专利名称：：产生l-谷氨酸的细菌和用于产生l-谷氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及发酵工业，并且本发明涉及使用棒状杆菌型细菌(coryneformbacterium)有效产生L-谷氨酸的方法。
背景技术：
：通常使用具有产生L-谷氨酸的能力的属于短杆菌属O^W^cfeWwm)或棒杆菌属(Cwy"eZ^c&n'Mm)等的棒状杆菌型细菌通过发酵来产生L-谷氨酸。为了改进这些棒状杆菌型细菌的生产力，使用从自然界分离的细菌菌抹，或它们的人工突变菌林或它们通过基因重组修饰的菌株。作为通过基因重组技术将产生L-谷氨酸的能力改进的棒状杆菌型细菌，迄今为止已经开发的是将谷氨酸脱氢酶活性、柠檬酸合酶活性和丙酮酸羧化酶活性增强的^f奉状杆菌型细菌(专利文献l)，将a-酮戊二酸脱氢酶活性、或a-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶活性降低的棒状杆菌型细菌(专利文献2和3)等。同时，谷氨酸才奉斥干菌(Coo^e^c&n'MWg/wtom/cww)染色体的完整核苦酸序列已经测定(非专利文献1)。然而，其3099个推定的orf中的大约40%与功能已知的其它微生物的基因显示低同源性，其编码功能未知的蛋白质，并且缺失这些基因的影响至今未知。专利文献1:InternationalPatentPublicationWO00/18935专利文献2:InternationalPatentPublicationW095/34672专利文献3:JapanesePatentLaid-open(KOKAI,JP画A)No.01-296994非专利文献1:Appl.Microbiol.Biotechnol"62(2-3),pp.99-109(2003)
发明内容本发明的目的是提供将产生L-谷氨酸的能力改进的棒状杆菌型细菌，和提供使用这种细菌有效产生L-谷氨酸的方法。本发明的发明人为了达到上述目的进行了多方面研究。结果，他们发现如果在棒状杆菌型细菌中将g/wX基因失活，能够改进该细菌产生L-谷氨酸的能力，并且由此完成了本发明。即，本发明提供以下各项。(1)具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，对所述棒状杆菌型细菌进行修饰以使g/wZ基因失活。(2)根据(1)的棒状杆菌型细菌，通过将突变引入染色体上的g/wX基因或其表达调控区来修饰所述棒状杆菌型细菌，以使g/wZ基因的表达量降低。(3)根据(1)或(2)的棒状杆菌型细菌，其中将染色体上的g/"X基因破坏。(4)用于产生L-谷氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养根据(1)-(3)任一项的棒状杆菌型细菌以产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。附图简述图1:显示质粒pBS3的构建方法的图示。图2:显示质粒pBS4S的构建方法的图示。图3:显示用于破坏g/wZ的质粒pBXGXD的构建方法的图示。优选实施方式描述在下文中，将详细说明本发明的实施方式。<1>本发明的棒状杆菌型细菌用于本发明的棒状杆菌型细菌包括棒杆菌属细菌，和曾经归类于短杆菌属，但是已经重新归类于棒杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981)),并且进一步包括属于极其接近棒杆菌属的短杆菌属的细菌。具体实例包括以下p者乙醜乙酉吏才奉斥干菌(CV7we6acfen.wwace^acz.<iop/n7Mm)醋谷才奉4干菌(Cor_yMe6acfer/t/wacetog7wtamz'cww)坑醇棒軒菌(Co^yweZacte"'wwa/^awo/,'cww)美棒軒菌(Cwy"e6acfen-画ca〃ww—谷氨酸棒杆菌百合花棒軒菌(Co/^"e^c欣z'画朋簡)栖糖蜜棒軒菌(Cc^"e6ac敏/MWme/aweco/a)p者产氛才奉^干菌(C"o^ywe6ac/gn.Mw^^7wo"mz'"oge"es)力士棒軒菌(Cc^"eZacm-廳/ze/rwfo)二:t支-豆^干菌(5;-ev/6acfen'ww(i/van'ca加w)黄色短軒菌(8rev/6ac妙/謂y/av画)吝'L发酵4豆4干菌(5rev沾acfeWM附/actoy^附e"ftw2)(谷氨酉交才奉4干菌)玫瑰色短軒菌(&evAfl"en.画msew附)解糖短軒菌(5rev/6ac妙/wwsacc/zara一c訓)生石克短軒菌(5reW6ac敏/謂A/oge"/tofc)产氛短杆菌(5wvz'6"c/m'w附"mmo"/age"as)白色少豆冲干菌(B;-eW6acfer/wwa/6ww)错状短軒菌(5rev/Z)acto^w7ce".w訓)p耆氨4敖4干菌(Af/cro6ac&n'ww"m附ow/a//w7i/m)具体而言，可包括以下菌林嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870醋谷才奉杆菌ATCC15806烷醇棒杆菌ATCC21511美棒杆菌ATCC15991谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060、ATCC13869百合花棒杆菌ATCC15990栖糖蜜棒杆菌ATCC17965嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERMBP-1539)力士棒杆菌ATCC13868二歧短杆菌ATCC14020黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERMBP-2205)5rev/Zac/en'wm/7附0"'0/>/2//讓ATCC14068乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13869玫3鬼色短杆菌ATCC13825解糖短杆菌ATCC14066生硫短杆菌ATCC19240产氨短杆菌ATCC6871、ATCC6872白色短杆菌ATCC15111蜡状短4干菌ATCC15112嗜氨微杆菌ATCC15354这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)获得。即，给予每个菌抹登记号。使用该登记号能够订购菌抹。对应于各菌抹的登记号列于ATCC的目录。根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的规定，将AJ12340菌抹于1989年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofinternationalTradeandIndustry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology),^f立于TsukubaCentral6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-5466，Japan),并给予登录号FERMBP-1539。根据布达佩斯条约的规定，将AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并给予登录号FERMBP-2205。在本发明中，"产生L-谷氨酸的能力"的意思是当在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌时，在培养基中积累L-谷氨酸的能力。本发明的细菌可能具有这种产生L-谷氨酸的能力作为所述棒状杆菌型细菌野生菌抹的特性，或所述能力可能是通过培育赋予的性质。此外，可以通过下文描述的方式来修饰细菌以使g/wX失活来赋予产生L-谷氨酸的能力。为了通过培育来赋予产生L-谷氨酸的能力，可以使用通常用于培育棒状杆菌型细菌的方法，例如，用于获得代谢调节突变菌抹、构建将目标物质生物合成系统中的酶增强的重组菌林(参考"AminoAcidFermentation",theJapanScientificSocietiesPress[GakkaiShuppanCenter],1stEdition,publishedonMay30,1986，pp.77-100)等的那些方法。在那些方法中，有待赋予的代谢调节突变，或目标物质合成系统酶的增强等可以单独赋予或进行，或者可以将它们中的两个或更多个组合赋予。可以将代谢调节突变的赋予和生物合成系统酶的增强进行组合。在下文中，将描述用于赋予产生L-谷氨酸的能力的方法。用于通过培育来赋予产生L-谷氨酸能力的方法的实例包括增强基因的表达，所述基因编码涉及L-谷氨酸生物合成的酶。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氬酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸异构酶等。增强这些基因的表达能够通过以下方法完成引入扩增质粒，通过在适合的质粒中引入含有这些基因中任一的DNA片段来获得所述质粒，例如，含有至少负责质粒在棒状杆菌型细菌中复制的基因的质粒载体；通过接合、基因转移等增加这些基因在染色体中的拷贝数；将突变引入这些基因的启动子区；或将启动子用更强的启动子替代(参考InternationalPatentPublicationWO00/18935)。当扩增质粒或染色体中的基因时，用于基因表达的启动子可以是任何启动子，只要选择在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子，而且可为所使用的基因的固有启动子。还能够通过适当地选择启动子来控制基因的表达量。经修饰以使柠檬S吏合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、谷氨酸脱氢酶基因和/或异柠檬酸脱氢酶基因的表达增强的棒状杆菌型细菌的实例包括InternationalPatentPublicationWO00/18935和EuropeanPatentPublicationNo.1010755中描述的微生物。此外，也可以通过降低或缺失下述酶的活性来获得赋予产生L-谷氨酸的能力的修饰，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的反应以产生另外的化合物。催化合成除L-谷氨酸以外化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶、a-酮戊二酸脱氢酶、乙酰磷酸转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰曱酸转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、l-吡咯啉脱氢酶(l-pyrrolinedehydrogenase)等。为了降低或缺失上述酶中任一种的活性，可以通过常规诱变方法，将降低或缺失所述酶胞内活性的突变引入染色体上前述酶的基因中。例如，其能够通过缺失染色体上编码所述酶的基因，或通过基因重组修饰表达调控序列如启动子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操纵基因、终止子和弱化子来实现。此外，其能够通过引入氨基酸取代的突变ei晉义突变)、终止密码子(无义突变)或在染色体上的酶编码区中添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变来实现，或通过将基因部分或整体地缺失来实现(JoumalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997))。此外，还能够通过构建编码突变酶的基因来使酶活性降低或缺失，其中将编码区缺失，并且通过同源重组等用构建的基因取代染色体上的正常基因。a-酮戊二酸脱氢酶活性降低的棒状杆菌型细菌的实例包括以下菌才朱，其在JapanesePatentLaid-openNos.07-834672、06-237779、01-296994等中描述。乳发酵短杆菌AS菌抹(W095/34672)乳发酵短杆菌AJ12821菌抹(FERMBP-4172;参见FR9401748)黄色短杆菌AJ12822菌林(FERMBP-4173;参见FR9401748)谷氨酸棒杆菌AJ12823菌株(FERMBP-4174;参见FR9401748)赋予产生L-谷氨酸的能力的其它方法包括赋予对有机酸类似物或呼吸抑制剂的抗性，或赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性。这些方法的实例包括，例如赋予只于苯并p比喃酮(benzopirone)或萘醌类(naphtoquinones)的抗性(JP56-1889A)，赋予对HOQNO的抗性(JP56-140895A),赋予对a-酮丙二酸的抗性(JP57-2689A),赋予对胍的抗性(JP56-35981A)，赋予对青霉素的敏感性(JP04國88994A)等。这些细菌的实例包括以下菌抹黄色短杆菌AJ11355(FERMP-5007;JP56-1889A)谷氨酸棒杆菌AJ11368(FE函P-5020;JP56-1889A)黄色短杆菌AJ11217(FERMP-4318;JP57-2689A)谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERMP-4319;JP57-2689A)黄色短杆菌AJ11564(FERMP-5472;JP56-140895A)黄色短杆菌AJ11439(FERMP-5136;JP56-35981A)谷氨酸棒杆菌H7684(FERMBP-3004;JP04-88994A)本发明的棒状杆菌型细菌获得自亲本菌抹，所述亲本菌抹也可以是在诱导L-谷氨酸产生的条件下产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌，所述条件如限制生物素的条件、添加表面活性剂的条件和添加青霉素的条件(为了方便，在下文中称作"产生L-谷氨酸的条件")。"产生L-谷氨酸的条件"意指将诱导L-谷氨酸产生的物质添加至培养基的条件，所述培养基含有碳源、氮源、无机盐和痕量有机营养物，例如氨基酸和维生素(如有需要)；和对培养基中抑制L-谷氨酸产生的物质的量进行限制的条件。诱导L-谷氨酸产生的物质包括抗生素如青霉素G和包括饱和脂肪酸的表面活性剂如Tween40、60等。抑制L-谷氛酸产生的物质包括生物素(AminoAcidFermentation,JapanScientificSocietiesPress1986)。在本文中，在产生L-谷氨酸的条件下培养基中以上物质的浓度如下。生物素的浓度少于30(xg/L，优选少于20[ig/L,更优选少于10jig/L，并且所述培养基可以完全不含生物素。培养基中青霉素的浓度不少于0.1U/ml，优选不少于0.2U/ml,更优选不少于0.4U/ml。培养基中表面活性剂的浓度不少于0.5g/L，优选不少于lg/L,更优选不少f2g/L。然而，只要诱导L-谷氨酸的产生，这些物质的任何浓度均可以应用。此外，当培养基含有抗生素或表面活性剂时，优选所述培养基含有高浓度的生物素。在这种情况下，优选所述培养基含有多于50jig/L，优选多于100pg/L,更优选多于200吗/L的生物素。本发明中使用的亲本菌林的实例包括上述的棒状杆菌型细菌的野生型菌才朱，或以下菌才朱黄色短杆菌AJ11217(FERMP-4318;JP57-2689A)谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERMP國4319;JP57-2689A)乳发酵短杆菌AJ11426(FERMP-5123JP56-048890A)谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERMP-5137JP56-048890A)乳发酵短杆菌AJ11796(FERMP-6402JP58-158192A)本发明的棒状杆菌型细菌是具有前文所述的产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，并且经修饰以使g/wZ基因失活。能够通过修饰具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌以使g/wX基因失活来获得本发明的棒状杆菌型细菌。在本发明的棒状杆菌型细菌的培育中，既可以首先进行产生L-谷氨酸能力的赋予，也可以首先进行使g/wX基因失活的修饰。表述"修饰以使g/MX基因失活"相应于下述情况与亲本菌抹或野生型菌抹相比，由g/^Z基因编码的GluX蛋白的每细胞分子数降低；每分子GluX蛋白的活性降低；完全不再产生GluX蛋白分子等。例如，该表述意指与未修饰的菌抹或野生型菌抹相比，由g/wZ基因编码的蛋白质的量降低；g/wl基因的表达量降低；对所述蛋白质的三维结构进行修饰，并且由此不能产生正常的GluX蛋白；或完全不能产生棒状杆菌型细菌的野生型菌抹或未修饰菌林能够产生的GluX蛋白。作为参照用于比较的野生型棒状杆菌型细菌是例如谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869或ATCC13032。能够通过与野生型或未经修饰的菌抹比较g/wX的mRNA量来确认g/wX基因表达量的降低。用于确认表达量的方法的实例包括Northem杂交和RT-PCR(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)2001)。只要与野生型菌株或未修饰菌林相比有所降低，不对表达量的降低程度作具体限制。然而，期望与野生菌株或未修饰菌林相比降低例如至少75%、50%、25%或10%或更少，或可以将表达完全消除。能够通过基于使用抗体的Western印迹的检测来确认由g/wJT基因编码的蛋白质的量的P争j氐(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA)，2001)。只要与野生型菌抹或未修饰菌林相比有所降低，不对产量的降低程度作具体限制。然而，期望与野生菌株或未修饰菌林相比降低例如至少75%、50%、25%或10%或更少，或可以将活性完全消除，其意味着完全不产生所述蛋白质。由g/wX基因编码的本发明所指的蛋白质(GluX蛋白)是通过失活染色体上的g/MZ基因而具有改进L-谷氨酸产量的功能的蛋白质。在本文中，棒状杆菌型细菌的GluX蛋白的实例包括由谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869或谷氨酸棒杆菌ATCC13032的g/wZ基因(SEQIDNO:16的核苷酸号1001至1279)编码的蛋白质(SEQIDNO:17)。谷氨酸棒杆菌ATCC13032的g/wX基因由登记为GenbankAccessionNo.NC—003450的基因组序列的核香酸2475838至2476119编码，并且登记为NCg12252。此外，因为g/^X基因的核苷酸序列可能依赖于棒状杆菌型细菌的菌种或菌林而有差异，g/wZ基因可以是SEQIDNO:16的核苷酸号1001至1279的核香酸序列的变体。参照SEQIDNO:16的核苷酸号1001至1279的核苷酸序列，4吏用BLAST或类似方法(http://blast.genome.jp/),能够搜索g/wX基因的变体。此外，g/wX基因的变体包括g/wZ基因同源物(homologue)，例如，能够使用棒状杆菌型细菌的染色体作为模板和SEQIDNOS:13和14的合成寡核苷酸通过PCR扩增的基因。GluX蛋白的实例包括具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的那些。然而，因为使用的密码子可能依赖于棒状杆菌型的菌种或菌抹而有差异，并且所述编码GluX的基因的核苷酸序列可能有差异，g/wZ可以编码包括取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基的如上所述的氨基S臾序列，只要不改变GluX蛋白的功能。在本文中，术语"几个"所指的数目是例如2至20，优选2至10，更优选2至5。前述取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基是保守突变，所述保守突变允许正常产生GluX蛋白。保守突变包括在芳族氨基酸的情况下Phe、Trp和Tyr的相互取代；在疏水氨基酸的情况下Leu、Ile和Val的相互取代；在极性氨基酸的情况下Gln和Asn的相互取代；在碱性氨基酸的情况下Arg、Lys和His的相互取代；在酸性氨基酸的情况下Asp和Glu的相互取代；和在含羟基氨基酸的情况下Ser和Thr的相互取代。典型的保守突变是保守取代，所述保守取代包括以Ser或Thr取代Ala,以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn,以Asn、Glu或Gln耳又代Asp，以Ser或Ala取代Cys,以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg耳又代Gln，以Gly、Asn、Gln、Lys或Asp耳又代Glu,以Pro耳又代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr耳又代His,以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val、Phe取代Leu,以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala耳又代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr和以Met、Ile或Leu取代Val。g/wZ基因的变体还可以是能够与由SEQIDNO:16的1001至1279组成的核苷酸序列或能够从所述核芬酸序列制备的探针在严紧条件下杂交的DNA。所述"严紧条件"是形成所谓的特异性杂合体(hybrid),而不形成非特异性杂合体的条件。严紧条件的实例包括那些条件，在该条件下高度同源的DNA互相杂交，例如，不少于80、90、95或97。/。同源的DNA相互杂交，并且比以上所述同源性^^的DNA不相互杂交；或在相应于常^见Southem杂交洗涤的盐浓度和温度下，即lxSSC、0.10/。SDS在60。C,优选O.lxSSC、0.1%SDS在60。C，更优选0.1xSSC、0.1%SDS在68。C洗涤一次或优选2或3次。4笨针的长度可以依赖于杂交条件任意地选择。但是，所述长度通常是100bps至lkbps。表述"修饰以使g/wZ基因失活"的意思是进行修饰以使GluX蛋白不发挥正常功能。以这种方式修饰的细菌能够通过培育以下细菌获得使用试剂等将突变引入GluX蛋白中以使所述蛋白质不正常发挥功能的细菌；通过基因工程技术等将突变引入g/MZ基因中以使GluX蛋白的量降低的细菌；或不再产生GluX蛋白的细菌等。这可以通过例如缺失染色体上的g/wZ基因，或通过修饰表达调控序列例如启动子、ShineDargarno(SD)序列等来完成。此外，所述修饰还可以通过引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)或在编码区添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或通过缺失部分或完整的基因来完成(JoumalofbiologicalChemistry272:8611-8617(1997)，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA955511-5515(1998),JournalofBiologicalChemistry266,20833-20839(1991》。作为待缺失的区域，可以将N-末端侧的区域或C-末端侧的区域缺失，只要产生不正常发挥功能的GluX蛋白。此外，还能够通过将转座子引入g/wZ的编码区来获得g/wX基因的失活，所述转座子携带抗生素抗性基因或对L-谷氨酸的产生有用的基因。能够通过例如以下方法实现将如上所述的这些突变引入g/Ml基因制备通过修饰获得的缺失型基因，所述修饰使基因包括部分g/^Z序列的缺失并且不产生正常发挥功能的GluX蛋白；和用含有所述基因的DNA转化棒状杆菌型细菌，以引起缺失型基因和染色体上基因的同源重组，并且因此破坏染色体上的g/wX基因。已经确定了这种基于同源重组使用基因取代的基因破坏，并且这种方法的实例包4舌DatsenkoandWanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000，Vol.97，No.12,pp.6640-6645)开发的称为"Red-driven整合"的使用线性DNA的方法，或使用含有温度每文感复制起点的质粒的方法(U.S.PatentNo.6,303,383，JapanesePatentLaid-openNo.05-007491)等。此外，这种如上所述使用同源重组基于基因取代的基因破坏还能够使用质粒进行，所述质粒在宿主中不显示复制能力，或所述质粒能够接合转移至棒状杆菌型细菌。用于^f奉状杆菌型细菌的温度專丈感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(对于这些参见JapanesePatentLaid-openNo.2000-262288),pHSC4(参见FrenchPatentLaid-openNo.2667875,1992andJapanesePatentLaid-openNo.5-7491)等。在棒状杆菌型细菌中，这些质粒能够在至少25。C自主复制，但是不能在37。C自主复制。将含有pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在国立生命科学和人体技术研究所(theNationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,theAgencyofIndustrialScienceandTechnology,theMinistryofInternationalTradeandIndustry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许《鼓生物保藏中心(TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan,邮编305-5466))，并得到保藏号FERMP-ll763。然后根据布达佩斯条约的规定，在1991年8月26日将所述保藏转化为国际保藏，并得到保藏号FERMBP-3524。作为不在棒状杆菌型细菌中复制的质粒，优选在大肠杆菌中能够复制的质粒，实例包括pHSG299(TakaraBioInc.)、pHSG399(TakaraBioInc.)等。能够接合转移的质粒的实例包括pK19mobsacB(J.Bacteriology,174:5462-65(1992))。经修饰而不产生GluX蛋白的缺失型基因的实例包括包括SEQIDNO:16的整体或部分区域缺失的基因；引入错义突变的基因；插入转座子或标记基因的基因；引入无义突变的基因；和引入移码突变的基因；但是实例不限于这些基因。g/wX基因的失活可以通过以下方法进行。g/wZ基因的缺失型基因能够通过以下方法获得。g/t/X基因能够如下获得通过SaitoandMiura(参见H.SaitoandK.Miura，Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963》TextforBioengineeringExperiments,EditedbytheSocietyforBioscienceandBioengineering,Japan,pp.97-98,Baifukan，1992)的方法，从棒状杆菌型细菌制备染色体DNA;和使用寡核苷酸用所述染色体DNA进行PCR，所述寡核苷酸基于已知数据库如Genbank的序列构建，并且能够使用SEQIDNOS:13和14的合成寡核苦酸克隆基因。能够通过如下获得缺失型基因用PCR扩增全长g/wZ基因，并且用切割内部位点的限制酶消化PCR产物；或用PCR扩增g/wZ基因的编码区部分。随后，将缺失型基因引入棒状杆菌型细菌中温度敏感的质粒，或在棒状杆菌型细菌中不能复制的质粒；并且用所述重组质粒转化棒状杆菌型细菌。转化可以根据至今已经报导的方法进行。转化方法的实例包括用氯化4丐处理受体细胞以增加DNA透过性，已有报导将该方法用于大肠杆菌K-12(Mandel，MandHiga,A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970》；和/人处于生长期的细月包制备感受态细胞，接着用DNA转化，已有报导将该方法用于枯草芽孢杆菌C6adssw6"嗣(Duncan,C.H.,Wilson,GA.andYoung,F.E.,Gene,1,153(1977))。或者，也可以采用将重组DNA引入受体细胞，已有报导可将这种方法用于枯草芽孢杆菌、放线菌类和酵母的受体细胞(Chang,S.andChoen，S.N.,Molec.Gen.Genet.，168，111(1979);Bibb,M丄，Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hi画n,A.,Hicks，J.B.andFink,GR.,Proc.Natl.Sci"USA,75，1929(1978))。此外，也能够通过电脉冲方法进行棒状杆菌型细菌的转化(JP2-207791A)。当使用在棒状杆菌型细菌中不复制的质粒进行转化时，在如上所述获得的转化体中质粒上的g/wI基因和染色体上的g/^X基因进行重组。当使用温度敏感质粒时，将转化体在温度敏感复制起点不发挥功能的温度(25。C)培养以获得引入所述质粒的菌林。将引入所述质粒的菌抹在高温培养以消除温度敏感质粒，并且将这种菌抹涂布在含有抗生素的平板上。由于温度敏感质粒不能在高温增殖，将质粒消除的菌林无法在含有抗生素的平板上生长，但是质粒上的g/wZ基因和染色体上的g/wZ基因重组的菌抹将出现，尽管这种菌株出现的概率极低。在如上所述染色体中引入了重组DNA的菌株中，引起与原先存在于染色体上的g/wJT基因序列的重组，并且因此在染色体中插入染色体g/wX基因和缺失型g/wZ基因的两种融合基因，和所述融合基因之间的重组DNA的其它部分(载体部分、温度每文感复制起点和药物抗性标记)。然后为了在染色体DNA上只保留缺失型g/wX基因，将g/^Z基因与载体部分(包括温度敏感复制起点和药物抗性标记)一起从染色体DNA上消除。在这种情况下，将正常g/wZ基因保留在染色体DNA上，并且将缺失型g/wZ基因切除；或与之相反，将缺失型g/wZ基因保留在染色体DNA上，并且将正常g/wX基因切除。通过用PCR或Southem杂交来选择将缺失型g/wX基因保留在染色体上的菌抹，能够获得将g/wZ基因破坏的菌抹。此外，在棒状杆菌型细菌中发挥致死功能的编码果聚糖蔗糖酶的MC^基因，也可以用作同源重组的标记(Schafer,A.etal.，Gene,145,pp.69-73(1994》。即，如果果聚糖蔗糖酶在棒状杆菌型细菌中表达，由蔗糖同化产生的果聚糖发挥致死功能，因而所述细菌不能生长。因此，如果将编码果聚糖蔗糖酶的载体保留在染色体上的菌林在含有蔗糖的平板中培养，所述菌抹不能生长，因此只有消除所述载体的菌林能够在含有蔗糖的平板上选出。作为^cS基因或其同源基因，可以使用以下序列。枯草芽孢杆菌^c5GenBankAccessionNumberX02730(SEQIDNO:7)解5定4分芽孑包^干菌(5flc/〃wsam_y/o//《we々c/em):sacSGenBankAccessionNumberX52988运动发酵单胞菌(Z，owo"osmoM/力sacBGenBankAccessionNumberL33402嗜热月旨肪芽孑包杆菌(5腦7/wsWewo/ZzemopM"":swr万GenBankAccessionNumberU34874丄acto6腦7/wsa腦、ce服S:GenBankAccessionNumberAJ508391Jceto&"erxy/zV2紅/sx4GenBankAccessionNumberAB03415214G7wcowaceto6ac^d/azo/ra//z/c紅Zs<iv4GenBankAccessionNumberL41732除了前文所述的将染色体上编码g/wX的基因缺失之外，还能够通过引入通过修饰表达调控序列如启动子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操纵基因、终止Genetix,或用于表达分析的载体如启动子探针载体，或基于已知信息如获得自Genbank等的信息，能够确定染色体上的表达调控序列。使g/^Z失活的突变是例如用较弱启动子取代g/wZ启动子区的突变，或使启动子远离共有序列的突变。使用温度敏感质粒或不具有复制能力的质粒能够实现这些突变的引入，如前文所述的情况。除了前文所述的基因操作方法之外，用于使g/wl失活的方法的实例包括，例如，用紫外照射或用于常规诱变的诱变剂如N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理棒状杆菌型细菌，并且选择g/wZ失活的菌抹。此外，还能够通过用基于易错PCR、DNA改组或SffiP-PCR(FirthAE,PatrickWM，Bioinformatics,2005Jun2,Statisticsofproteinlibraryconstruction)的基因重纟且人工将突变引入g/wX来获得失活的g/wX基因。<3>使用本发明的棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸能够通过如下方法有效地产生L-谷氨酸在培养基中培养如上所述获得的棒状杆菌型细菌，以在培养基中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。为了使用本发明的棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸，可以通过常规方法使用普通培养基进行培养，所述普通培养基含有碳源、氮源、无机盐和任选地有机微量营养物(micronutrients)如氨基酸和维生素。可以使用合成培养基或天然培养基。可以使用任何种类的碳源和氮源，只要它们能够被所培养的菌林利用。糖类例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等可以用作碳源。另外，有机酸例如乙酸和柠檬酸，和醇例如乙醇也可以单独使用或与其它碳源组合使用。氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸盐等可以用作氮源。可将氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，和含有这些物质的胨、酪蛋白氨基酸(casaminoacid)、酵母提取物和大豆蛋白分解物用作有机樣i量营养物。当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌林时，优选加入这样的所需的营养物。磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等可以用作无机盐。通过将发酵温度控制在20至45。C并且将培养基的pH调节至5-9来进行需氧培养。在培养期间当pH降低时，通过添加碱例如碳酸4丐或氨气来中和培养基。培养大约10至大约120小时导致在培养基中积累可观量的L-谷氨酸，其通过利用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生。当用于本发明的棒状杆菌型细菌是在诱导L-谷氨酸产生的条件如限制生物素的条件、添加表面活性剂的条件和添加青霉素的条件下产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌时，优选将培养基调节至这些L-谷氨酸产生条件中的任一。在本文中，以上物质在培养基中的浓度如下。生物素的浓度少于30吗/L,优选少于20吗/L，更优选少于10pg/L,并且所述培养基可以完全不含生物素。培养基中青霉素的浓度不少于O.lU/ml，优选不少于0.2U/ml，并且更优选不少于0.4U/ml。培养基中表面活性剂的浓度不少于0.5g/L，优选不少于lg/L，更优选不少于2g/L。然而，只要诱导L-谷氨酸的产生，这些物质的任何浓度均可应用。将抗生素或表面活性剂加入培养基时，优选所述培养基含有足够量的生物素。在这种情况下，优选所述培养基含有多于50吗/L,优选多于IOO吗/L，并且更优选多于200吗/L的生物素。此外，还能够使用液体培养基以在培养基中使L-谷氨酸析出的方式进行培养，将所述液体培养基调节至L-谷氨酸在培养基中析出的条件。L-谷氨酸析出的条件的实例包括pH5.0-4.0，优选pH4.5至4.0,更优选pH4.3至4.0,特别优选pH4.0。在培养之后可以通过已知方法从培养基中收集L-谷氨酸。例如，通过从培养基中去除细胞，和通过浓缩引起结晶，通过离子交换层析等来完成收集。当在L-谷氨酸析出的条件下进行培养时，可通过离心或过滤来收集培养基中析出的L-谷氨酸。在这种情况下，可以将溶解在培养基中的L-谷氨酸析出然后一起分离。实施例在下文中，将参考以下实施例对本发明进行具体说明。然而，本发明不限于所述实施例。实施例l:用于破坏^c5基因的载体的构建(A)pBS3的构建使用枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板和SEQIDNOS:l和2的寡核苦酸作为引物通过PCR获得^W基因(SEQIDNO:7)。使用LATaq(TaKaRa)进行PCR,在94。C温育5分钟，并且将94。C变性30秒、49。C退火30秒和72。C延伸2分钟的循环重复25次。将PCR产物以常规方式纯化，然后通过用Sg/II和5amHI的消化来平端化。将这种片^a插入已经用爿vall切割并且平端化的pHSG299。使用这种DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakamBioInc.)，并且将所述细胞涂布在含有25吗/ml卡那霉素(以下简写为Km)的LB培养基上，培养过夜。其后，收集出现的菌落，并且分离独立的单菌落以获得转化体。从所得转化体提取质粒，并且将插入了目标PCR产物的质粒命名为pBS3。pBS3的构建方案示于图l。(B)pBS4S的构建由于pBS3中存在的卡那霉素抗性基因中含有限制酶Smal的识别位点，通过交换PCR获得携带6Vwal位点被破坏的卡那霉素抗性基因的质粒，所述破坏通过不引起氨基酸取代的核普酸取代进行。首先，使用pBS3作为模板和SEQIDNOS:3和4的合成DNA作为引物进行PCR以获得卡那霉素抗性基因N末端侧序列的扩增产物。然后，为了获得Km抗性基因C末端侧序列的扩增产物，使用pBS3作为模板和SEQIDNOS:5和6的合成DNA作为引物进行PCR。目标PCR产物能够通过使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBioInc.)如下进行PCR来获得在98。C温育5分钟，并且将98。C变性10秒、57。C退火30秒和72。C延伸1分钟的循环重复25次。SEQIDNOS:4和5的序列彼此部分互补，并且曾经存在于这些序列中的5V^I位点已通过不引起氨基酸取代的核香酸取代破坏。其后，为了获得将Smd位点破坏的突变卡那霉素抗性基因片段，将前述卡那霉素抗性基因的N末端侧序列和C末端侧序列的基因产物以基本上等摩尔地混合，并且使用这种混合物作为模板和SEQIDNOS:3和6的合成DNA作为引物进行PCR，以获得引入了突变的Km抗性基因的扩增产物。能够通过使用PyrobestDNAPolymerase(TakaraBioInc.)如下进行PCR来获得PCR产物在98。C温育5分钟，并且将98。C变性10秒、57。C退火30秒和72。C延伸1.5分钟的循环重复25次。将PCR产物以常规方式纯化，然后用万fl"II消化，并且插入上述pBS3的5a"II位点。用获得的DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraBioInc.),并且将细胞涂布在含有25吗/ml卡那霉素的LB培养基上，并培养过夜。其后，将单菌落从出现的菌落中分离以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒，并且将插入了目标PCR产物的质粒命名为pBS4S。pBS4S的构建方案示于图2。实施例2:谷氨酸棒杆菌ATCC13869的g/wX缺陷型菌抹的制备制备用于缺失g/wX基因的质粒。使用BacterialGenomicDNAPurif.Kit(MSTechnoSystems)从谷氨酸棒杆菌ATCC13869提取染色体，并且使用这种染色体作为模板，以及SEQIDNOS:9和10的引物组合，和SEQIDNOS:11和12的引物组合，分别扩增大约650bp的片段。使用ExTaq(TakaraBioInc.)进行PCR，其中将94。C变性30秒、55。C退火30秒和72。C延伸1分钟的循环重复25次。设计引物SEQIDNOS:9和10以扩增SEQIDNO:16的核香酸号401至1040的区域，并且设计引物SEQIDNOS:11和12以扩增SEQIDNO:16的核香酸号1241至1920的区域。其后，将这两种片段混合制成溶液，使用这种溶液作为模板和SEQIDNOS:13和14的引物进行PCR以扩增大约1.3kb的片段。使用ExTaq(TakaraBioInc,)进行PCR,其中将94。C变性30秒、55。C退火10秒和72。C延伸1.5分钟的循环重复25次。设计引物SEQIDNOS:13和14以将S"mHI序列添加至5，端，并且扩增SEQIDNO:16的核苦酸号441至1870的区域(包括核苷酸号1041至1240区域的缺失)。将扩增的片段用B"wHI完全消化，并且连接至已经相似地用SamHI完全消化的实施例1中所述的pBS4S载体(使用LigationKitVer.2(TakaraBioInc.)),以构建g/wX破坏的载体pBSGXD。构建方案示于图3。将pBSGXD通过电脉冲方法(JapanesePatentLaid-openNo.2画207791)引入谷氨酸棒杆菌ATCC13869，并且将细胞涂布在含有25吗/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/l葡萄糖、10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、1g/lKH2P04、0.4g/lMgSO4.7H2O、0.01g/lFeS04.7H20、0.01g/1MnS04.4-5H20、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物、20g/l琼脂，用NaOH调节至pH7.5)上。在31.5。C进行培养，然后通过PCR确认了生长的菌林是通过同源重组将pBSGXD并入染色体中的一次重组菌抹(onetime-recombinantstrain)。能够使用菌抹的染色体作为模板，pBS4S上的特异性序列(SEQIDNO:15)和染色体上的序列(SEQIDNO:9)作为引物通过进行PCR来筒单地确认候选菌抹是否为一次重组菌林。由于pBS4S的序列不存在于非重组菌株的染色体上，PCR扩增的任何片段都不会出现于(appearfor)非重组菌林，由此能够进行鉴别。将获得的一次重组菌抹在含有25吗/ml卡那霉素的CM-Dex液体培养基中在31.5。C培养一整天，并且将这种培养液适当地稀释，再涂布至S10平板上(具有上述CM-Dex培养基的成分，其中将5g/l葡萄糖用100g/l蔗糖替换)。选择了几个在S10平板上生长并且表现出卡那霉素敏感性的菌株，并且使用这些菌抹的染色体作为才莫板和SEQIDNOS:13和14的序列作为引物进4亍PCR,确认了它们之中的一个菌抹是目标的g/MX缺陷型菌林。由于在缺陷型菌抹中缺失核苷酸号1041至1240的区域，所以扩增的片段短于非缺陷型菌抹的扩增片段，因此能够进行鉴别。将如所述获得的缺陷型菌抹命名为ATCC13869AgluX。实施例3:ATCC13869AgluX菌林的谷氨酸产量的测量通过使用Sakaguchi摇瓶进行培养来检验ATCC13869AgluX菌抹的谷氨酸产生能力。将ATCC13869和ATCC13869AgluX菌林在31.5。C在CM-2B琼脂培养基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl、10jig/l生物素、20g/l琼脂，用KOH调节至pH7.0)上培养一整天，并且接种至20ml种子培养基(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、Ig/1KH2P04、0.4g/1MgS04'7H20、0.01g/1FeSO(7H20、0.01g/lMnS04'4-5H20、200昭/l维生素Bl、0.48g/l大豆蛋白水解物、300生物素，用KOH调节至pH8.0)中。将lg事先经过干热灭菌的碳酸钓添加至培养基，其后在31.5。C以115rpm的速度摇动进行培养。在确认了全部糖被完全消耗之后，将lml种子培养液接种至20ml主培养基中(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/1KH2P04、0.4g/1MgS04'7H20、0,01g/1FeS04.7H20、0.01g/1MnS04'4-5H20、200吗/l维生素Bl、0.48g/l大豆蛋白水解物、300pg/l生物素，用KOH调节至pH8.0)，其后添加lg事先经过干热灭菌的碳酸4丐，然后在31.5。C以115rpm的速率摇动进行培养。在开始培养2.5小时之后，添加4g/1Tween40(Sigma)。17.5小时后的细胞量(在620nm测量吸光度)、积累的谷氨酸量和残余的糖量示于表l。确认了ATCC13869AgluX菌株的谷氨酸积累与ATCC13869相比有增加，并且由此确认了g/^Z基因的缺失对于改进谷氨酸产生有效。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>工业实用性根据本发明，在使用棒状杆菌型细菌通过发酵产生L-谷氨酸的方法中能够将L-谷氨酸的发酵收率(fermentationyield)增加。此外，本发明能够用于培育产生L-谷氨酸的细菌。权利要求1.具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，对所述棒状杆菌型细菌进行修饰以使gluX失活。2.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，通过在染色体上的g/wX基因或其表达调控区中引入突变来修饰所述棒状杆菌型细菌，以使g/^r基因的表达量降低。3.根据权利要求1或2的棒状杆菌型细菌，其中将染色体上的所述g/^基因破坏。4.用于产生L-谷氨酸的方法，所述方法包括将根据权利要求l-3任一项的棒状杆菌型细菌在培养基中培养以产生和积累L-谷氨酸，和从所述培养基中收集L-谷氨酸。全文摘要用于产生L-谷氨酸的方法，其包括在培养基中培养具有产生L-谷氨酸的能力并且经修饰以使gluX失活的棒状杆菌型细菌，以在培养基或细胞中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。文档编号C12N1/21GK101248169SQ20068003115公开日2008年8月20日申请日期2006年8月23日优先权日2005年8月26日发明者中村纯,伊藤久生,平野圣子申请人:味之素株式会社