用于单个微生物的快速检测和鉴定而无需初步培养的装置的制作方法

专利名称：用于单个微生物的快速检测和鉴定而无需初步培养的装置的制作方法
用于单个微生物的快速检测和鉴定而无需初步培养的装置
背景技术：
1.发明领域
现代微生物诊断学合分析用于存在于不同样本中的微生物的检测、计数和鉴定。在医学诊断学和兽医学领域内，这些生物是人或动 物血液、内脏器官、皮肤、组织、呼吸器官等中的致病微生物或危险 微生物。在工业微生物学领域，微生物通常污染技术方法、材料、设 备和成品。在环境分析中，通常存在水、室内和室外空气以及各种表 面的微生物污染。在流行病学和生物防御中-来自人体或环境的传染性 致病微生物。
微生物学分析的时间、质量和灵敏度因两个原因是至关重要的。 首先，成千上万的国内微生物实验室每年花费数十亿美元用于工业中 的产品和流程质量控制以及污染和腐败的预防。这些实验室也花费钱 以提供用于人、动物、植物、食品、个人护理用品、土壤和环境的诊 断检测。快速、可靠、流水线诊断检测长期可节约公司数百万美元。 第二 ，既使在象美国 一样高度发达的国家中数千人也由于长时间的诊 断造成的医疗延迟而死亡。通过减少进行这些微生物诊断检测所花费 的时间将导致分析可靠性和灵敏度的增加。最终，这可在世界范围内 挽救数千人的生命。
本发明是用于微生物的快速检测和鉴定而无需初步培养的装置。
2.相关领域的描述
可将用于微生物的检测、计数和鉴定的现代方法分成两大部分 1)需要初步培养(富集)以产生可检测量的细胞的方法和装置；2)因 为其能够分析少至单个细胞从而不需要初步培养的方法。
第一组包括在固体或液体常规或选择营养培养基中的培养。其也
包括几种免疫学方法。实例是乳汁和红细胞凝集、磁颗粒上的抗体、
酶联免疫测定法如ELISA和Western印迹法、和"deepstick，，法。第 一组也包括脂肪酸的层析法、红外拉曼和FTIR光语学、质语法和ATP-、 生物-和化学发光法。这些方法需要数百至数百万纯细胞来进行某些微 生物的检测，从而需要长时间(许多小时或天)的初步培养。
第二组方法和装置不需要初步培养，因为它们能够检测和/或鉴定 甚至单个细胞。这些方法和装置由成组的核酸方法如PCR和其不同的 修饰、外荧光(Epi-fluorescent )法(荧光底物法(fluorogenic substrate method)、免疫荧光法)和成组的流式细月包计量术组成。
除了其他缺点外，无需初步培养的细胞检测和/或鉴定方法通常需 要非常昂贵和复杂的设备以及高水平专业工作。例如，用于PCR的装 置包括昂贵的热循环仪和复杂的荧光计。PCR也只用于鉴定目的。使 用PCR进行最初污染的计数是不可靠的。PCR对于可污染检测本身的 生物是非常敏感的。
外荧光通常只需要荧光显微镜来检测用荧光染料或荧光抗体 (Ab+荧光染料)标记的单个细胞。然而，存在的荧光物质的量受到细胞 体积或细胞表面的限制。小体积的目标(单个微生物)使单个细胞的 检测非常困难，特别是大量背景荧光通常存在于大部分样本中。对于 外荧光方法，流出细胞的物质或单个细胞的酶免疫测定是不可能的， 因为这些指示剂物质立即分散在周围空间而不是集中在小体积内，如 由本发明提及的小体积内。
流式细胞计量术(Flow Cytometry)基于非常复杂的光电子学系
统。流式细胞仪由复杂的聚光装置、电子元件、复杂的水动力系统和 高速计算机组成。不同类型的流式细胞仪的价格在$50，000至 $140, 000的范围内。流式细胞仪可在一个单个细胞流过各自具有10 微米直径的通道过程中对其进行分析。通道的尺寸是如此狭窄以至于 其需要17个小时才能使100ml液体通过，即使流速为每秒20米。因 此，流式细胞仪目前用于血液学，因为血液细胞的量大(5-6百万个/ml) 和或多或少稳定的浓度。同样，流式细胞仪在细胞学中作为细胞混合
物的分选器是非常有效的。流式细胞计量术在微生物学中的使用不容 易。在微生物学中通常不使用这些仪器，因为微生物可与其他颗粒产 生群集体并且可与天然颗粒或死细胞混杂在一起。如果样本中细胞的 浓度非常低，分析的时间急剧增加。因此，对于流式细胞计量术的微 生物学应用，需要初始浓聚或甚至富集。微生物在尺寸和形状上的变 化也比血细胞丰富得多，因此，经常发生错误。
已知，并且目前已用于实践中，将样本分成小体积有助于更快地 检测细胞浓度。该效应基于在小体积中达到可检测的浓度比在大体积
中快。美国专利5,716， 798描述了用于在多个离散的区上分开的容器 中快速检测微生物的方法，可通过在一些区中进行初步培养后达到可 检测的细胞浓度就微生物的存在与否分别监测所述各区。该方法与其 他方法相比节省大约10°/。至40%的时间。美国专利5， 770，440基于相
同的效应。本发明与这些专利不同在于单个细胞的分析。不需要费时 的初步培养或营养培养基。
美国专利4，959，301基于将具有活力的生物实体的样本分成微 滴，然后通过培养或通过微滴内的单个实体的生物化学反应来检测实 体。该方法在一些变体中在少于30分钟内可显示单个细胞。然而，其 在技术学上很复杂的。产生具有不同体积的微滴并且要求对计算结果 进行统计分析。该方法只可在实验室中由高度专业的工作人员使用复 杂的和昂贵的设备进行再现。
提及的装置与已知方法相比具有显著的有利方面
能够通过着色的或荧光酶或酶免疫测定检测和/或鉴定少至一个 在微通道中被捕获的单个细胞( 一个微通道中的一个细胞对应于每ml 25， 000, 000个细胞的浓度)。因此，不需要初始培养，且可在数分钟 内达到可检测的浓度。
装置和分析的价格比流式细胞计量术或PCR低IO倍(对于该诊断 装置，只需要常规荧光或光学显微镜)。同样，需要的试剂的量显著 低于使用常规96孔板需要的量。作为结果，分析是简单的并且成本低廉。
所述装置简单易用并且包括只用少量操作就可进行常规过滤。甚 至非专业人员也可容易地采用该装置和方法，这对于广泛使用是非常 重要的。
用提及的装置可进行许多不同的方法通过焚光或显色底物检测 活细胞、通过特定的酶和用于其的人造底物进行的区分、通过单个细 胞的酶免疫测定进行的鉴定、不同液体或气体样本的分析。
这些有利方面提供了使用该装置和其形式用于医学诊断、工业、 环境科学和生物防御中的优良机会。
发明概述
本发明建立了由微通道板、支持结构元件、过滤器和过滤器支持 物(其在方法进行中被纯琼脂块或营养培养基块取代)组成的装置。 所述装置希望通过在微通道的非常小的体积中提供生物化学酶学或酶 免疫测定反应来进行微生物的快速检测和/或鉴定。甚至可在数分钟至
通过在长形(直径/长度=1/10-1/100)、圆柱状、平行的微通道 中的过滤材料的表面过滤来捕获微生物，所述微通道两侧开口并且一 侧附着至过滤材料。微通道板上安装了多个微通道(各通道可能的直 径-l-30iam，长度100-1000 um,和1平方厘米上的数目 -IOO，OOO-l,OOO，OOO个)。在完成过滤后，+>开装置，然后移出过滤 器支持物并用纯琼脂块替代。预先用生物化学指示剂(酶的人造底物-生色的或发荧光的，取决于方法)试剂填充纯琼脂糖块(琼脂)。人
抗体反应附着至细胞表面的酶(用于单个细胞的酶免疫测定)，这开 始了无色人造底物分子至着色的或荧光分子的转化。这些分子聚集在 包含细胞的微通道的非常小的体积中。微通道的极其小的体积(毫升 的1/25百万分之一 )允许其在非常短的时间内聚集具有可检测浓度的 着色的物质或荧光物质。 一个微通道的体积是如此小(在微通道的尺 寸直径IO微米和长度500微米的情况下，只有40，000立方孩支米)，以至于在微通道中捕获的一个单个的细胞对应于每毫升样本
25， 000， 000个细胞的浓度)。包含细胞和浓缩的着色的(紫色、蓝色、
深蓝色、黑色或其他颜色-取决于所用的生色底物)分子的微通道在常 规光学显微镜下在明背景上看起来象着色的圆斑。包含细胞和浓缩的 荧光分子的微通道在荧光显微镜下在暗背景上看起来象明亮(蓝色、 绿色、红色-取决于使用的发荧光的物质)的圆斑。着色的斑或焚光斑 (点)的数目对应于初步过滤的样本中的活细胞的数目或通过酶免疫 测定鉴定的特别危险的或致病性细胞的数目。微通道板的表面上的着 色点或焚光点的简单观察和计数允许进行低至每样本一个单个细胞的 浓度的细胞的快速检测和/或鉴定。
附图的几个视图的概述


图1.显示微通道玻璃板的一般结构和形状。显示的相对板较大
的微通道。该板上的通道的实际尺寸是通道直径10微米，长度500 微米，通道之间的距离2微米和通道的数目为每cm2大约700， 000个。
图2.解释用于微生物的取样、检测和/或鉴定的装置的主要部分 和一般结构。图的左侧解释主要组成部分的位置微通道板、过滤器、 过滤器支持物和琼脂块。右侧显示放大的结构的部分。来自一个在微 通道中被捕获的细胞的荧光分子或着色分子的产物显示于通道中。
图3.显示用着色的分子(左)和荧光分子(右)填充的微通道间 的差异。下面的图解释在光学或荧光显微镜下两种形式看起来的样子。
图4.该图显示已装配的装置的内部结构，所述装置用于通过过
滤取样和将存在于样本中的细胞置于过滤材料表面上的微通道中。
图5.显示与图4中相同的装置的未装配的组件。
图6.显示图4和图5中显示的装置的真实工作模型。
图7.在进行过滤后，将装置的上部从下部的过滤漏斗移开。移
开过滤器支持物，然后用纯琼脂块(5)取代。该图上显示的装置是这
些变换的结果。
图8.该图显示图7中显示的装置的未装配的组件。
图9.显示在过滤过程中装置的位置具有用于液体样本的漏斗 的装置(左)、具有用于加入抗体-酶缀合物的注射器的装置(中间)、 在空气(生物气溶胶)过滤期间的装置(右)。
图10.显示经转换用于在微通道中沉积具有生物颗粒(细胞、病 毒、生物分子)的磁性颗粒的装置的一般结构，所述生物颗料通过 Ab-Ag相互作用调节至磁性颗粒的表面。将磁性颗粒沉积在微通道的 底部和将其与非磁性颗料分开的方法显示于下面。
发明详述
本发明建立了用于细胞(所述细胞以达到单个细胞的浓度存在于 被检查的样本中)的快速检测和/或鉴定而无需初步培养的装置。通过 将被检查的样本通过装置进行过滤来达到该目的，所述装置由微通道 板、过滤器和用于过滤器的支持物(在操作步骤中其被用试剂填充的 琼脂糖块取代)组成。装置被支架围绕。在过滤过程中，微生物通过 微通道，然后被捕获在过滤器表面。在完成过滤后，微通道被来自琼 脂糖块的试剂充满，然后细胞酶和人造底物之间的反应开始。因为微 通道的极其小的内部体积的缘故，这些反应的产物(着色的分子或荧 光分子)快速充满微通道的体积。所述产物快速达到在光学或荧光显 微镜下可检测的浓度。包含细胞的微通道看起来象着色的点或荧光点， 很容易与空的微通道区分开。
所述装置的关键部位是微通道板(图1)。微通道板由玻璃板制 造，该玻璃板可包含数千或数百万个微小的、精确制造的通道(孔)。 微通道尺寸和体积的偏差通常不超过1%。通道通常具有1-20微米的 直径和具有比其直径长10-100倍的长度。 一个通道的体积可从1000 至300， 000 gm3.微通道板可包含每cm2 100， 000-1， 000， 000个通道。 通道之间的距离大约为1-2um。板的直径可改变。通常其为25-47 mm。 板的厚度在0. 2至5 mm的范围内(通常为0. 5 mm)。
捕获在通道(长度-500 pk、通道直径-10 Mk、体积-40， OO0 uk3) 中的一个单个的细胞对应于每ml 25， 000， 000个细胞的浓度。因此，
来自一个细胞的分析的(着色的或荧光)物质的可检测浓度可在与
25， 000， 000个类似的细胞能够产生的物质的时间相同的时间内达到。 该时间是数分钟或数十分钟，取决于存在的细胞和使用的方法。微体 积的效应的另一个实例可通过肉眼看到的荧光物质(来自4-甲基伞 形基(Methylumbelliferyl )乙酸酯的4-甲基伞形酮)的浓度由微通 道(体积=40， 000 ja k3)中的一个细胞(巨大芽胞杆菌(Bacillus megatherium))在2分钟内达到。1毫升(体积=1012 n m3)中的相同 细胞将在95年后产生相同的浓度。
微通道板由特殊玻璃制造。其对不同的溶剂或玻璃清洁液具有抗 性。微通道板在物理上也是耐用的。微通道可用黑色无荧光玻璃或无 着色玻璃制造。
微通道因为通道(毛细管)的非常小的直径而展示极强的毛细管 作用。事实上，其毛细管作用强到足以将水柱提升至百米的高度。甚 至高度粘稠的液体如甘油也可容易地充满通道。因此，微通道将数秒 左右充满来自附着至板下面的琼脂糖块的液体。
目前通过工业生产的、用于影像增强器的微通道板不是很适合发 明的装置的微生物学目的，因为它们的通道是在与板的表面成特定角 度下生产的。这不能给板读出器提供在显微镜下观察微通道的整个内 部体积的机会。用于观察通道的最佳角度正好是90。。同样，为了产
生用于颜色反应的无色板，板的生产方法需要改变。
图1中显示的微通道板具有只用于说明目的的相对大和短(小比 率的长度/宽度)的通道。用于本发明装置的微通道板的真实尺寸为 通道直径-10 Mm,通道长度=500 iam， 一个平方厘米上的微通道数 目大约为700， 000个，板直径为25 min。也可以产生具有其他参数的 微通道板。 一个微通道板的目前价格在$50-$300的范围内。对于本发 明装置的分析目的，各微通道板可使用至少100次。
准备用于过滤的装置的主要部分显示于图2。装置由微通道板、 过滤器和用于过滤器的支持物或用人工底物充填的琼脂块组成。该结 构由图3 (装配的)和图4 (分开的)中显示的支架围绕1 -用塑料制作的用于板、过滤器和过滤器支持物的支架；2 -防止微通道板突 然破坏和支架与板之间的不希望出现的缝隙的橡皮环；3-微通道板； 4 -用于捕获细胞的过滤器；5 -用于能够通过液体(液体样本)或 空气(生物气溶胶)的过滤器的用塑料或玻璃颗粒制作的支持物；6-用于在过滤期间轻压用于过滤器的支持物的橡皮环；7 -用于装置至 滤液歧管的调节的塑料漏斗(也参见图7)。上部分(l-5)通过螺钉(支 架(1)至漏斗(7))或通过摩擦与塑料漏斗(7)贴靠在一起。
过滤的方法显示于图9中。将装配的装置附着至用于过滤的歧管。 来自泵的负压使液体或空气样本通过微通道板。存在于样本中的细胞 被捕获在过滤器表面上的一些微通道中。
当过滤步骤完成和不再有液体存在于微通道内部时，将装置从歧 管取出，然后松解。移走用于过滤器的塑料支持物，将具有人造底物 的块安装在其位置(图7和8 )。所有微通道立即充满人造底物溶液， 然后活细胞的酶或通过抗体附着至细胞表面的酶(酶免疫测定)之间 发生反应。该过程发生在图7-8中显示的明显不同(经修饰的)的装 置中。图7和8示出了装配的装置，其包括1 -用于板、过滤器和 过滤器支持物的用塑料制作的支架；2 -防止微通道板的突然破坏和 支架与板之间的不希望出现的缝隙的橡皮环；3 -微通道板，4 -用 于捕获细胞的过滤器，5 -用人造底物充填的琼脂糖块，其中的底物 在充满微通道的溶液中；6 -用于琼脂块并附着支架1的板。板6可 向上柠紧在支架1上或通过摩擦力保持就位。在进行需要的改变后， 为了在包含被靶定微生物的微通道中产生可检测量的着色的分子或荧 光分子，将该经改造的装置置于保温箱中。
琼脂块和人造底物 用于不同酶或酶组以产生可检测的吸收剂或荧光分子的浓度的人 造底物是熟知的。人造底物用于酶活性的检测、活细胞检测和酶免疫 测定和ELISA中的鉴定。人造底物的主要特征是其在通过酶转变后产 生着色的分子或荧光分子的能力。许多不同的人造底物基于生色分子例如2-硝基酚、4-硝基酚、5-溴-4-氯-3-双甲氧苯-引咮(indoxol )、 3-双甲氧苯吲哚、5-溴-氯3-双曱氧苯吲哚、6-氯-3-双甲氧苯吲咮、 5-碘-3-双甲氧苯吲哚、N-曱基双甲氧苯p引咮、3， 3'5， 5'-四甲基联苯 胺盐酸盐、四唑盐和其他分子。其他人造底物基于荧光分子例如4-甲 基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、荧光素、曙红和其他分子。它们覆 盖了不同酶(例如糖苷酶、酯酶、磷酸酶、肽酶、硫酸酯酶、脱氢酶 和特殊的酶如辣根过氧化物酶、P-D-半乳糖苷酶或特定的氨基肽酶) 的大部分光镨。从人造底物产生的一些着色的或荧光分子聚集在细胞 内，而它们中的一些流到外面并收集在细胞外环境中。收集在细胞内 部的分子(四唑盐、5-碘-3-双甲氧苯吲哚、荧光素和其他分子)对于流 式细胞计量术和外荧光法是非常重要的，因为它们使细胞体着色并使 其更加明显和/或可检测。这是非常少量的分子，因为其受到细胞体积 的限制。这些分子在细胞内的聚集可使细胞死亡。分子/物质的其他组 具有在酶-底物反应期间流出细胞的能力(4-曱基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、4-硝基酚和其他分子)。它们不导致细胞死亡，从而可进 行长时间收集并达到很高的浓度。该组人造底物用于产生使用发明的 装置进行检测和鉴定的方法，因为如图5中所示，在微通道中收集的 分子使细胞着色或使它们发荧光。图5的左侧显示被作为显色反应的
结果的着色分子填充的微通道与无细胞的微通道之间的差异。下面的 圆圏显示在显微镜下的着色的微通道。图5的右侧显示荧光分子填充
的微通道和无细胞的微通道之间的差异。下面的圆圏显示在显微镜下
焚光分子填充的微通道。
可在用需要的人造底物填充的琼脂糖圆柱块帮助下进行微通道内 的人造底物的递送(图2、图7和图8)。
充满琼脂糖凝胶(琼脂)的块的有利方面是溶解的物质(底物) 对琼脂的分子-聚合物不具有拮抗性，从而可容易地流出并充满所有微 通道(因为其强大的毛细管作用的缘故)；可在各方向上挤压琼脂块， 从而使其很容易地适合过滤器的表面而不产生洞或狹缝。没有人知道 人造底物不与琼脂糖分子反应。可从琼脂层切出琼脂块或通过以特殊形式固化来制备。琼脂对光是透明的，从而可在光学显微镜下使用而 不用移开。
在一些情况下也可使用其他凝胶如明胶、硅胶或聚丙烯酰胺凝胶 或甚至可溶性底物的其他载体如滤纸。
用于颜色(光吸收剂)反应的装置的形式
用于显色(光吸收剂)反应和分子的装置必须具有无色微通道板 和无色或白色过滤器。无色微通道板和过滤器对于光是透明的，从而 在光模式中更好地用光学显微镜观察着色的微通道。
用于荧光反应的形式
为了消除可能的背景荧光，在该形式中必须使用黑色微通道板和 黑色过滤器。
用于颗粒(用抗体非磁性、磁性和顺磁性微颗粒包被的)的形式
发明的装置不仅可用于在农i通道中沉积细胞而且还可沉积用抗体 包被的颗粒。这些颗粒必需显著小于微通道的直径。可在诊断剂市场 上广泛地获得用特定单克隆抗体(聚丙烯、聚碳酸酯、磁性和其他颗
粒)包被的颗粒。包被的颗粒用于通过Ab-Ag相互作用在其表面上浓 缩抗原(细菌、病毒、蛋白等)。因此，用被研究的病毒的抗体包被 的颗粒将在其表面吸收病毒，在通过装置过滤后，其将沉积在孩i通道 中。包被的颗粒为在微通道中沉积不能通过常规过滤捕获(因为小尺 寸)的小物体如病毒、蛋白和其他生物分子提供了可能性。在具有分 别经调整的病毒或生物分子的、被包被的颗粒在微通道中被捕获后， 可通过上述的酶免疫测定法鉴定它们。
可通过磁场将磁性颗粒捕获在微通道中。在该情况下，显示于图 7中的琼脂块必须被磁铁取代。如图10中显示，磁铁必须强到足以将 磁性颗粒从液体拉向微通道的底部。将过滤材料表面上的具有抗原的 磁性颗粒从液流中拉出的能力取决于磁场的能量、铁、钴和稀土元素 原子的含量和/或颗粒的尺寸以及液流速度。为了将所有磁性颗粒从液 流中拉出和让非》兹性颗粒(有机和无机物颗粒、无需要的抗原决定子
的活的和死的细胞以及溶剂分子)流出装置的流动室，可就样本的特 定需要容易地调整所有这些参数。
装置的该形式具有额外的元件具有用于输入和输出载有磁性颗 粒(具有吸引至其表面的细胞、病毒或分子)的液体的通道的盖子。 图10显示该改造的装置的结构1 -用于板的支架；2 -防止微通 道板的突然破坏和支架与板过滤器之间的不希望的缝隙的橡皮圏，和 塑料制成的过滤器支持物；3 -微通道板；4 -用于捕获细胞的过滤 器；5-具有与琼脂块相同尺寸的铁或稀土元素(钕和钐钴、钕铁硼合 金)，磁铁盘；6 -用于磁铁或琼脂块的板；7 -覆盖支架1的上部和 形成流动室的盖子；8 -用于输入和输出含有具有抗原的磁性颗粒的 液体的通道。
在图10的下部显示了磁铁工作的原理设计方案在磁场中很容易 分离磁性和非磁性颗粒。非磁性颗粒流出小室，而具有抗原的磁性颗 粒被收集在微通道中。抗原检测和/或鉴定的方法与用于通过上述过滤 捕获细月包的方法相同。
实施例1
液体样本中微生物污染的检测
必须就细菌或真菌的存在检测食品或药物工业中的许多不同液体
样本。将大约100 ml的液体样本(假定包含微生物)通过图4、 5和
6中显示的装置过滤。液体容易地通过黑色过滤器(孔径为0.2微米，
纤维素质或硝酸纤维素质的)，但细胞在过滤器表面上的通道的底部被
捕获。在松开该装置后，移走多孔盘并用预先充填有4_曱基磷酸伞形
酯和4-甲基醋酸伞形酯(各自0. lml，浓度0. 5 mg/ml)的琼脂盘替代。
这些发荧光底物的混合物保证所有活细胞将被发现，因为两种底物对 应于存在于所有活细胞中的大组酶-酯酶和磷酸酶。来自包含称为发荧
光底物的分子的琼脂块的液体在数秒钟内充满所有微通道。将装置(在 一些通道中具有微生物细胞)置于保温箱(温度40-45℃)中进行 20-30分钟。在温育后，将装置置于具有大约300-MOnm的激发光和
大约420-480 nm的荧光的荧光显微镜下。可通过明亮的蓝色荧光(与 黑暗的"空"微通道相比)容易地区分包含活细胞的微通道。甚至可 在30-40分钟内可靠地发现100ml中的一个单个的活细胞，而通过常 规的在佩特里细菌培养皿上培养的方法则需要3-5天。
实施例2
样本中大肠杆菌0: 157的鉴定 使用白色硝酸纤维素过滤器和无色微通道板将100 ml液体样本通 过装置过滤。将大约2ml标准的针对大肠杆功0: 157抗原的与辣根过 氧化物酶(HRP)缀合的抗体加入装置，然后在数分钟内 一部分一部分緩 慢地通过装置过滤；如果在一些通道中存在细胞，那么缀合物(Ab+HRP) 将附着至大肠杆菌0: 157的表面；此后，将50 ml的蒸馏水通过装置 过滤以洗去剩余的缀合物。将包含3， 3\ 5， 5'-四甲基联苯胺的溶液 的琼脂块加入装置以取代过滤器的多孔支持物。在40。 C下温育35-40
分钟。温育后，将具有过滤器的装置置于光学显微镜(放大倍数-xioo)下。包含大肠杆菌0: 157的微通道显示为蓝色的点。其他微通道显示 为白色的点。使用该方法和装置甚至可在少于1小时内发现100 ml 中的一个细胞。常规方法需要在佩特里细菌培养皿上进行至少24-48 小时的初步培养期。流式细胞计量术使得微生物学家能够实际上在其 刚通过检测区中的激光束后立即发现用抗体+荧光色素着色的一个细 胞；然而，100 ml样本通过10微米检测区的管口需要许多小时。流 式细胞仪的价格为大约$100， 000。 PCR在大约3-4小时内达到相同的 结果，但其涉及复杂和昂贵的技术。此外，不同样本的混合物的PCR 分析的可靠性不是十分的好。
实施例3
通过包被的磁性颗粒进行的检测和鉴定 借助于磁性颗粒进行的样本中细菌、病毒和生物分子的检测和鉴 定由几个阶段组成。第一阶段向假定包含被检测的生物体或生物分
子的样本中加入被抗体包被的磁性颗粒。在该阶段，通过Ab-Ag相互作 用将目的物附着至磁性颗粒。第二阶段将包含与其他颗粒的混合物 一起的磁性颗粒的液体通过装置(图IO)。通过磁场将磁性颗粒在微通 道中分离，而其他颗粒通过输出通道流出。第三阶段抗体-酶缀合物 通过微通道的阵列，然后附着至捕获在磁性颗粒上的抗原细菌、病 毒或生物分子。第四阶段用透明的过滤器的多孔支持物替代磁铁并 用蒸馏水洗去过剩的缀合物。第五阶段移走用于过滤器的多孔支持 物，然后加入包含对应缀合物的酶的人工底物的琼脂块。第六和第七 阶段在中35-45° C下温育装置15-45分钟(取决于缀合物和目的物)， 和计数着色的或荧光(取决于形式)微通道。 一些微通道中的颜色或 荧光表示在第一阶段附着至磁性颗粒的目的物的存在。该方法对所有 生物目的物例如细胞、病毒和生物分子通常是通用的。 一些目的物可 具有如此少量的抗原位以至于附着的酶(指示剂分子)不能达到在显 微镜(光学或荧光)下的可检测浓度。该缺点可通过使用更小的微通 道和/或启用更复杂的激发光源(微小UV激光)和光电倍增管(影像增 强器)代替视觉检测来改进。
权利要求
1.用于微生物的检测和鉴定而无需初步培养的装置，该装置通过将微生物沉积在小尺寸(直径1-30μm；长度100-1000μm；体积1000-300,000μk3)的微通道并以快速建立可检测的指示剂物质浓度提供酶或酶免疫检测，该装置包括附着至过滤材料的微通道板；被压向过滤器的液体和气体透明支持物和支持所有结构的支架；该支持物转换成充满人造底物的琼脂块，所述底物通过毛细管作用充满微通道板的所有微通道并在包含微生物的微通道中开始显色或荧光反应。
2. 权利要求l的装置，其中为了在光学显微镜下使光通过装置和 使着色的微通道更明显，所述微通道板是无色的并且过滤材料是无色或 白色的。
3. 权利要求l的装置，其中当荧光分子在含有微生物的微通道中 产生和将荧光显微镜用于检测微通道中的荧光时，为了限制背景荧光， 所述微通道板和过滤器是黑色的。
4. 权利要求l的装置，其中微通道板和过滤器是黑色的或无色的 或白色的，但为了沉积磁性颗粒，用磁铁取代用于过滤器的透明支持物， 所述磁性颗粒通过抗体与通过抗体-抗原相互作用附着至所述抗体的细 胞、病毒或生物分子和抗原(细胞、病毒或生物分子)结合。
5. 权利要求l的装置，其中用于进行显色或荧光反应的微通道板 用于影像增强器的微通道玻璃板，其在通道与板表面之间有90°角度， 并且微通道的体积在1000-300， 000 ni^的范围内。
6. 权利要求l的装置，其中用于贮存人造底物和将其转移至微通 道的物质可以是能够保存其中溶解有分子的液体并将其转移至微通道的凝胶(琼脂糖、明胶、聚丙烯酰胺、硅胶)、纸和多孔材料。
全文摘要
本发明描述了由微通道板、过滤器和在方法进行期间被纯琼脂块取代的用于过滤器的多孔支持物、和支持结构元件组成的装置。该装置希望用于微生物的快速检测和/或鉴定。通过在长的(直径/长度＝1/10-1/100)、圆柱状、平行的、两侧开口并且一侧附着至过滤器的微通道中过滤来捕获微生物。微通道板安装有多个微通道(各通道可能的直径＝1-30μm，长度100-1000μm，和每平方厘米上的数目为100,000-1,000,000个)。将具有在过滤器的表面上被捕获的细胞的微通道板附着至人造底物的琼脂块，从而使人造底物的分子充满所有微通道。捕获的细胞从人造底物中产生着色的分子或荧光分子。这些分子被收集在微通道的非常小的体积内。微通道的极其小的体积(毫升的1/25百万分之一)使其可在极短的时间(数分钟)内收集可检测浓度的着色或荧光物质。通过酶-人造底物方法甚至可检测来自过滤样本中的一个细胞和/或通过酶免疫测定法进行鉴定。
文档编号C12Q1/04GK101203617SQ200680022162
公开日2008年6月18日 申请日期2006年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者S·加津科 申请人:纳诺洛吉克斯公司