根据适合于该基因的特征的已知方法来进行这种步骤。由此获得的具有转移基因的细胞可以移植到人类或非人哺乳动物中，来表达转移基因，以发挥期望的作用，例如治疗或预防疾病的效果。具有转移基因的脂肪细胞或前脂肪细胞通常被移植到皮下组织或脂肪组织中，而这不意图限制本发明。根据其中细胞悬液被注射到目标位点的方法、或其中细胞被移植到已经外科手术切开的目标位点的方法，可以进行移植。以下实施例更详细地说明了本发明，但不应被看作是限制本发明的范围。制备实施例l:GFP表达逆转录病毒载体的制备质粒pQBI25(QuantumBiotechnologiesInc.)中编码红移绿色荧光蛋白(以下称为GFP)的基因被插入到质粒pDON-AI(TakaraBio,#3650)的多克隆位点中，来构建质粒pDON-GFP。使用逆转录病毒包装试剂盒Ampho(TakamBio，#6161)以及293T/17细胞(ATCCCRL-11268)和pDON-GFP,根据附于试剂盒的方案来制备GFP表达逆转录病毒载体。通过在转染后48小时(用于实施例l)或72小时(用于实施例2)收集培养物上清液，制备了两种GFP表达逆转录病毒载体的制品，用于随后的实验中。收集的GFP表达逆转录病毒载体保存在-80。C,使用前在"。C水浴中快速解冻。在实施例1中描述的测试中使用以前脂肪细胞生长培养基(以下称为PGM培养基，使用Cambrex,#B8000制备)进行的10倍、40倍和160倍的上清液稀释度，在实施例2中描述的测试中使用以含有10。/o月台牛血清(FBS,Cambrex)的Dulbecco'sf务改的Eaglei咅养基(Sigma,弁D6046)以下称为DMEM培养基)进4亍的4倍、16倍和M倍的上清液稀释度。实施例1:使用RetroNectm向人类前脂肪细胞中的基因转移(1)RetroNectin在培养平板上的固定浓度20)ng/ml的RetroNectin(注册商标，TakaraBio,^T100A)在磷酸盐緩冲盐水(PBS)中的500pi溶液添加到未处理的24孔培养平板(Becton-Dickinson,#351147)的每个孔中。在4。C进行固定过夜。然后从每个孔除去溶液，将含有2%牛血清白蛋白的500plPBS添加到每个孔中，将平板保持在室温下30分钟或更久。在用PBS洗涤一次之后，制备的RetroNectm固定的培养平板用于实验。(2)根据RetroNectm结合方法的基因转移在制备实施例1中制备的500plGFP表达逆转录病毒载体稀释物添加到(l)中制备的RetroNectm固定化培养平板的每个孔中，将平板在C02孵化器中在32。C孵育6小时。然后从每个孔中除去上清液，孔用PBS洗涤一次，将PGM培养基中密度4xl(^个细胞/ml的人类前脂肪细胞(Cambrex,存PT5020)悬浮液500)il播种到孔中，细胞在032孵化器中在37。C培养4天。培养之后，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(3)根据RetroNectmSN方法的基因转移在PGM培养基中密度4xl04个细胞/ml的人类前脂肪细胞悬浮液500(il置于试管中，试管在室温下在1，500xg下离心5分钟，除去上清液。在制备实施例1中制备的500jilGFP表达逆转录病毒载体稀释物添加到试管中，使沉淀的细胞悬浮。悬浮液添加到(l)中制备的RetroNectm固定化培养平板的每个孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养4天。培养之后，细胞进行流式细胞计分析。所有的实-验一式两4分进4亍。(4)根据聚凝胺SN方法的基因转移作为对照，根据聚凝胺(polybrene)SN方法进行基因转移，其中不使用RetroNectin。PGM培养基中密度4xl(^个细胞/ml的人类前脂肪细胞悬浮液500]Lil播种到24孔培养平板(Becton-Dickmson,#353047)的每个孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养过夜。然后除去培养物上清液，添加了聚凝胺(海地美渙铵，Aldnch,#10768-9)水溶液产生8貼/ml终浓度的、制备实施例1中制备的500]alGFP表达逆转录病毒载体稀释物添加到每个孔中，细胞在CCM浮化器中在37。C培养过夜。除去培养物上清液，向每个孔添加500pl新鲜的PGM培养基，进一步继续培养3天，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(5)基因转移效率的测量对根据(2)、(3)和(4)的方法经历基因转移的细胞通过流式细胞计(CytomicsFC500,BeckmanCoulter)测量GFP表达细胞的比例，来评定基因转移效率。特别地，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco-BRL,#25200-056)从培养平板上分离培养的细胞，悬浮在PGM培养基中，进行流式细胞计分析。结果在表1中示出。表1显示了使用GFP表达逆转录病毒载体的10倍、40倍或160倍稀释物、根据相应的方法基因转移后观察到的基因转移效率(GFP表达细胞的比例)(％)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>如表1所示，对于RetroNectin结合方法和RetroNectinSN方法，，见察到了比作为对照的聚凝胺SN方法所观察到的更高的基因转移效率。因而，显示了RetroNectm用于向脂肪细胞基因转移的有用性。实施例2:使用RetroNectin向小鼠前脂肪细胞中的基因转移(1)RetroNectin在培养平板上的固定固定如实施例l-(l)中描述的进行。(2)根据RetroNectm结合方法的基因转移在制备实施例1中制备的500filGFP表达逆转录病毒载体稀释物添力口到(l)中制备的RetroNectin固定化培养平板的每个孔中，将平板在C02孵化器中在32。C孵育6小时。然后从每个孔中除去上清液，孔用PBS洗涤一次，将DMEM培养基中密度4xl(^个细胞/ml的小鼠前脂肪细胞细胞系3T3-L1(ATCCCCL-92.l)的细胞悬浮液500pl播种到孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养1天。除去培养物上清液，向每个孔添加500pl新鲜的DMEM培养基，进一步在C02孵化器中在37。C继续培养3天，细胞进4于流式细胞计分析。所有的实验一式两〗分进4亍。(3)根据RetroNectinSN方法的基因转移将PGM培养基中密度4x104个细胞/ml的3T3-L1的细胞悬浮液500^置于试管中，试管在室温下在1,500xg离心5分钟，除去上清液。在制备实施例1中制备的500filGFP表达逆转录病毒载体稀释物添加到试管中，使沉淀的细胞悬浮。悬浮液添加到(l)中制备的RetroNectm固定化培养平板的每个孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养1天。除去培养物上清液，向每个孔添加500)il新鲜的DMEM培养基，进一步在C〇2將化器中在37。C继续培养3天，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(4)根据聚凝胺SN方法的基因转移作为对照，根据聚凝胺SN方法进行基因转移，其中不使用RetroNectm。如实施例l-(4)中描述的进行基因转移，只是3T3-L1细胞被用作细胞，DMEM培养基被用作培养基。(5)基因转移效率的测量对根据(2)、(3)和(4)的方法经历基因转移的细胞通过流式细胞计测量GFP表达细胞的比例，来评定基因转移效率。特别地，使用胰蛋白酶-EDTA溶液从培养平板上分离培养的细胞，悬浮在DMEM培养基中，进行流式细胞计分析。结果在表2中示出。表2显示了使用GFP表达逆转录病毒载体的4倍、16倍或64倍稀释物、根据相应的方法基因转移后观察到的基因转移效率(GFP表达细胞的比例)(°/o)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表2所示，对于RetroNectm结合方法或RetroNectmSN方法，7见察到了比作为对照的聚凝胺SN方法所观察到的更高的基因转移效率。因而，显示了RetroNectm的有用性。制备实施例2:使用不同的生产细胞的GFP表达逆转录病毒载体的制备根据如制备实施例1中描述的方法制备GFP表达逆转录病毒载体。除了293T/17细胞之外，G3T-hi细胞(TakaraBio,#6163)也被用作生产细胞。GFP表达逆转录病毒载体的两种制备物通过在转染后48小时或72小时收集培养物上清液来制备，在-80°C冷冻保存。实施例3:具有转移基因的细胞的分化诱导(1)细胞的预培养将购买的来自皮下脂肪的人类前脂肪细胞(Cambrex,弁PT5020)解冻，使用PGM培养基和225-cm2烧瓶(Cornmg,#431082)培养约48小时来提高细胞数量，悬浮在由卯％FBS/10%DMSO(Sigma)组成的储存溶液中，保存在液氮中。(2)RetroNectm在培养平^反上的固定如实施例l-(l)中描述的进行固定，只是未处理的48-孔培养平板(Becton-Dickmson,#351178)用作平寺反，添加到孔中的RetroNectm溶液体积是200pl。(3)病毒载体上清液的制备在制备实施例2中制备的GFP表达逆转录病毒载体(生产细胞293T/17细胞；转染后48小时收集)在37°C水浴中快速解冻，用PGM培养基稀释10倍或40倍，并进行实验。(4)根据RetroNectin结合方法的基因转移(3)中制备的GFP表达逆转录病毒载体稀释物200pl添加到(2)中制备的RetroNectm固定化培养平板的每个孔中，平板在32。C在C02孵化器中孵育5小时。然后从每个孔中除去上清液，孔用磷酸盐緩冲水溶液洗涤一次，将(l)中在PGM培养基中预培养的密度4xl(^个细胞/ml的人类前脂肪细胞的悬浮液200pl播种到孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养4天。培养之后，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(5)根据RetroNectmSN方法的基因转移(1)中在PGM培养基中预培养的密度4xl(^个细胞/ml的人类前脂肪细胞的悬浮液20(Hd置于试管中，试管在约1,800xg在室温下离心5分钟，除去上清液。在(3)中制备的200plGFP表达逆转录病毒载体稀释物添加到试管中，使沉淀的细胞悬浮。悬浮液添加到(2)中制备的RetroNectm固定化培养平斧反的每个孔中，细胞在002孵化器中在37°C培养4天。培养之后，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(6)根据聚凝胺SN方法的基因转移作为对照，根据聚凝胺SN方法进行基因转移，其中不使用RetroNectin。(l)中在PGM培养基中预培养的密度4xl04个细胞/ml的人类前脂肪细胞的悬浮液200(il播种到48孔细胞培养平板(Becton-Dickinson,#353078)的每个孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养过夜。然后除去培养物上清液，添加了聚凝胺水溶液产生8jig/ml终浓度的、(3)中制备的200piGFP表达逆转录病毒载体稀释物添加到每个孔中，细胞在C02孵化器中在37。C培养24小时。除去培养物上清液，向每个孔添加200pl新鲜的PGM培养基，进一步继续培养3天，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(7)基因转移效率的测量对于根据(4)、(5)和(6)的方法经历基因转移的细胞，根据如实施例l-(5)中描述的方法通过流式细胞计来测量GFP表达细胞的比例。结果在表3中示出。表3显示了使用GFP表达逆转录病毒载体的10倍或40倍稀释物、根据相应的方法基因转移后观察到的基因转移效率(GFP表达细胞的比例)(％)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>如表3所示，对于RetroNectin结合方法或RetroNectinSN方法，？见察到了比作为对照的聚凝胺SN方法所观察到的更高的基因转移效率。因而，显示了RetroNectin用于向脂肪细胞基因转移的有用性。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如表4所示，当GFP表达细胞的比例与表3所示基因转移效率的值进行比较时，对于经历了相应方法的基因转移的细胞几乎没有观察到差异。因而，证实了转移到前脂肪细胞中的基因在分化成脂肪细胞之后被稳定地维持。(9)通过测量积累的甘油三酯数量评定分化成脂肪细胞的能力经历了基因转移随后是分化诱导的细胞的分化能力，通过测量该细胞中积累的甘油三酯数量来评定。经历了根据(4)、(5)和(6)的方法的基因转移的细胞的分化，以及经历使用没有病毒的培养基的基因转移的对照细胞的分化，如(8)中描述的来诱导。在除去培养物上清液之后，细胞用磷酸盐緩冲水溶液洗涤两次，异丙醇和己烷的2:3混合物250jil添加到每个孔中。在室温下放置30分钟之后收集上清液。按类似的方式重复添加异丙醇和己烷的混合物、放置和收集的步骤。通过浓缩/千燥从收集的混合物中除去溶剂，产生的甘油三酯溶于二曱基甲酰胺(WakoPureChemicalIndustries,#047-25475)中。由此获得的样品使用甘油三酯E-TestWako(WakoPureChemicalIndustries,#432-4020l)来反应，然后使用吸光度平板读数器(MicroReader4,Hyperion)测量570nm处的吸光度，来计算样品的甘油三酯含量。在甘油三酯收集之后通过添加2501N氢氧化钠溶液(使用NacalaiTesque,#31511-05制备)到每个孔中并在室温下放置30分钟，从细月包中收集蛋白质。<吏用MicroBCAProteinAssayReagentKit(Pierce,23235)测定收集的蛋白的浓度。通过用蛋白数量除所述数值来校正样品的积累的甘油三酯数量，以确定每单位蛋白数量的甘油三酯数量。结果在表5中示出。对于根据相应方法经历了使用无病毒(mock)的PGM培养基，或GFP表达逆转录病毒载体上清液的10倍或40倍稀释物的基因转移之后的分化诱导的细胞，表5显示了积累的甘油三酯数量(用单位ng的"TG，，表示)、蛋白数量(用单位ng的"蛋白"表示)以及每单位蛋白数量的甘油三酯数量(用单位Mg的"TG/蛋白"表示)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>如表5所示，对于经历了根据各种方法的基因转移和随后的分化诱导的细胞，观察到了甘油三酯的积累。在模拟细胞(mockcells)和经历使用RetroNectm的基因转移的细胞之间，没有观察到显著差异。对于通过未经历基因转移的人类前脂肪细胞的分化诱导、按类似方式获得的细胞，观察到等量的TG/蛋白数值。因而，表明了前脂肪细胞的分化能力未被基因转移降低。实施例4:使用用不同的生产细胞制备的病毒载体的基因转移(1)细胞的预培养如实施例3-(l)描述的进行预培养。(2)RetroNectin在培养平板上的固定如实施例3-(2)描述的进行固定。(3)病毒载体上清液的制备在制备实施例2中制备的GFP表达逆转录病毒载体在37X:水浴中快速解冻，用PGM培养基稀释10倍、40倍或160倍，并进行实验。在培养72小时后从转染的293T/17细胞或G3T-hi细胞收集的培养物上清液进行实验作为GFP表达逆转录病毒载体。(4)根据RetroNectm结合法的基因转移如实施例3-(4)描述的进行基因转移。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表6所示，证明了有可能根据RetroNectin方法也使用用G3T-hi细胞制备的病毒载体来转移基因。实施例5:使用含有人类血清的PGM培养基的基因转移(1)细胞的预培养如实施例3-(l)描述的进行预培养，只是使用75-cm2烧瓶(Becton-Dickmson，#3531IO)用于预培养，以约9000个细胞/0.2ml/cm2播种细胞。(2)RetroNectm在培养平板上的固定如实施例3-(2)描述的进行固定。(4)根据RetroNectm结合方法的基因转移如实施例3-(4)描述的进行基因转移，只是IOHPGM培养基被用作培养基。(5)根据RetroNectmSN方法的基因转移如实施例3-(5)描述的进行基因转移，只是10HPGM培养基被用作培养基。(6)根据聚凝胺SN方法的基因转移如实施例3-(6)描述的进行基因转移，只是IOHPGM培养基被用作培养基。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表7所示，显示了也可能使用含有人类血清的培养基来转移基因。同样的，当含有人类血清的培养基用于基因转移时，RetroNectm方法观察到的转移效率高于聚凝胺方法观察到的。因而，显示了RetroNectm的有用性。(4)根据RetroNectmSN方法的基因转移如实施例3-(5)描述的进行基因转移。表8预培养条件细月包密度IO倍稀释40倍稀释160倍稀释预培养72小时13000细月包/mL13.0510.034.706600细胞/mL13.838.665.322200细胞/mL29.7028.7216.0248小时后传代13000细胞/mL27.8820.1610.546600细胞/mL38.8334.2819.062200细胞/mL45.8142.2624.57实施例7:向来自内脏脂肪的人类前脂肪细胞中的基因转移(1)细胞的预培养将购买的来自内脏脂肪的人类前脂肪细胞(Cambrex，,TS00"解冻，使用PGM培养基和225-112烧瓶培养约48小时来提高细胞数量，悬浮在由90%FBS(Cambrex)/10%DMSO(Sigma)组成的储存溶液中，保存在液氮中。在基因转移后，在37。C的水浴中快速地解冻保存的前脂肪细胞，用PGM培养基洗涤，以约3700个细胞/0.2ml/cm2播种到75-cm2烧瓶中，培养约48小时。使用胰蛋白酶-EDTA溶液收集培养的细胞。一部分用于根据如以下(6)中描述的聚凝胺方法的实验。将剩余部分播种到75-cm2烧瓶中，进一步培养约24小时，然后进行根据如以下(4)和(5)描述的RetroNectm方法的实一验。(2)RetroNectm在培养平板上的固定如实施例3-(2)描述的进行固定。(3)病毒载体上清液的制备在制备实施例2中制备的GFP表达逆转录病毒载体(生产细胞293T/17细胞；转染后48小时收集)在37。C水浴中快速解冻，用PGM培养基稀释10倍或40倍，并进行实验。(4)根据RetroNectin结合方法的基因转移如实施例3-(4)描述的进行基因转移，只是如以上(l)中描述的来自内脏脂肪的人类前脂肪细胞被用作细胞。(5)根据RetroNectmSN方法的基因转移如实施例3-(5)描述的进行基因转移，只是如以上(l)中描述的来自内脏脂肪的人类前脂肪细胞被用作细胞。(6)根据聚凝胺SN方法的基因转移如实施例3-(6)描述的进行基因转移，只是如以上(l)中描述的来自内脏脂肪的人类前脂肪细胞被用作细胞。(7)基因转移效率的测量如实施例3-(7)描述的进行测量。结果在表9中示出。表格显示了使用GFP表达逆转录病毒载体的10倍或40倍稀释物、根据相应的方法基因转移时观察到的基因转移效率(GFP表达细胞的比例)(％)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如表9所示，显示的是来自内脏脂肪的人类前脂肪细胞可以像皮下脂肪衍生的细胞一样用于基因转移。此外，对于RetroNectm结合方法和RetroNectmSN方法，观察到了比作为对照的聚凝胺SN方法所观察到的更高的基因转移效率。因而，显示了RetroNectm的有用性。制备实施例3:ZsGreen表达逆转录病毒载体的制备质粒pZsGreenl-Nl(ClontechLaboratories,#632448)中编码荧光蛋白ZsGreen的基因被插入到质粒pDON-AI的多克隆位点中，来构建质粒pDON-ZsGreen。根据如制备实施例1中描述的方法使用pDON-ZsGreen制备ZsGreen表达逆转录病毒载体。收集的ZsGreen表达逆转录病毒载体保存在-8(TC，使用前在37'C水浴中快速解冻。用PGM培养基进行的10倍和100倍上清液稀释物进行实验。24实施例8:使用CH-271的基因转移(1)细胞的预培养来自皮下脂肪的人类前脂肪细胞如实施例3-(l)中描述的预培养，用于随后的实验。(2)CH-271在培养平板上的固定如实例3-(2)描述的进行固定，只是CH-271代替RetroNectm被固定。在用于固定的溶液中CH-271的浓度是77昭/m1.(3)根据CH-271结合方法的基因转移使用制备实施例3中制备的ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液和(2)中制备的CH-271固定化培养平板，如实例3-(4)中描述的进行基因转移。(4)根据CH-271SN方法的基因转移使用制备实施例3中制备的ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液和(2)中制备的CH-271固定化培养平板，如实例3-(5)中描述的进行基因转移。(5)根据鱼精蛋白SN方法的基因转移作为对照，根据鱼精蛋白SN方法进行基因转移，其中不使用多肽例如RetroNectm或CH-271。(l)中在PGM培养基中预培养的密度4xl04个细胞/ml的人类前脂肪细胞的悬浮液200播种到48孔细胞培养平板的每个孔中，细胞在C02孵化器中在3TC培养过夜。然后除去培养物上清液，其中添力。了Novo硫酸鱼精蛋白(MochidaPharmaceutical)产生4jig/ml终浓度的、制备实施例3中制备的ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液200pl添加到每个孔中，细胞在C02孵化器中在3TC培养24小时。除去培养物上清液，将200pl新鲜PGM培养基添加到每个孔中，培养进一步继续3天，细胞进行流式细胞计分析。所有的实验一式两份进行。(6)基因转移效率的测量对于根据(3)、(4)和(5)的方法经历基因转移的细胞，根据如实施例l-(5)中描述的方法来测量ZsGreen表达细胞的比例。结果在表10中示出。表10显示了使用ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液的PGM培养基10倍或100倍稀释物、根据相应的方法基因转移时观察到的基因转移效率(ZsGreen表达细胞的比例)(％)。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表10所示，显示了CH-271像RetroNectm—样可以用于将基因转移到人类前脂肪细胞中。CH-271由来自纤连蛋白的逆转录病毒结合位点和能够结合VLA-5的区域组成。对于CH-271结合方法和CH-271SN方法，观察到了比作为对照的鱼精蛋白方法所观察到的更高的基因转移效率。因而，显示了其中使用CH-"1将目标细胞和逆转录病毒载体共同局部化的转移方法的有效性。实施例9:使用H-296的基因转移(1)细胞的预培养来自皮下脂肪的人类前脂肪细胞如实施例3-(l)中描述的预培养，只是PreadipocyteGrowthMedium-2(以下称为PGM-2培养基，使用Cambrex,#PT-8002制备)被用作培养基。(2)H-296在培养平板上的固定如实例3-(2)描述的进行固定，只是H-296代替RetroNectm被固定。在用于固定的溶液中H-296的浓度是100)ig/ml。(3)根据H-296结合方法的基因转移使用制备实施例3中制备的ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液和(2)中制备的H-296固定化培养平板，如实例3-(4)中描述的进行基因转移。PGM-2培养基被用作培养基。(4)根据H-296SN方法的基因转移使用制备实施例3中制备的ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液和(2)中制备的H-296固定化培养平板，如实例3-(5)中描述的进行基因转移。PGM-2培养基被用作培养基。(5)根据鱼精蛋白SN方法的基因转移如实施例8-(5)描述的进行基因转移，只是PGM-2培养基被用作培养基。(6)基因转移效率的测量对于根据(3)、(4)和(5)的方法经历基因转移的细胞，根据如实施例l-(5)中描述的方法来测量ZsGreen表达细胞的比例。结果在表ll中示出。表11显示了使用ZsGreen表达逆转录病毒载体上清液的PGM-2培养基10倍或100倍稀释物、根据相应的方法基因转移时观察到的基因转移效率(ZsGreen表达细胞的比例)(％)。表11_^_IO倍稀释100倍稀释H-296结合方法28.579.20H-296SN方法32.4910.97鱼精蛋白SN方法16.686.33_如表11所示，显示了H-296像RetroNectm—样可以用于将基因转移到人类前脂肪细胞中。H-296由来自纤连蛋白的逆转录病毒结合位点和能够结合VLA-4的区域组成。对于H-296结合方法和H-296SN方法，观察到了比作为对照的鱼精蛋白方法所观察到的更高的基因转移效率。因而，显示了其中使用1^2%将目标细胞和逆转录病毒载体共同局部化的转移方法的有效性。工业实用性根据本发明，有可能以高效率将有用的基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中。具有转移基因的细胞可以表达基因产物，所述基因产物对于生物个体中疾病的治疗或预防是有用的。因而，本发明提供了通过移植这种细胞的基因治疗方法。序列表自由文本SEQIDNO:4:具有纤连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的多肽。SEQIDNO:6:具有纤连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的多肽。权利要求1.一种将基因转移到脂肪细胞或前脂肪细胞中的方法，所述方法包括，在存在在单个分子中具有逆转录病毒结合位点和目标细胞结合位点的物质、或存在具有逆转录病毒结合位点的物质与另一种具有目标细胞结合位点的物质的混合物的情况下，用具有外源基因的逆转录病毒载体感染脂肪细胞或前脂肪细胞，其中所述目标细胞结合位点含有能够结合VLA-5的区域和/或能够结合VLA-4的区域。2.根据权利要求1的方法，其中所述逆转录病毒结合位点来源于选自由纤连蛋白的肝素-n结构域、成纤维细胞生长因子、v型胶原的胰岛素结合位点、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖构成的组的物质。3.根据权利要求1的方法，其中所述目标细胞结合位点是来源于纤连蛋白的结合VLA-5和/或VLA-4的区域。4.根据权利要求3的方法，其中在存在多肽的情况下进行逆转录病毒载体的感染，所述多肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列以及SEQIDNO:2的氨基酸序列和/或SEQIDNO:3的氨基酸序列。5.根据权利要求1的方法，其中所述逆转录病毒载体是复制缺陷的逆转录病毒载体。全文摘要一种将基因转移到脂肪细胞或祖代脂肪细胞中的方法，包括在存在在分子中兼具逆转录病毒结合位点和目标细胞结合位点的物质、或存在具有逆转录病毒结合位点的物质与具有目标细胞结合位点的物质的混合物的情况下，用具有外源基因的逆转录病毒载体感染脂肪细胞或祖细胞，其中所述目标细胞结合位点具有能够结合VLA-5的区域和/或能够结合VLA-4的区域。文档编号C12N5/10GK101283094SQ200680021369公开日2008年10月8日申请日期2006年6月12日优先权日2005年6月15日发明者佐川裕章,円居隆宏,加藤郁之进,榎龙嗣申请人:宝生物工程株式会社