核酸的提取方法

专利名称：核酸的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从生物材料中提取核酸的方法。
技术背景核酸的提取方法主要分为两种，即在溶液状态下进行提取的方法 以及固体材料介入的方法，在后一种方法中，通过使含有核酸的溶液 与该固体材料接触而使得所述核酸被吸附，并对所述核酸进行洗涤， 然后再使所述核酸解吸附。在溶液状态下进行提取核酸的方法中，最早使用的提取方法是通 过将经乙醇沉淀后的核酸粘着在玻璃棒上来进行的。这种方法虽然非 常方便，但是在产率和纯度方面存在较大的问题。作为改善上述问题的方法，例如在提取RNA时，已知有下列方 法P. D. Siebert禾口 A. Chenchik在Nucleic Acids Res., 21, 2019-2020 (1993)中所描述的AGPC (酸胍-酚-氯仿)法，在该方法中，通过加入 异硫氰酸胍使细胞裂解，然后在酸性条件下使用苯酚来除去共存的 DNA;以及胍-氯化铯离心方法，该方法利用了 RNA的浮游密度高于 DNA和蛋白质。然而，这些方法有许多缺点，例如需要使用有毒的 有机化合物(例如苯酚和氯仿)，难以回收分子量较小的RNA，需 要复杂的操作以及需要熟练的技术来进行精确的提取。作为改善所述这些缺点的方法，已经开发出这样的方法，其中通过使用能够抑制核酸酶或类似的酶(其能够促进核酸的降解)的硫氰 酸胍或类似的离液盐来使细胞裂解、并向其中加入乙醇，从而制备出 裂解物溶液；使该裂解物溶液与能够吸附核酸的二氧化硅或类似的固 体材料接触；对该材料进行洗涤；然后使核酸解吸附(R.Boom等， Journal of Clinical Microbiology, 28， 495-503 (1990))。作为另外一种方法，已经开发出利用磁性二氧化硅颗粒的核酸提取方法，并且对该方法的反应效率和洗涤效率进行了改进。此外，己经开发出利用多孔膜的核酸提取方法(JP-A-2003-128691)，这样可以通过简便的方法在短时间内获得高纯度的核酸。发明内容因此，本发明的目的是提供一种分离和纯化核酸的方法，在该方 法中，分析物中的核酸被固相的表面所吸附，然后通过洗涤等步骤使 该核酸解吸附。本发明的另一个目的是提供一种利用固相来分离和纯 化核酸的方法，该方法具有优异的分离性能和良好的洗涤效率，并且 容易操作，而且采用该方法能够大规模生产出具有基本上相同的分离 性能的物质，此外，本发明的另一个目的是提供一种适用于实施所述 方法的核酸分离纯化单元。本发明的另外一个目的是通过使用无需特 殊技术、复杂操作和特殊装置的小型装置来方便快捷地分离和纯化核酸。本发明的再一个目的是在进行提取操作时通过改善堵塞来实现在 保持高收率和高纯度的同时改善裂解物溶液和洗涤液的穿过速率。本发明的目的在于通过以下方法来分离和纯化核酸，所述方法为 使生物材料裂解；并使该生物材料中所含的核酸成分与容器接触，所 述容器是通过将诸如多孔膜之类的固体材料固定在容器(例如柱)中 制备而成的。本发明涉及可以用于以下条件的方法，所述条件为可以 使裂解物溶液和洗涤液的穿过时间縮短，同时，可以使在常规方法中 由于发生堵塞而不能穿过的细胞种类和细胞个数在不发生堵塞的条 件下穿过。为了开发出这样的方法，使用分散介质(特别是磷酸盐缓 冲液或Bis-Tris缓冲液)对以下多种条件进行试验，所述条件例如有 在具有使生物材料发生裂解的作用的裂解液中的表面活性剂和离液 盐的浓度；在加入裂解液之后进行的移液操作；在加入水溶性有机溶 剂之后进行的搅拌操作；其中密封有固体材料的柱，例如通过将多孔 膜密封于具有两个开口的容器中而制得的核酸分离纯化柱；密封于所 述柱中的膜的孔径，最后发现通过联合使用所述的这些条件可以达到 上文所述的目的，由此完成本发明。即，本发明由以下内容构成。 (1) 一种核酸的提取方法，该方法包括(a) 通过以下步骤(i)或(ii)制备含有溶液的生物材料步骤(i)，制备含有磷酸盐缓冲液或Bis-Tris (N，N-双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)缓冲液的生物材料；或步骤(ii)，用Bis-Tris缓冲液替换生物材料中所含有的 缓冲液；(b) 通过使所述的生物材料与裂解液接触来使该生物材料溶解， 并溶出该生物材料中所含有的核酸；(c) 通过向由步骤(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水 溶性有机溶剂来制备裂解物溶液；(d) 通过使所述的裂解物溶液与固体材料接触来使得该裂解物 溶液中所含有的核酸被所述的固体材料吸附；(e) 洗掉残留在所述的固体材料中的除了待提取的核酸之外的 杂质、和裂解液；以及(f) 通过回收液使被吸附的核酸从所述固体材料上解吸附。(2) 如上述(1)所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(a)中的所述溶液为分散介质。(3) 如上述(1)或(2)所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(a)中的所述溶液的浓度为0.01摩尔/升至10摩尔/升、pH为3至9。(4) 如上述(1)至(3)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(b)中的所述裂解液含有离液盐。(5) 如上述(4)所述的核酸提取方法， 其中所述离液盐的浓度为0.1摩尔/升至10摩尔/升。(6) 如上述(1)至(5)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(b)中的所述裂解液含有浓度为小于等于50体积%的水溶性有机溶剂。(7) 如上述(6)所述的核酸提取方法， 其中所述裂解液中所含有的所述水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇。(8) 如上述(1)至(7)中任意一项所述的核酸提取方法，其中所述步骤(b)中的所述裂解液含有表面活性剂。(9) 如上述(8)所述的核酸提取方法， 其中所述裂解液中所含有的所述表面活性剂的浓度为0.001质量%至30质量％。(10) 如上述(1)至(9)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(b)中在加入所述的裂解液之后进行至少一次的移液操作。(11) 如上述(1)至(10)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(b)中在加入所述的裂解液之后或在所述的移液操作之后再进行搅拌操作。(12) 如上述(1)至(11)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(c)中的所述裂解物溶液是通过以下过程制备的，所述过程为向所述的含核酸的裂解液中加入水溶性有机溶剂，使得所 述的裂解物溶液含有浓度为10体积％至60体积％的水溶性有机溶剂。(13) 如上述(12)所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(c)中使用的所述的水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇。(14) 如上述(1)至(13)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(c)中在加入所述的水溶性有机溶剂之后进行至少一次的移液操作或搅拌操作。(15) 如上述(14)所述的核酸提取方法， 其中搅拌时间为0.1秒至600秒。(16) 如上述(14)或(15)所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(c)中在加入所述的水溶性有机溶剂以及进行搅拌操作或移液操作之后，进一步进行移液操作或搅拌操作。(17) 如上述(16)所述的核酸提取方法， 其中搅拌时间为0.1秒至600秒。(18) 如上述(1)至(17)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(f)中所述回收液的浸泡时间为0.1秒至1,60010(19) 如上述(1)至(18)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中当细胞的数目为小于等于500,000个时，所用的所述裂解物溶液的液体量为小于等于800 nL。(20) 如上述(1)至(19)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中当细胞的数目为大于等于500,000个时，所用的所述裂解物溶液的液体量为大于等于300 pL。(21) 如上述(1)至(20)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(d)中所述固体材料为其表面具有羟基的固体材料。(22) 如上述(1)至(21)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在柱中保持有所述的固体材料的容器被用于步骤(d)中。(23) 如上述(1)至(22)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(d)中，将所述的裂解物溶液与其中预先使含有离液盐的溶液穿过的所述的固体材料接触。(24) 如上述(1)至(23)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中通过将所述步骤(c)中制得的所述裂解物溶液注入两个或多个容器中来进行提取操作。(25) 如上述(1)至(24)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中向一个柱中两次或更多次注入在所述步骤(c)中制得的所述裂解物溶液。(26) 如上述(1)至(25)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(d)、所述步骤(e)和所述步骤(f)中，通过改变压力或通过离心使所述的裂解物溶液、所述的洗涤液和所述的 回收液中的至少一种与所述的固体材料接触。(27) 如上述(1)至(26)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述核酸是DNA、 RNA、 mRNA、质粒或它们的混合物中的一者。(28) 如上述(1)至(27)中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述的生物材料是经培养的细胞、动物细胞、动物组织、植物细胞、植物组织、病毒、细菌、真菌或核酸。附图简要说明

图1是示出当含有PBS的颗粒状HL60细胞的PBS缓冲液被0.5 摩尔/升的Bis-Tris缓冲液代替时所需的穿过时间的表；图2是示出分散介质的种类和体积与RNA回收量和穿过时间之 间的关系的图。在各缓冲液名称的旁边所示出的数值是分散液中使用 的缓冲液的液体体积(单位为pL) 。 PBS为含有137毫摩尔/升的氯 化钠、2.7毫摩尔/升的氯化钾、10毫摩尔/升的磷酸氢二钠和2毫摩 尔/升的磷酸二氢钾的溶液；图3是示出裂解物和洗涤液1的穿过时间和RNA回收量相对于 浓度为0.5摩尔/升的Bis-Tris缓冲液(pH6.5)所绘制的曲线的图；图4是示出裂解液的种类与裂解物和洗涤液1的穿过时间以及 RNA的回收量之间的关系的图；图5是示出硫氰酸胍的浓度与RNA的回收量之间的关系的图；图6是示出硫氰酸胍的浓度与洗涤液的穿过时间之间的关系的图；图7是示出裂解物溶液的体积与裂解物和洗涤液1的穿过时间以 及RNA的回收量之间的关系的图；图8是示出裂解液中乙醇的量与裂解物、洗涤液1和洗涤液2的 穿过时间之间的关系的图；图9是示出裂解液中乙醇的量与使用每种回收液体积后的RNA 回收量之间的关系的图。在右侧示出的100 1iL至700 iiL的数值是当 向一个提取柱中分次每次加入100 iaL份的回收液后的总液体体积；图10是示出裂解物中乙醇的浓度与RNA回收量之间的关系的图；图11是示出加入乙醇后的搅拌时间与裂解物、洗涤液1和洗涤 液2的穿过时间之间的关系的图；图12是示出加入乙醇后的搅拌时间与RNA回收量之间的关系的 图。在右侧示出的100pL至300 的数值是当向一个提取柱中分次 每次加入100 ^L份的回收液后的总液体体积；图13是示出所述膜的孔径与裂解物、洗涤液1和洗涤液2的穿过时间之间的关系的图；图14是示出所述膜的孔径与RNA回收量之间的关系的图；图15是示出裂解物溶液的体积与回收量之间的关系的图；以及图16是示出当预先用裂解液对固相进行涂敷时核酸回收量的依赖性的表。本发明的最佳实施方式当从细胞中分离和纯化生物材料(例如核酸成分)时，通过使用 含有离液盐等的裂解液来裂解细胞、并向其中加入水溶性有机溶剂而 制得裂解物溶液，当裂解液中所溶解的核酸发生凝聚时，由除核酸以 外的物质所衍生的成分也会发生凝聚，在进行所述的分离纯化过程 中，含有这些凝聚物的裂解物溶液在穿过诸如多孔膜之类的固体材料 时，这些成分会堵塞多孔膜的孔或沉积在孔表面上，这样使得裂解物 溶液和洗涤液的穿过时间延长。结果，当堵塞成分较多时，例如待处 理的细胞的数量较大时，发生堵塞的可能性变大。根据本发明，通过 对裂解物溶液的制备方法、提取方法、洗涤方法和核酸回收方法进行 各种研究而解决这些问题。本发明的核酸提取方法至少包括以下步骤(a)至(f): 步骤(a)，使用诸如缓冲液之类的分散介质使生物材料分散(下文 也称为"分散步骤")，步骤(b)，通过使生物材料与裂解液接触使生物材料溶解，并溶出 生物材料中所含有的核酸(下文也称为"溶解步骤")， 步骤(c)，通过向含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有机溶剂来 制备裂解物溶液(下文也称为"裂解步骤")，步骤(d)，通过使裂解物溶液与固体材料接触而使得裂解液中所含 有的核酸被该固体材料吸附(下文也称为"吸附步骤")， 步骤(e)，在保持核酸被吸附的状态下使用洗漆液来洗漆所述的固 体材料(下文也称为"洗涤步骤")，步骤(f)，使用回收液使核酸从固体材料上解吸附，并将其排放到上文所述的提取柱容器的外部(下文也称为"回收步骤")。关于本文中所用的术语"堵塞"，以下情况可称为堵塞裂解物溶液或洗涤液的穿过速率变为0;或者是裂解物溶液或洗涤液的穿过 速率会使所述操作达到某一阈值或更大，例如当穿过速率使得穿过所 需的时间为120秒或更长时。当从生物材料中提取核酸时，优选的是将该生物材料预先分散于 合适的分散介质中。在这种情况下，当使用粒状细胞时，这些细胞在 多数情况下是被冻结的，所以为了改善分散性，优选的是将这些细胞 解冻。关于分散介质的种类，可以使用任何物质，只要使由于渗透压的 差异而发生的生物材料的破裂和收縮达到最小程度并且所述物质可 以分散细胞即可。作为这种溶液，可以列举(例如)缓冲液。作为缓冲剂，可以列举通常使用的pH缓冲剂(缓冲液)。特别 是，生物化学用途的pH缓冲剂是优选的。本发明人经过大量研究结 果发现，在多种缓冲液中，Bis-Tris (N，N-双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲 基)甲垸)缓冲液的穿过时间短并且发生堵塞的可能性低，因此 Bis-Tris缓冲液适合使用。尽管对分散介质的量没有特别的限定，但是优选的是分散介质的 用量随着细胞数量的增加而增加。然而，当受到裂解物溶液的量的限 制时，离液盐(其具有使裂解物中的生物材料成分(例如细胞)发生裂 解的能力，而且还具有抑制核酸酶(例如核糖核酸酶)的作用)的浓度 或量变低，因此，生物材料不能够被充分溶解的可能性增大，并且由 于离液盐所具有的抑制核酸酶(其具有降解RNA或类似核酸的作用) 的活性的作用没有得到充分的发挥，所以回收量降低的可能性也增 大。因此，优选的是分散介质的量要尽可能的少。另一方面，当不受 到裂解物溶液的量的限制时，可以增加分散介质的量，但是当分散介 质的量增大时，为了使离液盐的浓度保持在某一水平或更高，需要增 加裂解物溶液的量，并且裂解物溶液的量的增大会导致穿过时间增 长，特别是延长了裂解物溶液的穿过时间，所以不必要地增加裂解物 溶液的量是不优选的。因此，优选的是，本发明中使用的分散介质的量优选为裂解物溶液的量的80体积％或更少、更优选为50体积％或 更少、最优选为20体积％或更少。优选的是，所使用的分散介质的浓度可以使细胞不会由于受到渗 透压等的作用而完全分解或部分分解。分散介质的浓度会对裂解物溶 液和洗涤液的穿过时间产生影响。例如，当Bis-Tris缓冲液(pH6.5) 被用作分散介质并且液体体积为30 时，当该分散介质的浓度较低 时，裂解物溶液和洗涤液的穿过时间会延长。当分散介质的浓度较高 时，可能发生这样的情况细胞发生部分裂解，细胞内的核酸、蛋白 质等被溶出，核酸在溶出的核酸酶等的作用下被降解，因此导致所关 注的核酸的回收量降低。基于此，根据本发明，分散介质的浓度优选 为大于等于0.01摩尔/升且小于等于10摩尔/升、更优选为大于等于 0.1摩尔/升且小于等于1摩尔/升。分散介质的pH优选为3至9、更 优选为5.5至8.5。可以根据细胞的数量和细胞的种类来调节分散介质的量(液体体 积)。例如，在使用HL60细胞并且当该细胞的数量小于等于5,000,000 时，为了减轻使用者的负荷，可以在不使用分散介质的条件下进行提 取，但是，在多数情况下，使用分散介质时的重复性好并且可以得到 高回收量的核酸，因此优选的是使用分散介质。当细胞的数量为 l，OOO,OOO或更多时，优选的是使用分散介质。当不使用分散介质或 只使用了少量的分散介质时，核酸的回收量较低，并且在某些情况下 核酸的回收量发生波动的可能性较大。据信，产生这种结果的原因是 因为这些细胞形成了由未溶解的材料而构成的结构，在该结构中，由 于细胞的密度较高，所加入的裂解液不能使细胞充分裂解，结果，待 提取的核酸或类似的成分被结合到所述的结构中。基于以上所述，根 据本发明，优选使用分散介质，当细胞的数量较大时特别优选使用分 散介质。当制备粒状细胞时，通过尽可能地除去常用的PBS (磷酸盐缓冲 盐水)并将PBS更换为Bis-Tris缓冲液、或者通过向含有PBS的粒 状细胞中加入Bis-Tris缓冲液而使得在提取时裂解物溶液和洗涤液的 穿过时间极大地縮短。基于此，根据本发明，可以通过除去能够引起15穿过时间延长的PBS等类似的分散介质或者成分、然后向其中加入其 它的分散介质的操作来使细胞被再分散。对裂解液中的离液盐没有特别限定，可以使用任何公知的离液 盐。作为离液盐，可以使用胍盐、异硫氰酸钠、碘化钠、碘化钾、尿 素、溴化钠、溴化钾、溴化钙、异硫氰酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化 铵等。在这些物质中，优选胍盐。作为胍盐，可以例举盐酸胍、异硫 氰酸胍和胍的硫氰酸盐(硫氰酸胍)，在这些胍盐中，优选盐酸胍或 硫氰酸胍。这些盐可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组 合使用。本发明人经过大量研究结果发现，对离液盐的浓度没有特别的限 定，只要该浓度可以使细胞充分裂解并且可以使所制备的裂解物溶液 和洗涤液的穿过时间縮短即可。由低浓度的离液盐制备的裂解液不能 使细胞裂解，虽然裂解物溶液和洗涤液的穿过时间显著加快，但是完 全不能回收核酸。关于穿过时间得以加快的原因，据信，是因为部分 裂解的细胞不能进入到固体材料的孔中，只能积聚在固体材料的上 面。此外，这也使得能够降解核酸的酶从部分裂解的生物材料中溶出 而使核酸发生降解、从而使回收量降低的可能性增大。基于此，优选 的是裂解液中使用的离液盐的浓度较高。当离液盐的浓度增大时，生物材料被逐渐降解，伴随而来的是核 酸的回收量增大，而裂解物溶液和洗涤液的穿过时间也显著延长。当 离液盐的浓度进一步增大时，至少通过显微镜的观察可以发现细胞被 完全裂解，裂解物溶液和洗涤液的穿过时间縮短，核酸的回收量也显者提咼。当进一步增大离液盐的浓度时，裂解物溶液和洗涤液的穿过时间 不会明显縮短并且核酸的回收量几乎保持不变。然而，含有离液盐的 裂解液在水中的溶解度降低，这样制备裂解液变得困难，并且会产生 在低温时离液盐从所制备的裂解液中沉淀出来的问题。基于以上所述，优选的是离液盐的浓度较高。但是，考虑到制备 裂解液的容易程度和离液盐在低温时发生沉淀的情况，离液盐的浓度优选为0.1摩尔/升到10摩尔/升、更优选为0.5摩尔/升至5摩尔/升、最优选为3摩尔/升至4.5摩尔/升。当裂解物溶液的pH较低时，裂解物溶液的穿过时间和洗涤液的 穿过时间变短。作为控制裂解物溶液的pH的有用的方法的例子包括以下方法使用分散介质中所用的缓冲液来控制pH的方法；通过向 裂解液中加入缓冲液来控制pH的方法；在制备裂解物溶液时向水溶 性有机溶剂中加入缓冲液的方法；向洗涤液中加入缓冲液的方法；以 及不预先将缓冲液加入到上述这些溶液中而是先制备缓冲液然后再 将其加入的方法。作为可以使用的缓冲剂，可以例举常用的pH缓冲剂(缓冲液)。 优选的是，可以例举用于生物化学用途的pH缓冲剂。作为这种缓冲 剂，可以使用Bis-Tris缓冲液。上述核酸溶解试剂中的缓冲液的浓度优选为1毫摩尔/升至500 毫摩尔/升，考虑到裂解液制备后的pH，优选使用pH为3至8、更优 选pH为4至7、进一步优选pH为5至7的那些缓冲液。优选的是裂解液中含有核酸稳定剂。本文所用的术语"核酸稳定剂"是指可以影响核酸在分析物中稳定存在的试剂。这种核酸稳定剂还包括这样的试剂，该试剂可以影响核酸本身的稳定存在并且还可以通过降低或完全抑制核酸的不稳定性(例如通过降低或完全抑制可以降解核酸的核酸酶或类似的核酸降解酶的降解作用)来抑制核酸的降解。优选的是使该核酸稳定剂与选自有机溶剂、离液盐、表面活性剂、缓冲液和消泡剂中的一种或多种物质共存。作为具有能够使核酸酶的活性失活作用的核酸稳定剂，可以使用常用作还原剂的化合物。作为还原剂，可以例举氢、碘化氢、硫化 氢、氢化铝锂、硼氢化钠等氢化物；碱金属、镁、钙、铝、锌等高正 电性金属，或它们的汞合金；醛类、糖类、甲酸、草酸等有机氧化物； 以及巯基化合物等。在这些化合物中，巯基化合物是特别优选的。作 为巯基化合物，可以例举N-乙酰基半胱氨酸、巯基乙醇和垸基硫醇 等。这些巯基化合物可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种 组合使用。优选的是，核酸稳定剂在裂解液中的浓度为0.01质量％到20质量％、更优选为0.03质量％到15质量％。巯基化合物在裂解性化合物 中的浓度优选为0.01质量％到20质量％、更优选为0.05质量％到15 质量％、最优选为0.05质量％到5质量％。(在本说明书中，质量比 等于重量比。)此外，随着巯基化合物在裂解液中浓度的增加，其还具有縮短裂 解物溶液和洗涤液的穿过时间的作用。然而，从工作者的工作环境的 观点来看，不能够使用浓度过高的巯基化合物。此外，也是从上述这 些方面来考虑，巯基化合物在裂解性化合物中的浓度优选为0.01质量 %至20质量％、更优选为0.05质量％至15质量％、最优选为0.05质 量％至5质量％。本发明人发现，通过向裂解液中加入表面活性剂可以縮短裂解物 溶液的穿过时间和洗涤液的穿过时间。作为待加入的表面活性剂，可 以提及(例如)非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和两性离 子型表面活性剂。根据本发明，可优选使用非离子型表面活性剂和阳离子型表面活 性剂。作为非离子型表面活性剂，可以举例为聚氧乙烯烷基苯基醚类表 面活性剂、聚氧乙烯烷基醚类表面活性剂、脂肪酸链烷醇酰胺，在这 些表面活性剂中，聚氧乙烯烷基醚类表面活性剂是优选的。在聚氧乙 烯(POE)垸基醚类表面活性剂中，更优选的是POE癸基醚、POE 月桂基醚、POE十三垸基醚、POE亚垸基癸醚、POE脱水山梨糖醇 单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂 酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐四油酸酯、POE烷基胺和POE炔二醇。作为阳离子表面活性剂，可以举例为十六垸基三甲基溴化铵、十 二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵和氯化十六烷基吡啶 镜。对表面活性剂的浓度进行大量的研究，结果发现，随着表面活性 剂浓度的增加，裂解物溶液的穿过时间和洗涤液的穿过时间縮短。但 是，当表面活性剂的浓度增加过高时，根据离液盐的种类，它会引起 核酸的回收量降低，并且发现会产生出现泡沫的问题。基于这样的结果，根据本发明，优选的是，表面活性剂在溶液中的浓度优选为0.001质量％至30质量％、特别优选为0.1质量％至7.5质量％。此外，由于在使用表面活性剂时裂解物溶液容易形成泡沫，所以可以不使用表 面活性剂，或也可以使用消泡剂，条件是为了易于操作即使不使用表 面活性剂也可以获得充分的性能。消泡剂的例子包括硅类消泡剂(例如硅油、二甲基聚硅氧垸、 有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物等)、醇类消泡剂(例如 炔二醇、庚醇、乙基己醇、高级醇和聚氧化亚垸基乙二醇等)、醚类消泡剂(例如庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇等)、油脂类消泡剂(例如动物油或植物油等)、脂肪酸类消泡剂(例如硬脂酸、 油酸、棕榈酸等)、金属皂类消泡剂(例如硬脂酸铝、硬脂酸钙等)、 脂肪酸酯类消泡剂(例如天然蜡、磷酸三丁酯等)、磷酸盐酯类消泡 剂(例如磷酸辛酯钠等)、胺类消泡剂(例如二戊胺等)、酰胺类消 泡剂(例如硬脂酸酰胺等)和其它消泡剂(例如硫酸铁、矾土等)。 这些消泡剂可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组合使 用。特别优选的是，将硅类消泡剂和醇类消泡剂这两种成分组合在一 起使用。优选的是，消泡剂在裂解液中的浓度为0.1质量％到10质量％。通过将裂解液与水溶性有机溶剂混合可以显著地縮短洗涤液的 穿过时间。本文所用的术语"水溶性有机溶剂"是指在溶解于水中的状态下其浓度为小于等于100%的水溶性有机溶剂。本发明人经过大量的研究结果确定了水溶性有机溶剂的浓度，在该浓度下，可以有效 地縮短裂解物溶液和洗涤液的穿过时间、通过一次洗脱步骤就可以从 提取膜上洗脱下来更多量的核酸，以及可以提高核酸的回收量。作为加入水溶性有机溶剂的益处，除了上述的效果之外，还可以 提及裂解液中所含有的各种试剂的溶解性。此外，还可以提及通过增 加裂解液的体积使裂解物溶液和洗涤液的穿过时间縮短以及使核酸 回收量提高。在本发明这样的使用提取柱的提取体系的情况下，提取 柱的尺寸是固定的，所以可施加到提取柱中的裂解物溶液的最大体积 取决于提取柱的尺寸。这意味着为了在超出由所选择的提取柱的尺寸计算得到的液体的最大施加体积(即，裂解物溶液体积)时进行提取 操作，必须要更换更大一些的提取柱，因此存在需要对提取器重新进 行设计的可能性。为了解决这些问题，本发明人进行了大量研究，结 果发现了这样的方法作为本发明的裂解物溶液的制备方法，所述方法 为将裂解液加入到生物材料中，然后向其中加入水溶性有机溶剂，在 该方法中，所述的水溶性有机溶剂的液体体积被尽可能地减少，并且 水溶性有机溶剂的液体体积被减少后所得到的液体体积被用于裂解 液的液体体积增加。此外，就这一点而言，将裂解液与水溶性有机溶 剂混合是重要的。对裂解液中水溶性有机溶剂的浓度进行大量研究，结果发现，随 着水溶性有机溶剂的量增加，裂解物溶液的穿过时间和洗涤液的穿过 时间縮短，并且核酸的回收量也提高。然而，由于随着裂解液中水溶 性有机溶剂浓度的增加，在核酸回收步骤中通过一次洗脱操作而被洗 脱下来的核酸的量减少，所以必须进行多次提取操作以得到所需量的 核酸。因此，在裂解液中使用水溶性有机溶剂的情况下，由于当裂解液 中醇的浓度过高时会使核酸的回收效率降低，所以优选的是，裂解液中醇的浓度优选为小于等于70体积％、更优选为小于等于50体积％、 特别优选为小于等于25体积％。关于加入到裂解液中的水溶性有机溶剂的种类，可以举例为丙 酮、醇类和二甲基甲酰胺等。在这些物质中，醇类是优选的。所述醇 类可以是伯醇、仲醇和叔醇中的任意一种。特别是，可以更优选使用 甲醇、乙醇、丙醇及其异构体、丁醇及其异构体。在这些醇中，就减 少环境的负荷和毒性而言，乙醇是特别优选的。这些水溶性有机溶剂 可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组合使用。此外，当裂解物溶液和洗涤液的穿过时间足够快时，可以不加入 水溶性有机溶剂。作为这种情况的例子，例如可以例举只有少量细胞 被处理时的情况。在加入裂解液之前、在加入裂解液之后或在制备裂解物溶液之后 的任意一个步骤中可以对分析物进行均化处理。据信，通过进行均化处理可以改善堵塞和縮短穿过时间，这是因为使穿过时间延迟的成分 (即，造成堵塞的物质)由此被碎化。进行均化处理时可以采用下列 方式超声波处理、使用尖锐的突出物进行的处理、采用高速搅拌进 行的处理、将分析物从微孔中挤出的处理、使用装配有针头的注射器 进行的处理、用研磨器进行处理、移液处理、使用由玻璃、不锈钢、 二氧化锆等制成的珠子进行处理的方法，或者这些处理方式的组合。 对均化方法没有特别限定。例如，在进行混合的情况下，优选的是使用搅拌装置将分析物在30 rpm至10,000 rpm下混合1秒钟至3 分钟、更优选的是在300 rpm至7,000 rpm下混合1秒钟至1分钟、 最优选的是在3,000 rpm至6,000 rpm下混合5秒钟至30秒钟。根据本发明，优选的是在加入裂解液之后进行移液操作。例如， 当处理l,OOO，OOO或更多个细胞时进行移液操作是有效的。当进行移液操作时，优选的是在使用装有裂解液的移液管加入裂解液的同时进 行移液操作。据推测，进行移液操作后的效果如下。由于分散后的细胞的密度 随着分散介质中细胞密度的增加而增加，所以具有高密度的由裂解后 的生物材料所构成的结构的部分的形成可能性增大。当形成所述结构 时，据推测，所述结构中存在的核酸难以被释放到裂解液和裂解物溶 液中，与此同时，所述结构中离液盐与生物材料的浓度比降低，这样 便难以对生物材料进行裂解，并且对能够降解核酸的酶的活性的抑制 作用也被降低，这样就使得所释放出来的核酸被降解的可能性增大， 由此回收量降低而且部分降解后的细胞会造成多孔膜的堵塞。加入裂 解液之后即刻进行移液操作的原因在于在形成半裂解的生物材料之 前通过移液或搅拌操作来降低半裂解的细胞的细胞密度，或者即使形 成了半裂解的生物材料，也可以通过移液操作来分散这种结构。此外， 据推测，当在所形成的半裂解结构的状态中出现不均一性时，这种不 均匀性会对核酸回收量的不均一性以及裂解物溶液和洗涤液的穿过 时间的不均一性产生影响。移液操作和搅拌操作还具有降低这种不均 一性的作用。基于上文所述，根据本发明，优选的是当细胞数量较多时进行移液操作，并且虽然对移液操作的次数没有特别限定，但是优选进行至 少1次以上50次以下、更优选进行3次以上10次以下。此外，当细胞的数量较少(例如5,000,000个或更少)时，或者当在不进行移液操作的条件下就可以获得足够快的穿过时间，并且核酸的回收量高且 稳定时，为了减轻使用者的负担和縮短提取操作的预处理时间，进行 移液操作的次数可以更少一些或者可以根本不进行移液操作。 根据本发明，优选的是对裂解液(该裂解液是通过对生物材料裂解后而制备的裂解液进行移液操作而制得的)进行搅拌操作；或者是 对生物材料裂解后而制得的裂解液进行搅拌操作。随着搅拌时间的延 长，裂解物溶液的穿过时间和洗涤液的穿过时间縮短，核酸的回收量 提高并且核酸的回收量稳定。关于搅拌时间，就浮游细胞HL60而言， 当该细胞的数量较少(例如1,000,000个或更少)时，可以通过在该 搅拌步骤之前的步骤(即，不进行搅拌只进行移液操作的步骤)来回 收核酸，或者通过进行搅拌时间为至多1分钟的搅拌来回收核酸，所 以可以不进行搅拌操作或将搅拌时间设定为1分钟或更短。将水溶性有机溶剂加入到通过上述步骤制备的裂解液中(其中通 过使生物材料裂解而使核酸溶出)，并将核酸与吸附性固体材料接触。 对所述的固体材料没有特别限定，可以使用尼龙等，但是其表面上具 有羟基的固体材料是优选的。据推测，本发明的核酸吸附机制是通过 所述的操作，使样品溶液中的核酸被固体材料的表面所吸附，特别是 被其表面上具有羟基的有机高分子化合物所吸附，或者是，在使用多 孔膜的条件下，核酸被滤膜的表面和孔所捕获和吸附。根据本发明， 对水溶性有机溶剂没有特别限定，但是优选使用醇类。醇类可以是伯 醇、仲醇和叔醇中的任意一种，并且更优选使用甲醇、乙醇、丙醇及 其异构体、丁醇及其异构体。这些水溶性有机溶剂可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组合使用。乙醇可以用作特别优选的水 溶性有机溶剂。关于待加入的水溶性有机溶剂的浓度，这样加入该溶剂，使得其 在制备裂解物溶液时的浓度变为10体积％至60体积％。当水溶性有 机溶剂的浓度低时，核酸的回收量降低。其原因可能是在裂解物溶液穿过膜时，应该保持在膜上的核酸被转移到通过液体侧中而没有结合 在膜上，因此导致核酸的回收量降低。当水溶性有机溶剂的浓度高时， 穿过时间变短，但是回收量也大幅降低。据推测，这是由于在高浓度 的水溶性有机溶剂的作用下由于凝聚使得引起堵塞的物质的尺寸变 大，结果凝聚物不能进入膜的孔内而是积聚在膜的上面，由此使得裂 解物等溶液和洗涤液能够很容易地穿过堆积物(由沉淀物形成)内的 空间。基于以上研究结果，根据本发明，在制备裂解物溶液时水溶性有 机溶剂的浓度有必要设定为10体积％至60体积％、特别优选为20体积％至40体积％。加入水溶性有机溶剂之后，优选的是进行至少一次的移液操作或 搅拌操作或者进行这两种操作。当进行搅拌操作时，可以以一个样品 接一个样品的方式对每个样品进行一次搅拌，但是为了减轻使用者的 负担，优选的是进行两次搅拌，其中第一次搅拌时是以一个分析物接 一个分析物的方式对每个分析物进行搅拌，第二次搅拌时是把所有的 分析物一起进行搅拌。当分析物的量较大时，这种操作是特别有效的。以下进行说明，例如，在对一个或多个分析物进行提取操作的情 况下，在第一次搅拌中，以一个分析物接一个分析物的方式向每个分 析物中加入水溶性有机溶剂之后即刻进行搅拌；在第二次搅拌中，将 分析物一起进行搅拌。当进行第一次搅拌时，优选的是以这样的方式 进行搅拌，所述方式为使水溶性有机溶剂与裂解液(在该裂解液中生 物材料被裂解)的接触面积尽可能最小，并且使它们的接触时间尽可 能最短。随着细胞数量的增多，所述趋势变得更明显。为了防止发生 这种现象，优选的是在加入水溶性有机溶剂之后即刻进行搅拌。关于第一次搅拌的时间，当搅拌时间延长时，裂解物溶液和洗涤 液的穿过速率变快，核酸的回收量提高，并且裂解物溶液和洗涤液的 穿过时间及核酸的回收量也稳定了。据推测，这是由于在搅拌操作的 作用下，当加入裂解液来裂解生物材料时未裂解的部分减少了，或者 加入水溶性有机溶剂后而形成的引起堵塞的物质减少了。此外，就第二次搅拌的时间而言，当搅拌时间延长时，裂解物溶液和洗涤液的穿过速率变快，核酸的回收量提高，并且裂解物溶液和 洗涤液的穿过时间及核酸的回收量也稳定了。据推测，其原因与第一 次搅拌的情况相同。
此外，随着搅拌时间的延长，通过1次溶出操作而被溶出的核酸 的量会增多。例如，就使用HL60作为所述的细胞种类而言，当细胞
的数量为10,000,000时，通过1次提取操作不能获得所需的核酸回收 量，除非将搅拌时间设定为1分钟或更长，当搅拌时间设定为l分钟 或更短时，必须进行几次溶出操作或者需要更多体积的提取液体。
对于第一次和第二次搅拌这二者而言，其搅拌时间均可以为至少 0.1秒且至多600秒钟，特别优选为至少IO秒且至多120秒钟。此外， 为了减轻使用者的负担，优选的是将第一次搅拌时间设定为较短的时 间，而将第二次搅拌时间设定为比第一次的搅拌时间长。
与搅拌操作时的情况相似，随着移液操作次数的增加，裂解物溶 液和洗涤液的穿过时间变短，并且核酸的回收量提高。
为了减轻使用者的负担，当所用的细胞的数量较少时，进行l次 搅拌操作或1次移液操作就足够了。
当细胞的数量较少时，使用更少量的裂解物溶液就可以使细胞被 充分裂解，并且也可以进行提取。当裂解物溶液的量较少时，裂解物 溶液的穿过时间变短。此外，核酸的回收量也提高。据推测，这是由 于以下原因引起的，所述原因为由于裂解物溶液中的生物材料的浓度 增大，使得核酸的浓度也增大；由于裂解物溶液中核酸凝聚物尺寸的 增大导致这些核酸凝聚物容易被多孔膜捕获。
当细胞的数量较大时，需要更多量的裂解液来使细胞充分裂解。 据推测，当裂解液的体积(即，离液盐的量)不足时，不仅细胞不能 被充分裂解，而且对核酸降解酶的抑制作用也降低，使得从生物材料 中溶出的核酸非常有可能被降解，因此回收量降低。
基于此，根据本发明，优选的是当细胞的数量为500,000或更少 时，使用800 pL或更少的裂解物溶液，当细胞的数量为500,000或更 多时，使用300 pL或更多的裂解物溶液。
优选的是，裂解物溶液的表面张力为0.05 J/n^或更低，粘度为1mPa至10,000 mPa，比重为0.8至1.2。当所述溶液的各项在所述范 围内时，可以容易地实施下一步骤，该步骤为使裂解物溶液穿过诸如 核酸吸附性多孔膜之类的固体材料来使核酸被吸附、然后除去残余 物，而这样的情况是优选的。
关于本发明的核酸吸附性多孔膜，溶液可以从其内部穿过。在这 种情况下，术语"溶液可以从其内部穿过"是指当在与多孔膜的一 面接触的空间和与该多孔膜的另一面接触的空间之间存在压力差时， 溶液可从高压空间一侧向低压空间一侧流动而穿过所述多孔膜。或者 是指当向所述多孔膜施加离心力时，溶液可以沿着离心力的方向穿 过该多孔膜。
此外，优选的是本发明的核酸吸附性多孔膜的表面上具有亲水性 基团。亲水性基团是指能与水发生相互作用的极性基团(原子团)， 并且与核酸的吸附有关的所有基团(原子团)都是合适的。关于亲水 性基团，其与水相互作用的强度为中等强度(参见由共立出版株式会 社出版的《化学大词典》中所述的术语"亲水性基团"中的"亲水性 不太强的基团")是合适的，其实例包括羟基、羧基、氰基和氧化亚 乙基。在这些基团中优选羟基。
本文所用术语"具有亲水性基团的多孔膜"是指构成多孔膜的材 料其本身具有亲水性基团的多孔膜，或者是通过对构成多孔膜的材料
进行处理或涂敷，从而引入亲水性基团的多孔膜。构成多孔膜的材料
可以是有机物或无机物。例如，可使用如下多孔膜构成多孔膜的材 料其本身是具有亲水性基团的有机材料这样的多孔膜；通过对由不具 有亲水性基团的有机材料所构成的多孔膜进行处理，从而向其中引入 亲水性基团而得到的多孔膜；通过使用具有亲水性基团的材料对由不 具有亲水性基团的有机材料所构成的多孔膜进行涂敷，从而向其中引 入亲水性基团而得到的多孔膜；构成多孔膜的材料其本身是具有亲水 性基团的无机材料这样的多孔膜；通过对由不具有亲水性基团的无机 材料所构成的多孔膜进行处理，从而向其中引入亲水性基团而得到的 多孔膜；通过使用具有亲水性基团的材料对由不具有亲水性基团的无 机材料所构成的多孔膜进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而得到的多孔膜，等等。从加工的容易性方面考虑，优选的是使用有机高分 子化合物等有机材料作为构成多孔膜的材料。
作为具有亲水性基团的材料所形成的多孔膜，可以举例为由以下
物质形成的多孔膜，所述物质有聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟 乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧 乙烯、醋酸纤维素、乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物，在这些 多孔膜中，优选使用由具有羟基的有机材料所构成的多孔膜，特别优 选的是使用由具有羟基的有机高分子所构成的多孔膜。
作为由具有羟基的有机材料构成的多孔膜，具有多糖结构的材料
是优选的，并且更优选使用由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物 构成的有机高分子多孔膜。作为乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合 物，可以优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤 维素和单醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋
酸纤维素的混合物；以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。特 别优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和 二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99:1到l:99，更优选为90:10 到50:50。
作为更优选的具有羟基的有机材料，可以举例为专利文献 JP-A-2003-128691中公开的醋酸纤维素的皂化产物。所述的醋酸纤维 素的皂化产物是指乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经过皂化 处理而获得的产物，并且优选的是使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素 的混合物的皂化产物，三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化 产物，三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化 产物，以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物。更优 选的是使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物。三醋 酸纤维素与二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99:1到1:99。 更优选的是，三醋酸纤维素与二醋酸纤维素的混合比为90:10到 50:50。在这种情况下，可以通过皂化处理的程度(皂化率)来控制 多孔膜表面上的羟基的量(密度)。
为了提高核酸分离的效率，优选的是，使羟基的量(密度)较大。优选的是，通过皂化处理而得到的有机材料的皂化率(表面皂化率) 优选为至少5%且至多100%、更优选为至少10%且至多100%。
此外，为了增加具有羟基的有机材料的表面积，优选的是，对醋 酸纤维素多孔膜进行皂化处理。
所述的多孔膜可以是其前表面与后表面彼此对称的多孔膜，但是 优选使用其前表面与后表面互不对称的多孔膜。
本文所用术语"皂化处理"是指使醋酸纤维素与皂化处理液(例 如氢氧化钠水溶液)接触。通过皂化处理，纤维素的酯类衍生物的酯 基与皂化处理液接触后被水解，从而引入羟基以形成再生纤维素。由 此制备得到的再生纤维素与原来的纤维素在结晶状态等方面是不同 的。此外，当改变皂化率时，可以通过改变氢氧化钠的浓度和处理时
间来进行皂化处理。可以通过XPS来容易地测定皂化率(例如可以 通过羰基峰的数量减少的程度来测定)。
作为向不含亲水性基团的有机材料的多孔膜中引入亲水性基团 的方法，可以将在聚合物主链或侧链上具有亲水性基团的接枝聚合物 链连接到多孔膜上。用于将接枝聚合物链连接到有机材料的多孔膜中
的方法包括以下两种即，使多孔膜与接枝聚合物链发生化学键合的 方法；以及以多孔膜作为起点，使具有可聚合双键的化合物发生聚合，
从而形成接枝聚合物链的方法。
首先，在使多孔膜与接枝聚合物链发生化学键合的方法中，使 用在聚合物的末端或侧链上具有能够与多孔膜发生反应的官能团这 样的聚合物，所述聚合物可以通过其官能团与多孔膜的官能团之间发 生化学反应而使该聚合物与多孔膜接枝。对能够与多孔膜发生反应的 官能团没有特别限定，只要它能够与多孔膜的官能团反应即可，其实
例包括垸氧基硅烷等硅垸偶联基、异氰酸酯基、氨基、羟基、羧基、 磺酸酯基、磷酸酯基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基等。 作为特别用作在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的聚合物的 化合物，可以举例为在其末端具有三垸氧基甲硅垸基的聚合物、在 其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具
有环氧基的聚合物以及在其末端具有异氰酸酯基的聚合物。对在此种
27情况下所使用的聚合物没有特别限定，只要其具有与核酸的吸附有关 的亲水性基团即可，其示例性的实例包括聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基 丙烯酸羟乙酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸 和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧乙烯等。
以多孔膜作为起始点、使具有可聚合的双键的化合物进行聚合而 形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合 法是这样一种方法通过等离子体辐射、光辐射、加热等方法，在多 孔膜表面上形成活性物质；将具有可聚合双键的化合物排布成与多孔 膜接触；并通过聚合反应将所述化合物键合到多孔膜上。用于形成与 多孔膜相连的接枝聚合物链的化合物必须同时具有含可聚合的双键 以及含与核酸的吸附有关的亲水性基团这两个特征。作为这样的化合 物，可以使用具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和 具有亲水性基团的单体中的任何一种化合物，只要其分子中具有双键 即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。作为特别有用的 具有亲水性基团的单体的示例性例子可以提及以下单体。例如，特别 优选使用的是丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、单甲基丙烯酸 甘油酯等含有羟基的单体。此外，也优选使用的是丙烯酸、甲基丙烯 酸等含有羧基的单体，或其碱金属盐和胺盐。
作为另外一种把亲水性基团引入到由不具有亲水性基团的有机 材料构成的多孔膜中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂 敷。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要其具有与核酸的吸附有关 的亲水性基团即可，但为了易于操作，有机材料的聚合物是优选的。 作为所述聚合物，可以举例为聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙 酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸和聚甲基丙 烯酸以及它们的盐、聚氧乙烯、醋酸纤维素、乙酰值各不相同的醋酸 纤维素的混合物等，在这些化合物中，优选具有多糖结构的聚合物。
此外，可以将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合 物涂敷到由不具有亲水性基团的有机材料构成的多孔膜上，然后对所 涂敷的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂 化处理。在这种情况下，优选的是皂化率为至少5%且至多100%，更优选的是皂化率为至少10%且至多100%。作为由具有亲水性基团的无机材料所构成的多孔膜，可举例为含 有二氧化硅化合物的多孔膜。作为含有二氧化硅化合物的多孔膜，可举例为玻璃滤膜。此外，也可举例为诸如日本专利No. 3058342中所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备 将能够形成双分子膜的阳离子型的两性物质的展开液在基材上展开； 通过除去液体膜中的溶剂，在基材上制成两性物质的多层双分子薄 膜；使该多层双分子薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触；然后取 出并移走所述的多层双分子薄膜。作为向由不具有亲水性基团的无机材料所构成的多孔膜中引入 亲水性基团的方法，存在着如下两种方法 一种方法是使多孔膜与具 有亲水性基团的接枝聚合物链发生化学键合；另一种方法是使用分子 内具有双键的、含有亲水性基团的单体，并以多孔膜作为起始点进行 聚合而形成接枝聚合物链。在使多孔膜与具有亲水性基团的接枝聚合物链发生化学键合时， 可向无机材料中引入能够与接枝聚合物链的末端官能团发生反应的 官能团，并且使接枝聚合物链被化学键合到该官能团上。此外，当使 用分子内具有双键的、含有亲水性基团的单体并以多孔膜作为起始点进行聚合而形成接枝聚合物链时，在具有双键的化合物进行聚合时作为起始点的官能团被引入到无机材料中。作为具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体，可以适当地使用在上文提到的向不具有亲水性基团的有机材料多孔膜中引入亲水性基团的方法中所述的具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体。作为向不具有亲水性基团的无机材料多孔膜中引入亲水性基团的另外一种方法，可以涂敷具有亲水性基团的材料。对涂敷所用的材 料没有特别限定，只要其具有与核酸吸附有关的亲水性基团即可，但 是为了易于操作，有机材料的聚合物是优选的。作为所述聚合物，可 以举例为聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧乙烯、醋酸纤维素、乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物等。 此外，还可以将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合 物涂敷于不具有亲水性基团的无机材料多孔膜上，然后对经涂敷的醋酸 纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在这种 情况下，优选的是皂化率为至少5%且至多100%，更优选的是皂化率为至少10%且至多100%。作为不具有亲水性基团的无机材料多孔膜，可以举例为由铝等 金属、玻璃、水泥、陶等陶瓷、或者新型陶瓷、硅、活性炭等加工制 成的多孔膜。优选的是，上文所述的核酸吸附性多孔膜可以使溶液从其内部穿过，并且该核酸吸附性多孔膜的厚度为10 pm到500 nm。更优选的 是，该厚度为50 !im到250 pm。为了便于洗涤和縮短裂解物溶液的 穿过时间，优选的是所述核酸吸附性多孔膜的厚度尽可能地薄。优选的是，溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜的最小孔径 为0.22pm或更大。更优选的是，最小孔径为0.5 |im或更大。此外， 优选的是使用最大孔径与最小孔径之比为大于等于2的多孔膜，从而 可得到足够的用于吸附核酸的表面积，并且几乎不会发生堵塞。更优 选的是，最大孔径与最小孔径之比为5或更大。优选的是，溶液可从其内部穿过的所述核酸吸附性多孔膜的孔隙 率为50%到95%。更优选的是，孔隙率为65%到80%。此外，优选的 是，所述核酸吸附性多孔膜的泡点为0.1 kgf/cn^到10kgf/cm2。更优 选的是，其泡点为0.2 kgf/cm2到4 kgf/cm2。优选的是，溶液可从其内部穿过的所述核酸吸附性多孔膜的压力 损失为0.1 kPa到100kPa。通过设定压力损失，在压力过高时也可获 得均匀的压力。更优选的是，压力损失为0.5 kPa到50 kPa。关于这 一点，压力损失是指使水通过100pm厚的膜时所需的最小压力。关于溶液可从其内部穿过的所述核酸吸附性多孔膜的透水量，优 选的是，在lkg/cn^的压力、25"C的条件下使水通过时，每lcm2的 膜每1分钟的透水量为lmL到5,000 mL。更优选的是，在1 kg/cm2 的压力、25。C的条件下使水通过时，每1 cr^的膜每1分钟的透水量为5 mL至(J 1,000 mL。优选的是，溶液可从其内部穿过的所述核酸吸附性多孔膜是这样 一种纤维素衍生物当将边长为5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三 氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内不溶解，但是在48小时 以内溶解。此外，也优选这样的纤维素衍生物当将边长为5mm的 正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以 内溶解，但是当将所述膜浸在5 mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物 在24小时以内不溶解。在这些纤维素衍生物中，更优选的是这样的 纤维素衍生物当将边长为5 mm的正方形多孔膜浸在5 mL三氟乙 酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内溶解，但是当将所述膜浸在5 m L 二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在2 4小时以内不溶解。当使裂解物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，为了使溶液能够与多 孔膜均匀接触，优选的是使裂解物溶液从多孔膜的一侧流到另一侧。 当使裂解物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，为了不发生堵塞，优选的 是使裂解物溶液从核酸吸附性多孔膜的较大孔径一侧穿到核酸吸附 性多孔膜的较小孔径一侧。当使裂解物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，优选的是其流速为 每平方厘米膜面积2 ^L/秒到1,500 )iL/秒，从而使溶液与多孔膜达到 合适的接触时间。当溶液与多孔膜的接触时间太短时，不能得到充分 的分离纯化效果；而当接触时间太长时，从操作性方面来说不是优选 的。更优选的是所述流速为每平方厘米膜面积5 ^L/秒到700 pL/秒。此外，所使用的溶液可以从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜可以以一层膜的方式被使用，但也可以以两层或多层膜的方式被使用。两层或多层的核酸吸附性多孔膜可以彼此相同或互不相同。两层或多层的核酸吸附性多孔膜可以是无机材料核酸吸附性多孔 膜与有机材料核酸吸附性多孔膜的组合。例如，作为这样的组合可以提及玻璃滤膜与再生纤维素多孔膜的组合。此外，两层或多层的核酸吸 附性多孔膜可以是无机材料核酸吸附性多孔膜与有机材料非核酸吸 附性多孔膜的组合。例如，作为这样的组合可以提及玻璃滤膜与尼龙 或聚砜多孔膜的组合。可优选使用这样的核酸分离纯化柱该核酸分离纯化柱在具有至 少两个开口的容器中容纳有所述的核酸吸附性多孔膜，溶液可穿过该核酸吸附性多孔膜。此外，可优选使用这样的核酸分离纯化柱该核 酸分离纯化柱在具有至少两个开口的容器中容纳有两层或多层所述 的核酸吸附性多孔膜，溶液可穿过该核酸吸附性多孔膜。在这种情况 下，在具有至少两个开口的容器中所容纳的两层或多层的核酸吸附性 多孔膜可以彼此相同或互不相同。优选的是，除了溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜以外， 所述的核酸分离纯化柱在所述的具有至少两个开口的容器中不再容 纳有其它部件。作为上述容器的材料，可以使用聚丙烯、聚苯乙烯、 聚碳酸酯、聚氯乙烯等塑料。此外，也优选使用可生物降解的材料。此 外，所述容器可以是透明的或有颜色的。作为所述核酸分离纯化柱，可以使用装备有用于区分各个核酸分 离纯化柱的单元这样的核酸分离纯化柱。作为用于区分各个核酸分离纯 化柱的单元，可以举例为条形码、二维条形码、磁带、IC卡等。此外，也可使用具有这种结构的核酸分离纯化柱，所述结构使得 可以很容易地从所述具有至少两个开口的容器中取出核酸吸附性多 孔膜。在使核酸从多孔膜上解吸附的过程中，当回收液对膜的浸渍时间 较短时，需要进行多次提取操作，但是当浸渍时间延长时，可能通过 一次或较少次数的提取操作就能洗脱出更多量的核酸。本发明人经过 仔细研究结果发现，在提取核酸的过程中，当浸渍时间为至少0.1秒 且至多600秒时，可以获得足够量的核酸。当裂解液中表面活性剂的浓度增加时，裂解物溶液和洗涤液的穿 过时间变短，但是为了获得所需量的核酸需要进行多次提取操作，由 此产生了所回收的核酸的浓度降低的问题，然而，可以通过延长核酸 吸附性膜在回收液中的浸渍时间来回收得到更多量的核酸。将所制备的裂解物溶液注入两个或多个提取柱中可能会使分析 物穿过，而当所用的提取柱数量少于上述情况时，所述的分析物原本 会造成堵塞，或使裂解物溶液和洗涤液的穿过时间延迟。通过洗涤步骤使最终获得的RNA的回收量和纯度提高，并且可以使含有所需RNA的分析物的液体量达到最少。此外，当自动进行 洗涤操作和回收操作时，可以简单快速地实施所述操作。当需要加快 速度时，可以实施一次洗涤步骤，但是当纯度更为重要时，则需要重 复洗涤两次或更多次。在洗涤步骤中，使用试管、移液管、自动注射装置或其它的具有 类似功能的供给部件，将洗涤液提供到容纳有核酸吸附性多孔膜的核 酸分离纯化柱中。可以将洗涤液从核酸分离纯化柱的开口 1 (核酸混 合物溶液已通过该开口注入)供入，并且通过使用与所述开口 1连接 的压力差产生装置(例如滴液管、注射器、泵、电动移液管等)在核 酸分离纯化柱的内部被调节为加压状态的条件下使溶液穿过该核酸 吸附性多孔膜而从不同于所述开口 1的另一个开口排出。此外，洗涤 液也可以由开口 1供入并由该开口 1排出。还可以将洗涤液由核酸分 离纯化柱的不同于所述开口1(核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入和排出。在这些方式中，更优选的方式如下洗涤液由核酸分离纯化柱的开口l供入，并使溶液穿过核酸吸附性多孔膜 而从不同于所述开口1的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异 的洗涤效率。优选的是，在洗涤步骤中洗涤液的温度为4。C到70。C。此外， 更优选的是，将洗涤液温度设定为室温。在洗涤步骤中，在进行洗涤 步骤的同时可以对核酸分离纯化柱施加机械振动或超声波来进行搅 拌。可供选用的其它方式是，可通过实施离心操作来进行洗涤。优选的是，在洗涤步骤中洗涤液为这样的溶液其含有水溶性有机溶液和水溶性盐中的至少一种。洗涤液必须具有能够洗出核酸混合 物溶液中的杂质(该杂质与核酸一起被吸附在核酸吸附性多孔膜上)的能力。为了达到这种效果，洗涤液必须为这样的组分该组分不会 使核酸从核酸吸附性多孔膜上解吸附，但能够使杂质解吸附。为达到 这个目的，由于核酸微溶于醇类等水溶性有机溶剂中，因此水溶性有 机溶剂适合于使除核酸之外的其它成分解吸附而使核酸保留在核酸 吸附性多孔膜上。此外，由于加入水溶性盐可以增强核酸的吸附效果，从而可以使选择性地除去杂质和不需要的成分的作用得以提高。作为洗涤液中所含有的水溶性有机溶剂，可以使用醇类。作为醇 类，可以举例为甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇。丙醇可以是异丙醇或正丙醇，丁醇可以是直链或支链的。可以使用所述醇中的两种 或多种。在这些醇中，优选使用乙醇。在洗涤液中所含有的水溶性有机溶剂的量优选为5质量％到100质量％、更优选为5质量％到40质量％。此范围是优选的，这是因为 可以在不会增加DNA等污染物、不会使所关注的RNA从多孔膜上解 吸附的条件下使RNA的回收量提高并由此使RNA具有高纯度。另一方面，优选的是洗涤液中所含有的水溶性盐为卤化物，特别 是氯化物。此外，优选的是该水溶性盐含有单价或二价正离子，特别 优选为碱金属盐或碱土金属盐，在这些金属盐中，钠盐和钾盐是优选 的，并且钠盐是最优选的。当洗涤液中含有水溶性盐时，水溶性盐的浓度优选为至少10毫 摩尔/升，对其上限没有特别限定，只要该浓度范围不会破坏杂质的 溶解度即可，所述上限的浓度优选为至多1摩尔/升，更优选为0.1摩 尔/升。进一步优选的是，所述水溶性盐为氯化钠，并且特别优选的 是氯化钠的浓度为20毫摩尔/升或更高。优选的是，洗涤液中不含有离液物质。这样，可以减少在回收 步骤中离液物质造成污染的可能性。当在回收步骤中离液物质造成污 染时，该物质会抑制在进行RT-PCR等反应时的酶反应，因此，考虑 到之后进行的酶反应等的情况，理想的是洗涤液中不含有离液物质。 此外，离液物质具有腐蚀性并且是有害的，鉴于这些性质，为了安全 地进行试验操作，不使用离液物质对实验人员来说是特别有利的。就这一点而言，离液物质是指上文所述的尿素、盐酸胍、异硫 氰酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸钠、碘化钠、碘化钾等。传统上，在进行核酸分离纯化过程的洗涤步骤中，由于洗涤液 对柱等容器具有高度的润湿性，所以洗涤液常常被保留在容器中，结 果在实施回收步骤时残留有洗涤液，使核酸的纯度降低并使后续步骤 的反应性降低。因此，当使用柱等容器来进行核酸的吸附和解吸附时，34重要的是，在吸附步骤和洗涤步骤中使用的溶液(特别是洗涤液)未 残留在柱内，这样洗涤液就不会对下一步及其后的步骤产生影响。因此，为了防止洗涤步骤中使用的洗涤液残留在回收步骤中使 用的回收液中，并由此使残留在柱内的洗涤液最少，优选的是洗漆液的表面张力为小于0.035 J/m2。当表面张力小时，洗涤液对柱的润湿性能提高，这样可以控制残留的液体的体积。然而，虽然为了提高洗涤效率，可增加水的比例，但在这种情 况下，洗涤液的表面张力增大并且残留的液体的体积也增多。当洗涤液的表面张力为0.035 J/i^或更大时，可通过增强柱的斥水性来控制 残留的液体的体积。当柱的斥水性增强时，会形成液滴，并且可以通 过使液滴滴落下来来控制残留的液体的体积。作为用于增强斥水性的 方法，存在这样的方法在柱的表面上涂敷硅或类似的防水剂；在柱 成型时混入硅或类似的防水剂，但不限于此。使用本发明的核酸吸附性多孔膜可以简化洗涤步骤。(1)可将 洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜的次数设定为一次。(2)可在室温下 实施洗涤步骤。(3)在洗涤步骤之后，可以立即实施随后的步骤。(4)也可将上述(1) 、 (2)和(3)中的一者或两者或多者组合起 来。在传统方法中，为了快速地除去洗涤液中所含有的有机溶剂，在 许多情况下需要干燥步骤，但是由于本发明中所使用的核酸吸附性多 孔膜是一种薄膜，因此可以省略干燥步骤。在传统的RNA分离和纯化方法中，存在以下问题在实施洗涤 步骤时，洗涤液经常溅散并附着在其它部位上，从而造成样品污染。 通过设计核酸分离纯化柱的形状和废液容器的形状，可以防止洗涤步 骤中的这类污染，其中所述的核酸分离纯化柱是通过将核酸吸附性多 孔膜密封在具有两个开口的容器中而制备得到的。为了从含有DNA和RNA的裂解物溶液中选择性地只分离和纯化 RNA，该目的可以通过以下过程实现，所述过程为使溶液穿过容纳 有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱，由此使核酸被核酸吸附性多 孔膜吸附(吸附步骤)，然后进行洗涤(洗涤步骤l)，并进行脱氧 核糖核酸酶处理的步骤。对脱氧核糖核酸酶没有特别限定，可使用任何脱氧核糖核酸酶。 在脱氧核糖核酸酶对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进行处理的步骤中，处理所需时间根据含有DNA和RNA的核酸混合物 溶液中DNA的量和起作用的脱氧核糖核酸酶的浓度而变化，但是处 理所需时间优选为5秒钟到360分钟、更优选为30秒钟到130分钟。 此外，在脱氧核糖核酸酶对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进 行处理的步骤中所采用的温度可以为4'C或更高、优选为l(TC到50 °C，当需要提高反应效率时，可以在更高的温度(例如5(TC到70°C) 下进行反应。就这一点而言，表述"使脱氧核糖核酸酶对核酸吸附性 多孔膜进行处理"是指使被核酸吸附性多孔膜所吸附的核酸所处的部 分与脱氧核糖核酸酶发生反应；表述"在核酸吸附性多孔膜上"不仅 包括在核酸吸附性多孔膜的上面，而且还包括多孔膜的孔内，或者膜 孔的出口处等地方。此外，本发明中加入脱氧核糖核酸酶的操作还具有縮短洗涤液的穿 过时间或改善堵塞情况的目的。除了脱氧核糖核酸酶之外，还可以加入蛋白降解酶、脂降解酶、糖 降解酶、核酸降解酶以及氯仿、甲醇等有机溶剂、或者它们的混合物中 的任意一种。通过加入这些物质，可以将残留在膜上的造成堵塞的物质 的组成成分降解，这样可以提高洗涤液的穿过能力，縮短洗涤液的穿过 时间和改善堵塞的情况。可以在裂解物溶液穿过之后加入所述的物质，但是更优选的是使用 洗涤液进行多次洗涤。这是因为特别是在使用了蛋白降解酶、脂降解酶、 糖降解酶或核酸降解酶时，受到残留在膜上的离液盐的影响使得这些降 解酶发生变性并且使它们的活性受到抑制，这样非常有可能使降解造成 堵塞的物质的能力降低并且洗涤液的穿过时间不能縮短。使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供给部件将 回收液供给到容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱中。将回收 液由核酸分离纯化柱的开口1(核酸混合物溶液己通过该开口注入) 供入，并且使用与所述开口 l连接的压力差产生装置(例如滴液管、 注射器、泵、电动移液管等)在核酸分离纯化柱的内部被调节为加压状态的条件下通过使溶液穿过核酸吸附性多孔膜而从不同于所述开 口 1的另一个开口排出。此外，回收液也可以由开口 1供入并由该开 口 1排出。还可以将回收液由核酸分离纯化柱的不同于所述开口 l(核 酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入和排出。在这些 方法中，更优选的方法如下回收液由核酸分离纯化柱的开口 1供入， 并使溶液穿过核酸吸附性多孔膜而从不同于所述开口l的另一个开口 排出，这是因为该方法具有优异的回收效率。基于由分析物所制得的核酸混合物溶液的量，通过调节回收液的量来进行RNA的解吸附。含有分离和纯化后的RNA的回收液的体积 取决于所使用的分析物的量。回收液的一般常用体积为几十微升到几 百微升，但是当分析物的量极少时，或者相反，当需要分离和纯化大 量的RNA时，回收液的量可在1微升到几十毫升的范围内变化。作为回收液，可优选使用精制后的蒸馏水、Tds/EDTA缓冲液等。 此外，当将经过所述步骤后所回收的RNA进行RT-PCR (逆转录聚 合酶链式反应)时，还可使用用于RT-PCR的缓冲液(例如，含有最 终浓度分别为75毫摩尔/升的KC1、 50毫摩尔/升的Tris-HCl、 3.0毫 摩尔/升的MgCh以及10毫摩尔/升的DDT的水溶液)。优选的是，回收液的pH为pH 1到pH 10、更优选为pH2到pH 7。此外，特别是离子强度和盐浓度会对被吸附的RNA的洗脱产生影 响。优选的是，回收液的离子强度为500毫摩尔/升或更低。盐浓度 优选为0.5摩尔/升或更低、更优选为至少0.01毫摩尔/升且至多50毫 摩尔/升。这样，RNA的收率提高，从而可回收更多量的RNA。通过减少回收液的量，可以得到含有浓縮后的核酸的回收液。优 选的是，(回收液的体积):(核酸混合物溶液的体积)=1:100到99:100， 更优选的是，(回收液的体积):(核酸混合物溶液的体积)=1:10到9:10。 由此，可以方便地浓縮核酸，而无需在核酸分离纯化之后的步骤中实 施浓縮操作。通过这些方法，可提供一种用于得到与分析物相比其核 酸被浓縮的核酸溶液的方法。作为另一个实施方案，通过调节回收液的体积来进行核酸的解吸 附，可获得含有所需浓度的核酸的回收液，并且可以获得具有适合于后续步骤(例如当实施RT-PCR时)的核酸浓度的回收液。优选的是， (回收液的体积):(核酸混合物溶液的体积)=1:1到50:1，更优选的是， (回收液的体积):(核酸混合物溶液的体积)=1:5到5:1。由此，可得到 这样的优点能够避免在核酸分离纯化之后进行繁琐的浓度调节操 作。此外，通过使用足量的回收液，可以提高从多孔膜上回收的核酸 的回收量。当使用回收液使被吸附的核酸从固体材料上解吸附时，可 以通过延长固体材料在回收液中的浸渍时间来提高核酸的回收量。回 收液的浸渍时间优选为0.1秒至1，600秒、更优选为5秒至600秒。此外，根据目的不同来改变回收液的温度，可以方便地回收核酸。 例如，通过将回收液的温度调节为0"C到l(TC来使核酸从多孔膜上解 吸附，此时不用加入能够抑制酶的降解作用的某些试剂也不用采取特 殊的操作，就可以通过抑制核酸降解酶的作用来抑制核酸的降解，因 此可以方便有效地得到核酸溶液。此外，在将回收液的温度调节为1(TC到35'C时，可在通常的室 温条件下进行核酸的回收，从而使核酸解吸附并进行分离和纯化，而 无需复杂的步骤。作为另一个实施方案，当将回收液的温度设定为较高的温度(例 如35。C到7(TC)时，可方便地使核酸从多孔膜上解吸附并具有较高 的回收量，而无需复杂的操作。对回收液的注入次数没有限定，注入次数可以是一次或两次或 多次。通常，在方便快捷地分离和纯化核酸时，可进行一次回收操作， 但是在回收大量核酸时，可两次或多次注入回收液。在回收步骤中，可以将核酸回收液配制成可以用于后续步骤的 组合物。在许多情况下，经分离和纯化后的核酸有时要进行RT-PCR (逆转录聚合酶链式反应)操作。在此情况下，必须用适合于RT-PCR 方法的缓冲液来稀释经分离和纯化后的核酸。当在本方法的回收步骤 的回收液中使用适合于RT-PCR方法的缓冲液时，可方便快捷地进入 随后的RT-PCR步骤。此外，在回收步骤中，为了抑制被回收在核酸回收液中的核酸 的降解，可加入稳定剂。作为稳定剂，可加入抗菌剂、抗真菌剂、核酸降解抑制剂等。作为核酸降解抑制剂，可举例为核酸酶类抑制剂， 具体来说可提及EDTA等。此外，作为其它的实施方案，可以预先 向回收容器中加入稳定剂。对回收步骤中所使用的回收容器没有特别限定，但可使用由在260 nm处无吸收的材料所制成的回收容器。在此情况下，无需把回 收的核酸溶液转移到其它容器中就可以测量该溶液的浓度。作为在 260 nm处无吸收的材料，可使用(例如)石英玻璃等，但不限于此。使用可以实施上述方法中所包括的步骤的自动装置来实施以下 操作使用在具有至少两个开口的容器中容纳有核酸吸附性多孔膜的 核酸分离纯化柱以及压力差产生装置，从含有核酸的分析物中分离和 纯化核酸。此外，通过利用可以自动使用成套用具的自动装置来实施 所述操作。通过这样的自动装置，不仅可使操作简单快速，而且不管 操作者的技能如何，都可以得到一定水平的核酸。以下示出自动装置的实例，该自动装置通过使用在具有至少两 个开口的容器中容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱以及压 力差产生装置来从含有核酸的分析物中自动地进行分离和纯化核酸 的步骤，但本发明的自动装置不限于此。所述的自动装置是这样的装置，该装置可以自动地实施用于选 择性地分离和纯化RNA的分离纯化操作，该操作包括以下步骤使 用容纳有溶液可穿过的核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱；将含有 核酸的核酸混合物溶液注入到所述核酸分离纯化柱中；通过加压使所 述核酸混合物溶液中的核酸吸附到上述的核酸吸附性多孔膜上；向所 述核酸分离纯化柱中注入洗涤液并通过加压除去杂质；向所述核酸分 离纯化柱中注入脱氧核糖核酸酶，从而在核酸吸附性多孔膜上使脱氧 核糖核酸酶发生作用；通过加压使脱氧核糖核酸酶穿过核酸吸附性多 孔膜的内部；向所述核酸分离纯化柱中注入洗涤液，并通过加压除去 被降解的DNA;然后，向所述核酸分离纯化柱中注入回收液，从而 使被核酸吸附性多孔膜所吸附的RNA解吸附，并且将解吸附的RNA 与回收液一起回收。优选的是所述装置装配有负载机构，用于承载 所述的核酸分离纯化柱；废液容器，用于容纳所述核酸混合物溶液的残余物、脱氧核糖核酸酶和洗涤液的排出液；回收容器，用于容纳含 有RNA的所述回收液；压縮空气供给机构，用于将压縮空气导入到 所述核酸分离纯化柱中；以及注入机构，用于分别向所述核酸分离纯 化柱中注入洗涤液、脱氧核糖核酸酶和回收液。优选的是，所述负载机构装配有安装在装置主体上的立架；承 载于所述立架上并可上下移动的柱支架，所述柱支架用于保持所述的 核酸分离纯化柱；以及用于承载所述的废液容器和回收容器的容器支 架，在所述柱支架的下方该废液容器和回收容器相对于所述核酸分离 纯化柱可互换它们的位置。此外，优选的是所述的压縮空气供给机构装配有用于从底部喷 射压縮空气的气嘴；压头，用于承载所述气嘴、并用于使所述气嘴可 以相对于承载在所述柱支架上的所述核酸分离纯化柱而上下移动；以 及设置在所述压头中的定位部件，该定位部件用于对位于所述负载机 构的台架上的核酸分离纯化柱进行定位。此外，优选的是所述的注入机构装配有注入所述洗涤液的洗涤 液注入嘴；注入所述脱氧核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶注入嘴；注入 所述回收液的回收液注入嘴；注入嘴移动台，该移动台用于承载所述 洗涤液注入嘴、所述脱氧核糖核酸酶注入嘴和所述回收液注入嘴并可 以在由所述负载机构所承载的核酸分离纯化柱上按顺序移动；洗涤液 供给泵，用于从容纳有洗涤液的洗涤液瓶中抽吸洗涤液并把洗涤液供 给到所述的洗涤液注入嘴中；脱氧核糖核酸酶供给泵，用于从容纳有 脱氧核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶瓶中抽吸脱氧核糖核酸酶并把脱 氧核糖核酸酶供给到所述的脱氧核糖核酸酶注入嘴中；以及回收液供 给泵，用于从容纳有回收液的回收液瓶中抽吸回收液并把回收液供给 到所述的回收液注入嘴中。采用本发明的诸如上述自动装置之类的装置(该自动装置装配 有核酸分离纯化柱；负载机构，用于承载废液容器和回收容器； 压缩空气供给机构，用于把压縮空气导入到核酸分离纯化柱中；以 及注入机构，用于分别把洗涤液、脱氧核糖核酸酶和回收液注入到 核酸分离纯化柱中)，通过自动地实施分离和纯化RNA的步骤，可以构建在短时间内能有效地自动对核酸混合物溶液中的RNA进行 分离和纯化的机构，其中所述分离和纯化RNA的步骤为向容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱内注入含有核酸的样品溶液；通 过加压使核酸混合物溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；通过 注入洗涤液来洗涤并排出杂质；向所述核酸分离纯化柱中注入脱氧核 糖核酸酶，使脱氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上发生作用；通过 加压使脱氧核糖核酸酶穿过核酸吸附性多孔膜的内部；向所述核酸分 离纯化柱中注入洗涤液，从而通过加压除去降解的DNA;然后注入回 收液，从而使被核酸吸附性多孔膜所吸附的RNA解吸附，并回收解 吸附的RNA。此外，当所述负载机构是通过装配有立架、可上下移动的柱支架 (该柱支架用于承载核酸分离纯化柱)以及容器支架(该容器支架用 于承载废液容器和回收容器，并且使所述废液容器和回收容器可交换 位置)而构成时，就可以容易地设定核酸分离纯化柱和上述两个容器 的位置，并可使废液容器和回收容器容易地互换位置。此外，当所述压缩空气供给机构是通过装配有气嘴、用于使所述 气嘴上下移动的压头以及用于确定核酸分离纯化柱的位置的定位部 件而构成时，通过这样简单的机构就可稳妥地供给压縮空气。此外，当所述注入机构是通过装配有注入嘴移动台(该移动台可 使洗涤液注入嘴、脱氧核糖核酸酶注入嘴、回收液注入嘴在核酸分离 纯化柱上依次移动)、洗涤液供给泵(其从洗涤液瓶中抽吸洗涤液并 把洗涤液供给到洗涤液注入嘴中)以及回收液供给泵(其从回收液瓶 中抽吸回收液并把回收液供给到回收液注入嘴中)而构成时，就可以 通过简单的机构依次分别注入洗涤液和回收液。对本发明中所使用的分析物没有特别限定，例如在诊断领域中， 作为分析物而采集的全血、血浆、血清、尿液、粪便、精液、唾液等 体液，或者植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒、 培养的细胞、其裂解物、其匀浆物等生物材料都可以成为目的物。作 为培养的细胞，可举例为浮游细胞、粘附细胞等。浮游细胞是指这样 的细胞其浮游在培养基中进行生长和繁殖，而不是粘着在容器壁上，例如，可提及HL60细胞，U 937细胞、HeLa S3细胞等作为代表性 的细胞株。粘附细胞是指在培养基中粘着在容器壁上进行生长和繁殖 的细胞，例如，可提及NIH3T3细胞、HEK 293细胞、HeLa细胞、 COS细胞、CHO细胞等作为代表性的细胞株。作为用作分析物的动 物(或其一部分)，可举例为动物组织。例如，可以使用在动物解剖 或活体解剖时采集到的可构成肝脏、肾脏、脾脏、脑、心脏、肺、胸 腺等器官的所有组织。优选的是使用含有可以使细胞膜和核膜裂解的试剂的水溶液(所 谓的核酸溶解试剂)来处理这些分析物，并由此使核酸溶出。由此， 可以得到其细胞膜和核膜被裂解并且核酸分散于水溶液中的核酸混 合物溶液。根据本发明，"核酸"可以是单链、双链、三链和四链中的任意一 种或者是它们的混合物中的任意一种，并且对分子量没有限定。此外， "核酸"可以是DNA、 RNA、其修饰产物和它们的混合物中的任意一 种。例子下面基于例子详细说明本发明，但本发明不限于以下例子。 (发明例1)分散介质的替换对RNA的回收量和穿过时间的影响准备约IO,OOO，OOO个培养的粒状细胞HL 60 (该细胞经过PBS 洗涤，离心后除去洗涤液，然后冷冻保存)。所得到的粒状细胞中含 有PBS。将冷冻保存的粒状细胞解冻后进行表1所示的处理。表1(a) 未处理(直接使用粒状细胞)(b) 将30 |iL份的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)加入(a)中(c) 尽可能除去PBS(d) 将30 |iL份的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)加入(c)中在(b)和(d)的情况中，通过进行移液操作和涡漩处理使细胞分散。向其中加入610 |iL的LR 001 (由Fuji Photo Film株式会社生 产)，然后立刻进行5次移液处理。使用由3.66摩尔/升的硫氰酸胍、 1体积％的2-巯基乙醇和30 pL的乙醇所构成的裂解液。细胞裂解后， 使用CUTE MIXER CM-1000 (由EYELA株式会社生产)进行1分钟 的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入190 的乙醇并立刻进行漩涡处理5秒 钟。在这种情况下，以一个样品接一个样品的方式对样品进行搅拌处 理。然后，使用CUTE MIXER CM-1000搅拌(2,500 rpm) 55秒钟。 在这种情况下，每次对4个样品进行搅拌处理。在通过离心进行沉淀 之后，制得裂解物溶液。将NEXT柱(由Fuji Photo Film株式会社生产，开口为7 mm， 细孔为2.5 pm)、洗涤液(WRC)和回收液(CRC)放置在Quick Gene 800 (由Fuji Photo Film株式会社生产)上，然后将裂解物溶液加入 到NEXT柱中，通过Quick Gene 800的RNA模式来进行提取。在这 种情况下，将洗涤液的体积设定为500 pL，将回收液的体积设定为 100 nL，将回收液的浸渍时间设定为30秒，将加压时间(即，堵塞 判断时间)设定为120秒。使用紫外可见分光光度计NanoDrop (由NanoDrop Technologies 株式会社生产)来对所回收的RNA进行定量以及纯度测定，根据260 nm处的吸光度来对回收量进行定量，根据260 nm与280 nm处的吸 光度之比来测定核酸的纯度，当该比值为1.8或更大时，可判断为纯 度良好。利用凝胶电泳对DNA等污染物进行分析。关于凝胶电泳的 条件，以TAE (Tris-乙酸)作为缓冲液，将5 (iL的样品与上样缓冲 液(10XBlue Juice)混合，然后将全部量的混合物进行电泳。所得结果如图1所示。未经处理的样品(a)发生堵塞。PBS被 除去后的样品(c)没有造成堵塞，但是裂解物的穿过时间为比较长 的77秒钟。与此形成对比的是，其中加入有Bis-Tris缓冲液的样品 (b)和(d)，其裂解物的穿过时间为50秒左右，这个时间是相当 低的。(对比例1)分散介质的种类和体积与RNA回收量和穿过时间的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 预定量的PBS或0.5摩尔/升的Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移 液或涡漩处理使所得细胞分散。向其中加入540 (iL份的裂解液，然 后立刻进行5次移液处理。使用由3.66摩尔/升的硫氰酸胍(GTC)、 1体积％的2-巯基乙醇和30 pL的乙醇所构成的裂解液。细胞裂解后， 使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2，500 rpm)， 然后通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入230 pL的乙醇并立刻进行5秒钟的涡漩 处理。然后，使用CUTE MIXER CM-1000对所得到的物质进行搅拌 (2,500 rpm) 55秒钟，并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。 然而，当样品的数量为1时，在加入乙醇后搅拌时间不分为5秒和55 秒，而是在加入乙醇后立刻进行60秒钟的涡漩处理，从而制得裂解 物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。所得结果如图2所示。当未加有分散介质时，裂解物的穿过时间 为比较长的90秒钟，并且在第二次洗涤时发生堵塞。另一方面，当 加入有分散介质时，裂解物的穿过时间縮短约35%至约60%，从而使 穿过能力显著改善。在此，设定这样的条件当穿过时间超过120秒 时可判断为堵塞。关于分散介质的种类与穿过时间的关系，与PBS 缓冲液的情况相比，Bis-Tds缓冲液可以有效地使裂解物的穿过时间 縮短约20%至约30%，并且使洗涤液的穿过时间显著縮短约70%。关 于分散介质的液体体积与穿过时间的关系，当分散介质的体积较多 时，可以稍微縮短穿过时间，但是分散介质的体积大于或等于30 就足够了。基于上面所述，优选的是存在分散介质，并且当以Bis-Tds 缓冲液作为分散介质并且其液体量为至少30 pL时就可以得到优选的 结果。(发明例2)分散介质的浓度与RNA的回收量和穿过时间的关系 将被冷冻保存的约IO,OOO，OOO个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与30 pL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩 处理将所得细胞分散。向其中加入490 pL份的裂解液。使用由5摩 尔/升的盐酸胍(GuHCl) 、 1体积％的2-巯基乙醇和2.5体积％的吐 温20(在裂解液中的浓度)所构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离 心进行沉淀。然后，向所得物中加入280 的乙醇，并使用CUTE MIXER CM-1000进行l分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉 淀，从而制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。所得结果如图3所示。当Bis-Tris的浓度为0.1摩尔/升时，洗涤 液的穿过时间相当长，为118秒；但是当Bis-Tris的浓度为1摩尔/ 升时，洗涤液的穿过时间显著縮短为约55秒。此时，细胞没有被很 好地分散而是凝聚在一起。基于上面所述，优选的是Bis-Tris的浓度为0.5摩尔/升。 (发明例3)裂解液的种类与RNA的回收量和穿过时间的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 |iL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。在使用裂解液1、 3和4的情况下，向所得物中 加入540 ^L份的裂解液；在使用裂解液2的情况下，向所得物中加 入510 )iL份的裂解液，并立刻进行5次移液操作。使用具有如表2 所示成分的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行 l分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉淀。表2<裂解液>1. GTC (3.66摩尔/升)，乙醇(5.5体积％)2. RLT (由Qiagen公司生产)3. GuHCl (3.66摩尔/升)，乙醇(5.5体积％)4.LR001 (由Fuji Photo Film株式会社生产) 所有溶液中均含有1体积％ (在裂解液中)的2-巯基乙醇 各浓度均为在裂解液中的浓度然后，在使用裂解液1、 3和4的情况下，向所得物中加入230 (iL 的乙醇；在使用裂解液2的情况下，向所得物中加入260 nL的乙醇， 并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，使用CUTE MIXER CM-1000 对由此得到的物质进行搅拌(2,500 rpm) 55秒钟，并通过离心进行 沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，当样品的数量为l时，在加入乙 醇后搅拌时间不分为5秒和55秒，而是在加入乙醇后立刻进行60秒 的涡漩处理，从而制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。所得结果如图4所示。裂解液3 (即，由GuHCl构成的裂解液) 导致裂解物的穿过时间延长，导致洗涤液的穿过时间显著延长，并且 与其它裂解液相比，裂解液3还导致回收量降低。特别是在这些裂解 液中，裂解液1 (即，由GTC构成的裂解液)显示出优异的效果。(发明例4)裂解液中离液盐的浓度与RNA的回收量和穿过时间的 关系将冷冻保存的约1,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 nL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入350 pL份的裂解液。使用由预定浓 度的GTC和1体积％的2-巯基乙醇(均为在裂解物中的浓度)构成 的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的 搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入350 nL的70体积％的乙醇，并使用CUTE MIXER CM-1000进行60秒的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心 进行沉淀，从而制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。46回收量的结果如图5所示，穿过时间的结果如图6所示。当GTC 的浓度大于或等于3摩尔/升时，可获得较高的回收量；当GTC的浓 度大于或等于3.66摩尔/升时，穿过时间变短。 (发明例5)裂解物溶液的体积与RNA回收量和穿过时间的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入397 (iL份(当裂解物溶液的体积为 600i!L时)或469 ^L份(当裂解物溶液的体积为700 |LiL时)或540 pL份(当裂解物溶液的体积为800 pL时)的裂解液。使用由3.66摩 尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和5.5体积％的乙醇(均为在裂 解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行l分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉 淀。然后，向所得物中加入173 |iL (当裂解物溶液的体积为600 |iL 时)或202 nL (当裂解物溶液的体积为700 |liL时)或230 (当裂 解物溶液的体积为800 pL时)的乙醇(在所有情况下在裂解物溶液 中乙醇的浓度均为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后， 使用CUTE MIXER CM-1000对由此得到的物质进行搅拌(2,500 rpm) 55秒钟，并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，当样品 的数量为1时，在加入乙醇后搅拌时间不分为5秒和55秒，而是在 加入乙醇后立刻进行60秒的涡漩处理，从而制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。穿过时间的结果如图7所示。随着液体体积的增大，裂解物的穿 过时间延长，但是洗涤液的穿过时间减少。不管液体体积为多少，回 收量基本稳定。(发明例6)裂解液中乙醇的量与RNA的回收量和穿过时间的关系 将冷冻保存的约IO,OOO，OOO个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 (iL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入510 (iL至770 的裂解液。使用由3.66摩尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和0 pL至260 的乙醇 (在所有情况下均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入260 pL至0^L的乙醇(在所有情况下在裂解物溶液中乙醇的浓度均为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得到的物质使用CUTE MIXER CM-1000搅拌 (2,500 rpm) 55秒钟，并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，当样品的数量为1时，在加入乙醇后搅拌时间不分为5秒和55秒，而是在加入乙醇后立刻进行60秒的涡漩处理，从而制得裂解物溶液。按照与发明例i相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。穿过时间的结果如图8所示。当裂解液中乙醇的量为30fiL时， 洗涤液的穿过时间较短，当裂解液中乙醇的量为60 pL时，洗涤液的 穿过时间变长，其后，随着裂解液中乙醇的体积％增加，穿过时间变 短。裂解液中乙醇的浓度与回收量的关系如图9所示。不管乙醇的量 为哪个量时，都可以得到几乎恒定的110 pg的回收量，但是，不管 乙醇的量较少或较大时，都需要较大液体体积的回收液。基于上面所述，优选的是裂解液中乙醇的量为30 pL。 (发明例7)裂解物中乙醇的量与RNA的回收量和穿过时间的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 |iL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入580 ^L至500 nL的裂解液。使用由 3.66摩尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和30 |aL的乙醇(在各种 情况下均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用 CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2,500 rpm),然后 通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入190 pL至270 nL的乙醇(在裂解物溶液 中乙醇的浓度为27.5体积％至37.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅 拌(2,500 rpm) 55秒钟，并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶 液。然而，当样品的数量为l时，在加入乙醇后搅拌时间不分为5秒 和55秒，而是在加入乙醇后立刻进行60秒的涡漩处理，从而制得裂 解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。RNA回收量的结果如图IO所示。当裂解物中乙醇的浓度为32.5 体积％时，回收量最高。(发明例8)加入乙醇后的搅拌时间与RNA的回收量和穿过时间的 关系将冷冻保存的约IO，OOO，OOO个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 jiL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入540 pL份的裂解液。使用由3.66摩 尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和30 nL的乙醇(在各种情况下 均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2，500 rpm)，然后通过离 心进行沉淀。然后，向所得物中加入230 [iL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 浓度为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得 到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅拌(2,500 rpm)预定的 一段时间，并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。然而，当样 品的数量为1时，在加入乙醇后搅拌时间不分为5秒和55秒，而是 在加入乙醇后立刻进行60秒的涡漩处理，从而制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。穿过时间的结果如图11所示。在加入乙醇后随着搅拌时间的延 长，穿过时间变短。当加入乙醇后的搅拌时间为35秒或更长时，RNA 的回收量可以保持在较高水平；搅拌时间为35秒钟时，即使回收液 的体积为200 pL，也可以使核酸洗脱下来(参见图12)，因此，优选的是在加入乙醇后搅拌55秒或更长的时间。(发明例9)加入乙醇后的移液处理与搅拌处理之间的差异对RNA 的回收量和穿过时间的影响将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 (iL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入540 )LiL份的裂解液。使用由3.66摩 尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和30 的乙醇(在各种情况下 均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2，500 rpm)，然后通过离 心进行沉淀。然后，向所得物中加入230 ^L的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 浓度为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理或5次移液处理。 然后，将由此得到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅拌(2,500 rpm) 55秒钟，并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的计算以及纯度的测定。在分别实施移液处理和搅拌处理的两种情况下，洗涤液的穿过时 间几乎都为相同的约70秒钟。然而，在实施移液处理的情况下，RNA 的回收量为75pg，而在实施搅拌处理的情况下，RNA的回收量显著 提高至104吗。基于上面所述，在加入乙醇后实施搅拌处理比实施移液操作更优选。(发明例10)滤膜的孔径与穿过时间和回收量的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入540 nL份的裂解液。使用由3.66摩 尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和30 pL的乙醇(在各种情况下 均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2，500 rpm)，然后通过离 心进行沉淀。然后，向所得物中加入230 iiL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 浓度为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得 到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅拌(2,500 rpm)55秒钟， 并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。穿过时间的结果如图13所示。虽然随着孔径的增大裂解物的穿 过时间稍微增大，但是洗涤液的穿过时间显著縮短。回收量的结果如 图14所示。当孔径增大时，RNA的回收量减少了 15%。 (发明例11)使用两个柱时的情况与穿过时间和回收量的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 |iL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入1,000 (iL份的裂解液。使用由3.66 摩尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和55 pL的乙醇(在各种情况 下均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离 心进行沉淀。然后，向所得物中加入400 )iL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 浓度为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得 到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅拌(2,500 rpm) 55秒钟， 并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。将两个NEXT柱、洗涤液(WRC)和回收液(CRC)放置在Quick Gene 800上，然后将500 的裂解物溶液加入到每个NEXT柱中， 通过Quick Gene 800的RNA模式来进行提取。在这种情况下，将回 收液的浸渍时间设定为30秒。按照与发明例1相同的方式来计算RNA的回收量及测定纯度。当使用一个柱时(裂解物溶液的体积为800 pL)，裂解物的穿过 时间为50秒；但是，当使用两个柱时，穿过时间分别显著减少至31 秒和34秒。当使用一个柱时，洗涤液的穿过时间为约70秒；但是， 当使用两个柱时，穿过时间显著减少至20秒或更短的时间。在使用1个柱的情况下，回收量为104pg;但是，在使用2个柱的情况下，回收量分别为50 (ig和54 pg (总和为104 (iL)，由此显示出与使用1 个柱的情况相同的结果。 (发明例12)使用粘附细胞Hek 293和HeLa时的情况与穿过时间和 回收量的关系在3.5 cm的盘上分别培养粘附细胞Hek 293 (细胞数量为约 1,700,000个)禾B HeLa (细胞数量为约1,500,000个)，通过抽吸除 去培养基，向所得物中加入1 ml的PBS并轻微振荡，然后通过抽吸 除去所述盘中的溶液。向所得物中加入540 pL份的裂解液。使用由 3.66摩尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和30 (iL的乙醇(在各种 情况下均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。通过使用移液管吸头 的底部进行摩擦来将粘着在所述盘上的细胞从该盘上剥离下来，并将 所得细胞裂解。将裂解液转移至1.7ml容积的Eppendorf管中，使用 CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后 通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入230 (iL的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 浓度为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得 到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅拌(2,500 rpm)55秒钟， 并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。Hek 293细胞和HeLa细胞的穿过时间分别为27秒和25秒。洗 涤液的穿过时间分别为9秒和11秒。RNA的回收量分别为30 iig和 39 pg。另外，采用离心和滤膜(由作为主要成分的二氧化硅构成) 的提取方法可以获得比本发明的方法显著减少的回收量，该回收量分 别为20 iig禾卩19 ^g。 (发明例13)回收液的浸渍时间与回收量的关系将冷冻保存的约20,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 |iL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入630 pL份的裂解液。使用由3.66摩尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇、120 jiL的乙醇和2.5体积％的 吐温80 (在各种情况下均为在裂解物中的浓度)构成的裂解液。细胞 裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉淀。然后，向所得物中加入140 ^L的乙醇(在裂解物溶液中乙醇的 浓度为32.5体积％)并立刻进行5秒钟的涡漩处理。然后，将由此得 到的物质使用CUTE MIXER CM-1000进行搅拌(2,500 rpm)55秒钟， 并通过离心进行沉淀，然后制得裂解物溶液。将NEXT柱(开口为7mm，细孔为3.5 pm)、洗涤液(WRC) 和回收液(CRC)放置在Quick Gene 800上，然后将裂解物溶液加入 到NEXT柱中，通过Quick Gene 800的RNA模式进行提取。在这种 情况下，将回收液的浸渍时间设定为30秒或120秒。当回收液的浸渍时间为30秒时，使用100 )LiL的回收液只能回收 48pg的RNA;但是，当回收液的浸渍时间为120秒时，RNA的回收 量显著增加到98 pg。 (发明例14)裂解物溶液的体积与回收量的关系将冷冻保存的约10,000,000个培养的粒状细胞HL 60解冻，并与 30 pL的0.5摩尔/升Bis-Tris (pH6.5)混合，然后通过移液或涡漩处 理将所得细胞分散。向其中加入25 )iL至1,500 jiL的裂解液。使用由 3.66摩尔/升的GTC、 1体积％的2-巯基乙醇和30 的乙醇构成的裂 解液。细胞裂解后，使用CUTE MIXER CM-1000进行1分钟的搅拌 处理(2,500 rpm)，然后通过离心进行沉淀。将所得溶液与25 pL至1,500 i!L的70。/。乙醇混合，使裂解物中 乙醇的浓度为35% (总液体体积为50 |iL至3,000 |iL)，使用CUTE MIXER CM-1000进行5秒钟的搅拌处理(2,500 rpm)，然后通过离 心进行沉淀，从而制得裂解物溶液。按照与发明例1相同的方式来实施RNA的提取方法、回收量的 计算以及纯度的测定。结果如图15所示。随着裂解物溶液体积的增加，RNA的回收量 也增大，并且当裂解物液体体积为900 时，可以得到预计的0.9叫的回收量，但是，当裂解物液体体积进一步增大时，回收量反而减少。 (发明例15)当预先用裂解液涂敷固相时回收量的依赖性通过以下方法用RLT (由Qiagen公司生产)来涂敷用于吸附核 酸的固体材料，所述方法为将600 pL含有1体积％的2-巯基乙醇的 RLT加入至U RNeasy小柱(由Qiagen公司生产)中，在10,000 rpm 下离心15秒钟。此外，还准备未经涂敷的RNeasy小柱。在直径为6 cm的盘上培养粘附细胞Hek 293 (细胞数量为约 5,800，000个)，通过抽吸除去培养基，向所得物中加入1 ml的PBS 并轻微振荡，然后通过抽吸除去所述盘中的溶液。向所得物中加入600 份的含有1体积％的2-巯基乙醇的细胞裂解液RLT，通过使用移 液管吸头的底部进行摩擦来将粘着在所述盘上的细胞从该盘上剥离， 并同时使所得细胞裂解。将该裂解液加入到Shredder小柱(由Qiagen 公司生产)中，并在15,000 rpm下离心2分钟。将600 ^1^份的70% 乙醇加入到穿过溶液中，并进行7次移液操作。将按照所述方法制备的裂解物溶液加入到涂敷有RLT的RNeasy 小柱或未经涂敷的Neasy小柱中，并在10,000 rpm下离心15秒。弃去穿过溶液，并将700 pL的RW1溶液(由Qiagen公司生产) 加入到RNeasy小柱中，随后，将该小柱在10,000 rpm下离心15秒。 弃去穿过溶液，并将500 pL的RPE溶液(由Qiagen公司生产)加入 到RNeasy小柱中，随后，将该小柱在10,000 rpm下离心15秒。再 次弃去穿过溶液，并将500 |LiL的RPE溶液加入到RNeasy小柱中， 随后，将该小柱在10,000 rpm下离心2分钟。将50 ^L份的DEPC (焦碳酸二乙酯)溶液加入到RNeasy小柱 中，并在IO，OOO rpm下离心1分钟，回收穿过的溶液。再次将50 pL 份的DEPC溶液加入到RNeasy小柱中，并在10,000 rpm下离心1分 钟，回收穿过的溶液。按照与发明例1相同的方式来计算RNA的回收量以及测定其纯度。所得结果如图16所示。预先使用RLT涂敷的用于吸附核酸的固体材料显示出几乎恒定的100 p&的RNA回收量。然而，未经涂敷的材料虽然显示出平均回 收量为100 Mg，但是回收量的值在88pg至124pg之间变化。因此，预先向用于吸附核酸的固体材料中加入裂解液可以使RNA 的回收量保持稳定。工业适用性由于分析物中的核酸可以被固相的表面所吸附，所以经过洗涤等 类似的操作后使核酸解吸附可以方便快捷地分离、纯化和提取核酸， 而无需特殊的技术、复杂的操作和特殊的装置。此外，本发明的提取 方法可以提供这样的核酸提取方法，该方法可以使裂解物溶液和洗涤 液穿过，而不会造成细胞物质(其易于发生堵塞)发生堵塞，与传统 方法相比，该方法能够处理更多数量的细胞并且所需要的时间更短， 此外在细胞数量相同时，该方法比传统方法更快速。本申请中要求外国优先权的每一份外国专利申请的全部内容 均以引用方式并入本文，就如同全部列出一样。
权利要求
1.一种核酸提取方法，该方法包括(a)通过以下步骤(i)或(ii)制备含有溶液的生物材料步骤(i)，制备含有磷酸盐缓冲液或Bis-Tris(N，N-双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)缓冲液的生物材料；或步骤(ii)，用Bis-Tris缓冲液替换所述生物材料中所含有的缓冲液；(b)通过使所述的生物材料与裂解液接触来使所述生物材料溶解，并溶出所述生物材料中所含有的核酸；(c)通过向由所述步骤(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有机溶剂来制备裂解物溶液；(d)通过使所述的裂解物溶液与固体材料接触来使所述裂解物溶液中所含有的所述核酸被所述的固体材料吸附；(e)洗掉残留在所述固体材料中的除了待提取的所述核酸之外的杂质、和裂解液；以及(f)通过回收液使所述的被吸附的核酸从所述固体材料上解吸附。
2. 根据权利要求1所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(a)中的所述溶液为分散介质。
3. 根据权利要求1或2所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(a)中的所述溶液的浓度为0.01摩尔/升至10摩尔/升，并且其pH为3至9。
4. 根据权利要求1至3中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(b)中的所述裂解液含有离液盐。
5. 根据权利要求4所述的核酸提取方法，其中所述离液盐的浓度为0.1摩尔/升至10摩尔/升。
6. 根据权利要求1至5中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(b)中的所述裂解液含有浓度为小于等于50体积%的水溶性有机溶剂。
7. 根据权利要求6所述的核酸提取方法，其中所述裂解液中所含有的所述水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、 异丙醇或丁醇。
8. 根据权利要求1至7中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(b)中的所述裂解液含有表面活性剂。
9. 根据权利要求8所述的核酸提取方法，其中所述裂解液中所含有的所述表面活性剂的浓度为0.001质量 %至30质量％。
10. 根据权利要求1至9中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(b)中在加入所述的裂解液之后进行至少一次的移液操作。
11. 根据权利要求1至10中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(b)中在加入所述的裂解液之后或在所述的移液操作之后再进行搅拌操作。
12. 根据权利要求1至11中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述步骤(c)中的所述裂解物溶液是通过以下过程制备的，所述过程为向所述的含核酸的裂解液中加入所述的水溶性有机溶剂， 使得所述的裂解物溶液含有浓度为10体积％至60体积％的所述水溶 性有机溶剂。
13. 根据权利要求12所述的核酸提取方法，其中在所述步骤(C)中使用的所述的水溶性有机溶剂为甲醇、 乙醇、异丙醇或丁醇。
14. 根据权利要求1至13中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(c)中在加入所述的水溶性有机溶剂之后进行至少一次移液操作或搅拌操作。
15. 根据权利要求14所述的核酸提取方法， 其中搅拌时间为0.1秒至600秒。
16. 根据权利要求14或15所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(c)中在加入所述的水溶性有机溶剂以及进行搅拌操作或移液操作之后，进一步进行移液操作或搅拌操作。
17. 根据权利要求16所述的核酸提取方法， 其中搅拌时间为0.1秒至600秒。
18. 根据权利要求1至17中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(f)中所述回收液的浸泡时间为0.1秒至1,600秒。
19. 根据权利要求1至18中任意一项所述的核酸提取方法， 其中当细胞的数目为小于等于500,000个时，所用的所述裂解物溶液的液体量为小于等于800 ^L。
20. 根据权利要求1至19中任意一项所述的核酸提取方法， 其中当细胞的数目为大于等于500，000个时，所用的所述裂解物溶液的液体量为大于等于300 nL。
21. 根据权利要求1至20中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(d)中的所述固体材料为其表面具有羟基的固体材料。
22. 根据权利要求1至21中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在柱中保持有所述固体材料的容器被用于所述的步骤(d)中。
23. 根据权利要求1至22中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述的步骤(d)中，将所述的裂解物溶液与其中预先使含有离液盐的溶液穿过的所述固体材料接触。
24. 根据权利要求1至23中任意一项所述的核酸提取方法， 其中通过将所述步骤(c)中制得的所述裂解物溶液注入两个或更多个容器中来进行提取操作。
25. 根据权利要求1至24中任意一项所述的核酸提取方法， 其中向一个柱中两次或多次注入在所述步骤(c)中制得的所述裂解物溶液。
26. 根据权利要求1至25中任意一项所述的核酸提取方法， 其中在所述步骤(d)、所述步骤(e)和所述步骤(f)中，通过改变压力或通过离心使所述的裂解物溶液、所述的洗涤液和所述的 回收液中的至少一种与所述的固体材料接触。
27. 根据权利要求1至26中任意一项所述的核酸提取方法， 其中所述核酸是DNA、 RNA、 mRNA、质粒或它们的混合物中的一者。
28. 根据权利要求1至27中任意一项所述的核酸提取方法，其中所述的生物材料是经培养的细胞、动物细胞、动物组织、 植物细胞、植物组织、病毒、细菌、真菌或核酸。
全文摘要
本发明涉及一种核酸提取方法，该方法包括(a)通过以下步骤(i)或(ii)制备含有溶液的生物材料步骤(i)，制备含有磷酸盐缓冲液或Bis-Tris(N，N-双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)缓冲液的生物材料；或步骤(ii)，用Bis-Tris缓冲液替换所述生物材料中所含有的缓冲液；(b)使用裂解液溶解所述生物材料，并溶出所述生物材料中所含有的核酸；(c)通过向由所述步骤(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有机溶剂来制备裂解物溶液；(d)使所述裂解物溶液中所含有的所述核酸被所述的固体材料吸附；(e)洗掉残留在所述固体材料中的杂质和所述裂解液；以及(f)通过回收液使所述的被吸附的核酸从所述固体材料上解吸附。
文档编号C12N15/09GK101243186SQ20068003037
公开日2008年8月13日 申请日期2006年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者佐佐木翼, 金原秀行 申请人:富士胶片株式会社