专利名称：来自actinobacillus succinogenes 130z(atcc 55618)用于从a.succinogenes c4-途径 ...的制作方法
技术领域：
本发明 一般地涉及代谢工程，更具体地，涉及工程化 Actinobacillus succinogenes以生产4b学产品(Chemicals) , ^口坡3白&复
(succinate)、延胡索酸(fumamte)、苹果酸(malate) 、 5-氨基乙酰 丙&复(5-aminolevulinate ) 、 2-酉同戊二酉菱(2画oxoglutarate )、 谷氨酉臾
(glutamate)、以及天冬氨酸(aspartate)。具体地，本发明涉及抑制 C3途径酶并过度表达C4途径酶。本发明还涉及提高将底物供应至C4 途径的通量(flux)。本发明还涉及提高来自C4途径的产品的分泌率。
b. 相关技术的描述琥珀酸具有许多工业精细化学应用。琥珀酸还可以用作用于 生产大的化学产品(bulk chemicals )的中间商品化学给料。它最大的市 场潜能也许在于其作为给料用于生产强于钢铁的塑料、生物可降解的螯 合剂、以及绿色溶剂(green solvent)。每年销售的17,000吨(15,400 公吨)琥珀酸的大部分是从马来酸以石油化学方式生产的。琥珀酸也通 过葡萄糖发酵作为精细化学产品生产。为了使发酵在生产作为商品化学 产品的琥珀酸中具有竟争力，全部生产成本应当/人每磅一 (1)美元 ($2.20/kg)降低到约每磅二十(20)美分(44美分/kg)。
授予Datta等人的美国专利No.5,143,833教导了一种通过在 净争定条"f牛下培养生产琥王白酉交^J Anaerobiospirillum succiniciproducens樣i 生物来生产琥珀酸的方法。授予Donnelly等人的美国再7>告(Reissued)专利第 RE37,393号教导了 一种用于分离产生琥珀酸的细菌的方法，所述方法通 过提高缺乏分解代谢丙酮酸的能力的有机体的生物物质(biomass),随 后在厌氧环境下在富含葡萄糖的培养基中生长所述生物物质，以使分解 代谢丙酮酸的突变体能够生长。通过这种方法，Donnelly提供了能够大 量生产琥珀酸的突变体E. coli。所述突变体Escherichia coli来源于缺乏 丙酮酸甲酸裂合酶和乳酸脱氢酶的基因的母体。均授予Gokarn等人的美国专利第6,455,284号和美国专利申 请公开第2003/0087381号教导了代谢工程，以提高朝向草酰乙酸 (oxaloacetate )的碳流，以提高细菌和工业发酵中大的生化制品(如赖 氨酸和琥珀酸)的产量。通过基因工程化细菌以过度表达酶-丙酮酸羧化 酶而^f吏所述-友流重新定向。授予Lee等人的美国专利申请公开第2003/0113885号教导 了一种能够产生有机酸的新型微生物Mannheimia sp. 55E,以及通过缺 氧和有氧培育而将所述微生物用于生产有机酸的方法。授予Eikmanns等人的美国专利第6,420,151号教导了编码磷 酸烯醇式丙酮酸羧激酶的来自棒状杆菌的分离的核酸，其涉及琥珀酸的 生产。授予Guettler等人的美国专利第5,504,004号和5,723,322号 教导了用于制备琥珀酸的方法，教导了用于所述方法的新型微生物 Actmobacillus succmogenes 130Z,以及获得所述樣i生物的方法。授予Guettler等人的美国专利第5,573,931号教导了用于制 备琥珀酸的方法、用于所述方法的A. succmogenes变异体，以及用于获 得所述变异体的方法。虽然上述方法可以用于生产琥珀酸，但是Actmobacillus succinogenes仍然是已知的最好的琥珀酸生产者。A. succinogenes是属 于Pasteurellaceae的革兰氏阴性的嗜二氧化碳的(capnophilic )、厌氧 杆菌。在最佳条件下A. succmogenes生产最多一百(100)克/升的琥珀 酸。在工程化E. coli菌抹以大量生产琥珀酸方面已经付出了很多努力，但是没有一种工程化的E. COll菌抹在琥珀酸生产方面超过A.succmogenes。碳流在微生物代谢中被严格调节，包括朝向草酰乙酸的碳 通量。克服这种碳通量的控制将可能提高想要的产物(如琥珀酸、延胡 索酸、苹果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、和谷氨酸)的产量。
虽然相关技术教导了琥珀酸的生产，但是仍然存在对改进的 生产化学产品(如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮 戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸)的方法的需要，所述方法通过抑制C3 途径酶和过度表达C4途径酶，并且还通过提高供应底物到C4途径的通 量和提高产品的分泌率来进行。发明目的
因此，本发明的一个目的在于提供能够被过度表达、敲除、 或改变以有益于化学产品生产的基因序列。
本发明的另一目的在于提供工程化A. succmogenes的方法， 以便通过过度表达和/或抑制这些基因来生产化学产品，如琥珀酸、延胡 索酸、苹果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸。
通过参考下面的描述，这些目的和其它目的将逐渐变得显而 易见。发明内容
本发明提供了用于生产琥珀酸的方法，包括提供包括一种 或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A. succmogenes, 所述C3酶选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶(pyruvate-formate lyase)、丙酮酸脱氢酶、及其组合构成的组；提供用于培养所述基因工 程化的A. succmogenes的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所 述基因工程化的A. succmogenes以生产琥珀酸。
本发明提供了用于生产琥珀酸的方法，包括提供能够过度 表达C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶选自由磷酸烯醇 式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还 原酶、及其组合构成的组；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工 程4t的A. succmogenes以生产琥珀酸。
本发明提供了用于生产琥珀酸的方法，包括提供基因工程 化的A. succmogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰 并且能够过度表达C4酶，所述C3酶选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸 裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其组合构成的组，所述C4酶选自由PEPCK、 苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合构成的组；提 供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基；以及在所 述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以生产琥珀酸。 在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括对 一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因进行的修饰，所述基因选自苹 果酸酶和草酰乙酸脱羧酶构成的组。在另外的实施方式中，所述基因工 禾呈化的A. succinogenes进一步包括才是高通过Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)途径的通量(flux)的一种或多种基因的修饰。在另外的实施 方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括提高通过戊糖石岸 酸途径(PPP)的通量的一种或多种基因的修饰。在另外的实施方式中， 所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括抑制苹果酸酶的基因敲除 或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一 步包括抑制草酰乙酸脱羧酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中， 所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括提高底物摄取的 一种或多 种基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 进一步包括提高底物摄取的一种或多种基因的修饰，所述底物选自阿拉 伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的实施方式中，所述基 因工程化的A. succmogenes进一步包括提高化学产品分泌(chemical excretion)的一种或多种基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种 或多种基因编码二羧酸转运体(dicarboxylate transporters )。
本发明提供了用于生产延胡索酸的方法，包括提供包括一 种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A. succmogenes, 所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脱氲酶、及其 组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培养基； 以及在所述生长培养基中培养所述基因工程4t的A. succmogenes以生产 延胡索酸。
本发明提供了生产延胡索酸的方法，包括提供能够过度表 达C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶选自PEPCK、苹果酸脱氲酶、延胡索酸酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因 工程化的A. succmogenes以生产延胡索酸。
本发明提供了生产延胡索酸的方法，包括提供基因工程化 的A. succmogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰并 且能够过度表达C4酶，所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合 酶、丙酮酸脱氩酶、及其组合，所述C4酶选自PEPCK、苹果酸脱氲酶、 延胡索酸酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes 的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以生产延胡索酸。在另外的实施方式中，所述基因工程化 的A. succmogenes进一步包括一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因 的修饰，所述基因选自苹果酸酶和草酰乙酸脱羧酶。在另外的实施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制延胡索酸还原酶 的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种提高通过(EMP )途径的通量的基 因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进 一步包括一种或多种提高通过PPP的基因的修饰。在另外的实施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制苹果酸酶的基因 敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes 进一步包括抑制草酰乙酸脱羧酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种提高底物 摄取的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基因提高底 物的摄取，所述底物选自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。 在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一 种或多种提高化学产品分泌的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述 一种或多种基因编码二羧酸转运体。
本发明提供了生产苹果酸的方法，包括提供包括一种或多 种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A. succmogenes,所述 C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脱氩酶、及其组合； 提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基；在所述 生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以生产苹果酸。
本发明提供了生产苹果酸的方法，包括提供能够过度表达C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶选自PEPCK、苹果酸 脱氲酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的 生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产苹果酸。
本发明提供了生产苹果酸的方法，包括提供基因工程化的 A. succmogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰并且能 够过度表达C4酶，所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、 丙酮酸脱氢酶、及其组合，所述C4酶选自PEPCK、苹果酸脱氲酶、及 其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基； 以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以生产 苹果酸。
在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 进一步包括一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因的修饰，所述基因 选自苹果酸酶和草酰乙酸脱羧酶。在另外的实施方式中，所述基因工程 化的A. succmogenes进一步包括抑制延胡索酸还原酶的基因敲除或修 饰。权利要求22、 23、或24的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制延胡索酸还原酶的基因敲除或修饰。在另 外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或 多种提高通过EMP途径的通量的基因的修饰。在另外的实施方式中， 所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种才是高通过PPP 的通量的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制苹果酸酶的基因敲除或修饰。在另外的实 施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制草酰乙酸 脱羧酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的 A. succmogenes进一步包括一种或多种提高底物摄取的基因的修饰。在 另外的实施方式中，所述一种或多种基因提高底物的摄取，所迷底物选 自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖构成的组。在另外的实施 方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种提高 化学产品分泌的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基 因编码二羧酸转运体。
本发明提供了生产5-氨基乙酰丙酸的方法包括提供包括 一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A.succmogenes,所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸 脱氪酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的 生长培养基；在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产5-氨基乙酰丙酉臾。
本发明提供了生产5-氨基乙酰丙酸的方法，包括提供能够 过度表达C4酶的基因工程化的A. sucdnogenes，所述C4酶选自琥珀酰 -CoA合成酶、PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、 及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养 基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以 生产5-氨基乙酰丙酸。
本发明提供了生产5-氨基乙酰丙酸的方法包括提供基因 工程化的A. succmogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或 修饰并且能够过度表达C4酶，所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲 酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其组合，所述C4酶选自琥珀酰-CoA合成 酶、PEPCK、苹果酸脱氲酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合； 提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基；以及在 所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产5-氨基 乙酰丙酸。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进 一步包括一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因的修饰，所述基因选 自苹果酸酶和草酰乙酸脱羧酶。在另外的实施方式中，所述基因工程化 的A. succmogenes能够过度表达导致甘氨酸合成的酶。在另外的实施方 式中，所述基因工程化的A. succmogenes能够过度表达5-氨基乙酰丙酸 合酶。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步 包括一种或多种提高通过EMP途径的通量的基因的修饰。在另外的实 施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种才是 高通过PPP的通量的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程 化的A. succmogenes进一步包括抑制苹果酸酶的基因敲除或修饰。在另 外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制草 酰乙酸脱羧酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程 化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高底物摄取的基因的修 饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基因提高底物的摄取，所述 底物选自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种提高化 学产品分泌的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基因 编码二羧酸转运体。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种甘氨酸合成基因的修饰。
本发明提供了生产2-酮戊二酸的方法，包括提供包括一种 或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A. succinogenes， 所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其 组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基； 在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以生产2-酉同；^二f复。
本发明提供了生产2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)的方法，包 括提供能够过度表达C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4 酶选自琥珀酰-CoA合成酶、PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延 胡索酸还原酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工 程化的A. succinogenes以生产2-酉同戊二酸。
本发明提供了生产2-酮戊二酸的方法，包括提供基因工程 化的A. succmogenes,其包括抑制C3酶的一种或多种基因敲除或修饰 并且能够过度表达C4酶，所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂 合酶、丙酮酸脱氢酶、及其组合，所述C4酶选自琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合；提 供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养基；以及在所 述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产2-酮戊二 酸。
在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 进一步包括抑制2-酮戊二酸脱氢酶的基因敲除或修饰并且还能够过度 表达2-酮戊二酸受体氧化还原酶(2-oxoglutarate : acceptor oxidoreductase )。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因的修 饰，所述基因选自苹果酸酶和草酰乙酸脱羧酶。在另外的实施方式中， 所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高通过 EMP途径的通量的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高通过PPP的通量的基因的 修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步 包括抑制苹果酸酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括抑制草酰乙酸脱羧酶的基因敲除或 修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步 包括一种或多种提高底物摄取的基因的修饰。在另外的实施方式中，所 述一种或多种基因提高底物的摄取，所述底物选自阿拉伯糖、木糖、葡 萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高化学产品分泌的基因的修饰。 在另外的实施方式中，所述一种或多种基因编码二羧酸转运体。
本发明提供了生产谷氨酸(glutamate)的方法，包括提供 包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A. succinogenes,所述C3酶选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮 酸脱氬酶、及其组合构成的组；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培养基；在所述生长培养基中培养所述基因工程化 的A. succinogenes以生产谷氛酸。
本发明提供了生产谷氨酸的方法，包括提供能够过度表达 C4酶的基因工程化的A. succinogenes,所述C4酶选自由琥珀酰-CoA合 成酶、PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组 合构成的组；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培 养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes 以生产谷氨酸。
本发明提供了生产谷氨酸的方法，包括提供基因工程化的 A. succinogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰并且能 够过度表达C4酶，所述C3酶选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、 丙酮酸脱氢酶、及其组合构成的组，所述C4酶选自由琥珀酰-CoA合成 酶、PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合 构成的组；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培养 基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以 生产谷氨酸。
在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes 进一步包括抑制2-酮戊二酸脱氬酶的基因敲除或修饰并且还能够过度表达2-酮戊二酸受体氧化还原酶。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes能够过度表达谷氨酸脱氲酶。在另外的实施方式 中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高通过 EMP途径的通量的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化 的A. succinogenes进一步包括一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因 的修饰，所述基因选自由苹果酸酶和草酰乙酸脱羧酶构成的组。在另外 的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多 种提高通过PPP的通量的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因 工程化的A. succinogenes进一步包括抑制苹果酸酶的基因敲除或修饰。 在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包4舌抑 制草酰乙酸脱羧酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因 工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高底物摄取的基因的 修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基因提高底物的摄取，所 述底物选自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖。在另外的实施 方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种才是高 化学产品分泌的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基 因编石马二羧&复4争运体(dicarboxylate transporters )。
本发明提供了生产天冬氨酸(aspartate)的方法，包括提 供包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A. succinogenes,所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸 脱氬酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的 生长培养基；在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产天冬氛酸。
本发明提供了生产天冬氨酸的方法，包括提供能够过度表 达C4酶的基因工程化的A. succinogenes,所述C4酶选自琥珀酰-CoA 合成酶、PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其 组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培养基； 以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产 天冬氨酸。
本发明提供了生产天冬氨酸的方法，包括提供基因工程化 的A. succinogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或^多饰并 且能够过度表达C4酶，所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氲酶、及其组合，所述C4酶选自琥珀酰-CoA合成酶、.PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合；提 供用于培养所述基因工程化的a. succmogenes的生长培养基；以及在所 述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes以生产天冬氨酸。
在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 进一步包括抑制2-酮戊二酸脱氢酶的基因敲除或修饰并且还能够过度 表达2-酮戊二酸受体氧化还原酶。在另外的实施方式中，所述基因工 程化的A. succmogenes能够过度表达谷氨酸脱氪酶。在另外的实施方式 中，所述基因工程化的A. succmogenes能够过度表达天冬氨酸转氨酶。 在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一 种或多种能够提高通过EMP途径的通量的基因的修饰。在另外的实施 方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包i舌一种或多种可以 桥接C4和C3途径的基因的修饰，所述基因选自苹果酸酶和草酰乙酸脱 羧酶。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步 包括一种或多种提高通过PPP的通量的通量的基因的修饰。在另外的实 施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制苹果酸酶 的基因敲除或修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制草酰乙酸脱羧酶的基因敲除或修饰。在另 外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或 多种提高底物摄取的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多 种基因提高底物的摄取，所述底物选自阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、 以及蔗糖。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进 一步包括一种或多种提高化学产品分泌的基因的修饰。在另外的实施方 式中，所述一种或多种基因编码二羧酸转运体。
本发明提供了生产天冬氨酸的方法，包括提供能够过度表 达C4酶的基因工程化的A. succmogenes,所述C4酶选自PEPCK、苹 果酸脱氢酶、延胡索酸酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的 A. succmogenes的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因 工程化的A. succmogenes以生产天冬氨酸。
本发明提供了生产天冬氨酸的方法，包括提供基因工程化 的A. succmogenes,其包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰并且能够过度表达C4酶，所述C3酶选自丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氬酶、及其组合，所述C4酶选自PEPCK、苹果酸脱氬酶、 延胡索酸酶、及其组合；提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes 的生长培养基；以及在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes以生产天冬氛酸。
在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succinogenes 进一步包括抑制延胡索酸还原酶的基因敲除或修饰。在另外的实施方式 中，所述基因工程化的A. succinogenes能够过度表达天冬氨酸解氨酶 (aspartate ammonia-lyase )。在另夕卜的实施方式中，所述基因工程4t的 A. succmogenes进一步包括一种或多种能够提高通过EMP途径的通量 的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes 进一步包括一种或多种可以桥接C4和C3途径的基因的修饰，所述基因 选自由苹果酸酶和草酰乙酸脱羧酶构成的组。在另外的实施方式中，所 述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种提高通过PPP的 通量的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括一种或多种提高底物摄取的基因的修饰。在另 外的实施方式中，所述一种或多种基因提高底物的摄取，所述底物选自 由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖构成的组。在另外的实施 方式中，所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括一种或多种提高 化学产品分泌的基因的修饰。在另外的实施方式中，所述一种或多种基 因编码二羧酸转运体。
图1示出了本文所提及的将A. succmogenes基因用于化学产 品 生产的反应途径。
图2示出了阿拉伯糖:摄取并进入中心代谢的途径。
图3示出了木糖摄取并进入中心代谢的途径。
图4示出了果糖摄取并进入中心代谢的途径。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有专利、专利申请、政府出版物、政 府规章、以及文献参考的全部内容均以引用方式并入本文中。如有冲突，则以本说明书(包括定义)为准。
基于生物的化学产品生产是一个成长性产业， 一些基于生物的化学产品正在取代基于化石燃料的市场。A. succmogenes是用于工业 琥珀酸生产以及其它化学产品生产(包括苹果酸、延胡索酸、5-氨基乙 酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸)的有前途的生物催化剂。 除了生产琥珀酸，野生型A. succmogenes 130Z还生产相当数量的不想 要的甲酸、乙酸、以及乙醇。A. succmogenes发酵代i射在石寿酸烯醇式丙 酮酸(PEP)和/或丙酮酸处分成产生琥珀酸的C4支路和产生曱酸、乙 酸、和乙醇的C3支路。提高A. succinogenes的琥珀酸生产，允许其它 来自C4途径的化学产品的生产，将可能涉及抑制C3途径酶，并过度表 达C4途径酶。此外，可以桥接C4和C3途径的酶活性(如苹果酸酶和 草酰乙酸脱羧酶)也可以一皮抑制。随着C4途径通量增加，供应底物至 C4途径的通量也随之增加。可以抑制或过度表达编码糖摄取、糖酵解、 PPP、 Entner-Doudoroff途径中涉及的特异性酶的基因以提高通量。此外， 可以通过过度表达二羧酸转运体而提高化学产品分泌。
A. succmogenes是作为用于工业琥珀酸生产的可能的生物催 化剂的细菌。野生型A. succmogenes 130Z还生产相当数量的不想要的 曱酸、乙酸、以及乙醇。A. succmogenes发酵代谢在(PEP和/或丙酮酸 处分成产生琥珀酸的C4支路和产生甲酸、乙酸、和乙醇的C3支路。提 高A. succmogenes的琥珀酸生产将可能涉及抑制C3途径酶，并过度表 达C4途径酶。C4途径不仅对于生产琥珀酸是重要的，而且其它商业上 重要的化学产品也是C4途径的中间产物或可以来源于C4途径。这些化 学产品包括苹果酸、延胡索酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、 和天冬氨酸。按照DOE/JGI， A. succmogenes 130Z (ATCC 55618 )基因 组正被测序并且草图序列(draft sequence )目前可以从Zeikus实验室获 得。为了有助于设计用于生产C4相关的化合物的策略，我们已经预测 了什么基因是重要的，并且已经鉴定了草图序列中存在的相应的开放阅 读框(ORF),以便它们在用于制备化学产品时能够被保护。
工程化A. succmogenes以通过过度表达和/或抑制合适的基 因来生产化学产品(例如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、5-氨基乙酰丙酸、 2-酮戊二酸、谷氨酸、和天冬氨酸)是有利的，原因如下(a)通过知 晓所述基因序列，它们可以被过度表达、敲除、或改变以有益于化学产品生产。这是比化学诱变和选择压力更直接和有效的方法；(b)它提 高了琥珀酸产量，超出野生型菌抹的产量；(c)不同于野生型菌抹， 新型、工程化的菌抹不会产生不想要的终产物；(d)它允许生产来自 A. succmogenes的#f的4匕学产品；以及(e ) A. succinogenes 4t 学产品生 产是基于可再生资源，并且可以竟争并潜在地取代基于化石燃料的化学 产品市场。
利用A. Succmogenes的C4途径的化学产品生产需要C4酶 的过度表达、C3酶的抑制，以及在一些情况下， 一些C4酶的抑制。图 1示出了这些反应的途径。催化酶的A. succinogenes基因可以被工程化 以使所述途径的各种化学产品的产量最大化。粗箭头代表C4反应。细 箭头代表C3反应，除了1和20。将苹果酸脱羧基成为丙酮酸的反应也 认为是存在的，但是目前所述基因还没有被鉴定。下面的缩写和编号名 称被用在图中Glc ,葡萄糖；PEP ,磷酸烯醇式丙酮酸 (phophoenolpymvate) ; OAA,草酰乙酸；Mal,苹果酸；Fum,延胡 索酸；Suc，琥珀酸；SucCoA，琥珀酰-CoA; Gly,甘氨酸；ALA, 5-氨基乙酰丙酸；2oxo, 2-酮戊二酸；Glu,谷氨酸；Pyr，丙酮酸；For, 曱酸；AcCoA,乙酰-CoA; Aide,乙醛；EtOH,乙醇；AcPi，乙酰-磷 酸；Ace,乙酸。1，糖酵解酶；2, PEP羧激酶；3,苹果酸脱氲酶；4, 延胡索酸酶；5,延胡索酸还原酶；6,琥珀酰-CoA合成酶；7，谷酰基 -tRNA还原酶；8, 2-酮戊二酸:受体氧化还原酶；9, 2-酮戊二酸脱氢酶； 10,谷氨酸脱氲酶；11,丙酮酸激酶；12，丙酮酸曱酸裂合酶；13,丙 酮酸脱氬酶；14,乙醛脱氢酶；15,醇脱氢酶；16,醛脱氢酶；17,磷 酸乙酰基-转移酶(phosphate acetyl-transferase ) ; 18, 乙酸激酶(acetate kinase) ; 19,乙酰磷酸酶；20,草酰乙酸脱羧酶。
酶的过度表达可包括过度表达天然酶或过度表达来自其它 细菌的酶。酶可以如我们试验室的成员在Kim et al. 2004 Plasmid 51: 108-115中所述的那样在A. succmogenes中过度表达。随着化学产品产 量的提高，到达PEP支化点的通量会成为限制因素，在这种情况下，糖 摄取和糖酵解中涉及的酶也需要被过度表达。
当抑制或敲除酶时，要留心以确保细胞得到足够的用于生长 和维持的基本中间产物(如乙酰-CoA、丙酮酸、琥珀酰-CoA)。切断或 开放(leave叩en )形成C3和C4途径之间的旁路的可选途径也可能是重要的，如草酰乙酸脱羧酶，由contig 169上从74868-75137、 75157-76965、和76976-78283的3个ORF编码。
鉴定的C4酶包括，^旦不限于由pckA ( PEPCK编号#: AY308832.1 GI:34582584 )编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK); 由contig 160上从41924-42862的mdh(苹果酸脱氢酶编号#: AY773261.1 GI:54873671 )编码的苹果酸脱氢酶；由contig 92上从3526-4920编码的 延胡索酸酶；由contig 120上从8954-10744、 10896-11541、 11538-11927、 11947-12291的4个ORF编码的延胡索酸还原酶；由contig 154上从 44853-46013编码的琥珀酰-CoA合成酶卩亚单位。a亚单位被截，因为 所述序列延伸出了所述contig的边缘之外。a亚单位的88个氨基酸存在 于contig 154的266-1;由contig 154上从43546-44664、 40638-43463、 和contig 100上从4439-5863的3个ORF编码的2-酮戊二酸脱氢酶。
鉴定的C3酶包括，但不限于由contig 122上从7757-9193 编码的丙酮酸激酶；由contig 126上从1-2023编码的丙酮酸甲酸裂合酶。 注意这个基因由于延伸出了所述contig的末端而被截短；由contig 100 上从2-2437、 2498-4381、和4439-5863的3个ORF编码的丙酮酸脱氢 酶。注意最后的ORF与2-酮戊二酸脱氲酶的ORF相同。这两种酶共 同使用相同的亚单位(E3部分)；由contig 135上/人211-2835编码的 乙醛脱氢酶；由contig 164上/人4399-5517编码的醇脱氲酶；由contig 64 上从3935-4207编码的乙酰磷酸酶；contig 93上从1070-3的乙酸激酶。 注意由于所述ORF延伸出所述contig的边缘之外而^f吏得约70个氨基 酸缺失；contig 83上/人1656-1886和1883-3139编码的将乙醛和NAD转 化为乙酸和NADH的醛脱氲酶。
编码磷酸乙酰基-转移酶的ORF目前不能被定位，但是基于 密切相关的基因组的检测和由A. succmogenes生产的相当数量的乙酸， 所述ORF ,皮iL为是存在的。
其它重要的酶包括，但不限于contig 159上从12卯9-14258 编码的谷氨酸脱氬酶(glutamate dehydrogenase); 由contig 154上从 13745-14935编码的天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase );以及由 contig 148上从5361-3934编码的天冬氨酸解氨酶(aspartate ammonia-lyase )。基于鉴定的A. succmogenes基因的化学产品生产的策略I. 琥珀酸的生产
敲除或抑制C3酶，所述C3酶可以或可以不包括丙酮酸 激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、以及丙酮酸脱氲酶。过度表达C4酶，其可 以包括PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、以及延胡索酸还原酶中的 一些或全部。实验室的近期试验表明A. succmogenes具有最大的C4 通量，所述通量必须一皮克H以获得工业琥珀酸生产(McKinlay et al. 2005. Actinobacillus succinogenes shows a-ketoglutarate auxotrophy in a chemically defined growth medium. 2005. ， Appl. Environ. Microbiol. 2005. 71: 6651-6656)。II. 延胡索酸的生产
采用与琥珀酸生产相同的方法，但是应当另外敲除或抑制延 胡索酸还原酶。III. 苹果酸的生产
采用与延胡索酸生产相同的方法，但是应当另外敲除或抑制 延胡索酸酶。IV. 5-氨基乙酰丙酸的生产
采用与琥珀酸生产相同的方法，^f旦是还应当过度表达琥珀酰 -CoA合成酶。到目前为止仅发现了 A. succmogenes琥珀酰-CoA合成酶 的完整(3亚单位，但是预期a亚单位的其余部分存在于完整的基因组序 列中。如果完整的ct亚单位不在完整的基因组序列中，那么就需要外来 基因。hemA基因(戈口,来自Rhodobacter sphaeroides,其在vanderWerf andZeikus. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62 ( 10 ) : 3560-3566中有描 述)也可以被过度表达以将甘氨酸和琥珀酰-CoA转化为5-氨基乙酰丙 酸。此外，过度表达导致甘氨酸合成的酶可能是有益的。V. 2-酮戊二酸的生产
采用与5氨基乙酰丙酸相同的方法，但是不需要过度表达产 生甘氨酸的途径或hemA。 2-酮戊二酸脱氪酶是单向性地/人2-酮戊二酸 到琥珀酰-CoA,因此我们可以抑制或敲除它并且过度表达2-酮戊二酸 受体氧化还原酶(如，来自Helicobacter pylori),其在反向三羧酸循环 中起作用。VI. 谷氨酸的生产
采用与2-酮戊二酸相同的方法，但是还包括过度表达谷氨酸脱氬酶，其在contig 159上从12909-14258编码。 VII.天冬氨酸的生产
两种方法可以用于生产天冬氨酸。在第一种方法中，采用与 谷氨酸相同的方法，但是还包括过度表达天冬氨酸转氨酶(在contig 154 上从13745-14935上编码)。在第二种方法中，采用与延胡索酸生产相 同的方法，但是还包括过度表达天冬氨酸解氨酶，由contig 148上从 5361-3934编码。
已经鉴定了来自A. succmogenes基因组序列并对化学产品 生产重要的A. succmogenes基因序列。在完成基因组序列后，我们将修 订所述序列，以便校正低序列质量，找出在草图基因组序列中缺失的基 因区域、并且找出草图基因组序列中缺失的对于化学产品生产可能重要 的全部基因序列。我们已经手工注释了草图基因组序列中的全部开放阅 读框(ORF)。当完成全部基因组序列时，由不同的人注释每个ORF。
利用聚合酶链式反应扩增所述基因，并且将所述基因序列通 过本领域已知的方法克隆入质粒。 一旦所述基因位于质粒中，那么它们 可以被过度表达、抑制、并且可以被用于敲除如上所述的基因。选择要 被过度表达或抑制的确切的基因部分地由代谢研究指导，包括在 McKinlay et al. ( Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NMR and GC画MS analysis of 13C-labeled metabolic product isotopomers. Submitted for publication )中描述的"C-标"i己实马全。 这些标记实验通过在McKinlay et al. 2005 (Actinobacillus succinogenes shows a-ketoglutarate auxotrophy in a chemically defined growth medium, Appl. Environ. Microbiol. 71 ( 11 ) : 6651-6656 )和授予Zeikus等人的美国专利申请第_号(美国专利申请第_号，要求美国临时申请第60/717,425号的优先4又，MSU 4.1-758 )中开发和描述的化 学成分确定培养基而成为可能，其全部内容以引用方式并入本文。这些 基因工具用于过度表达Kimetal. 2004 Plasmid 51: 108-115和美国专利 申请第10/911,961号中描述的A. succinogenes中的基因。我们可以在这 个方法中改进基因过度表达并且我们一直在积极的探求用于A. succinogenes中基因敲除的有效系统。要,皮敲除的基因可以被药物抗性 盒中断并且用于置换染色体中未被中断的野生型基因。培养每个突变体 以评估突变对生长性质和化学产品生产的作用。利用"C-标记研究分析突变体以确定所述突变怎样影响有机体的中间代谢。
下面是基因輩巴标的列表，所述基因粑标包括在本文的鉴定和 注解工作中。所述基因编码苹果酸酶；丙酮酸羧化酶；PEP象化酶； PEP合酶；丙酮酸-铁氧化还原蛋白氧化还原酶；葡糖激酶；葡萄糖通透 酶；蔗糖特异性磷酸转移酶系统；p-呋喃果糖苷酶；6-磷酸葡糖酸脱水 酶(Entner-Doudoroff途径)；核酮糖-磷酸3-差向异构酶(PPP );苹 果酸合酶；异柠檬酸裂合酶；异柠檬酸脱氲酶；顺乌头酸酶；柠檬酸合 酶；柠檬酸裂合酶；乳酸脱氢酶；碳酸酐酶；卩-半乳糖苷酶；ATP-依赖 性麦芽糖转运系统；Lacl阻遏蛋白；阿拉伯糖转录活化蛋白AraC;木 糖操纵子活化蛋白，XylR; cAMP受体蛋白，CRP，也称为降解物活化 蛋白，CAP;以及碳储存调节蛋白，CsrA。
A. succinogenes C3和C4途径的基因可以用于生产多种化学 产品。由于这些策略导致高速率的提高的化学产品生产，由此将底物递 送至C4途径的途径会限制化学产品生产速率。在本发明的一些具体实 施方式中，通过抑制、敲除、过度表达和修饰/进化糖酵解、PPP、和底 物摄取中涉及的特定酶而提高通过这些途径的通量。在本发明的又一实 施方式中，通过靶向编码二羧酸转运体的基因而提高化学产品分泌。提 供了编码这些基因的A. succmogenes草图基因组序列中的ORF以便它 们可以用于制备化学产品。
:提高C4-途径通量可以导致这样的情况，其中递送底物到C4 途径的通量是限制性的。当这种情况发生时，必须影响(i)糖酵解，或 者EMP、 (ii)PPP、以及(iii)底物摄取(如，葡萄糖、木糖、阿拉伯 糖、蔗糖)中涉及的基因。图2、 3和4分别示出了阿拉伯糖、木糖、 和果糖摄取和进入中心代谢的途径。此外，化学产品分泌会成为限制性 的，由此二羧酸的输出中涉及的基因也可能需要被影响。要影响的特定 基因和影响它们的方式部分地一皮代谢研究指导，包括McKmlay et al.(Determining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by NMR and GC-MS analysis of C-labeled metabolic product isotopomers. Submitted.)中描述的13C-标记研究。这些标记实马全因McKinlay et al. 2005(Actinobacillus succinogenes shows a-ketoglutarate auxotrophy in a chemically defined growth medium, Appl. Environ. Microbiol., 71 ( 11 ): 6651-6656 )和授予Zeikus等人的美国专利申请第_号(美国专利申请第_号，要求美国临时申请第60/717,425号的优先权，MSU 4.1-758 )中描述的我们的化学成分明确的A. succmogenes生长培 养基而成为可能。例如，EMP和PPP之间的通量分布和糖异生发生的 程度应当通过"C-标记实验而被揭示。如果存在相当数量的糖异生通量， 那么我们将敲除被认为在糖异生中涉及的那些酶，并且观察效果。此外， 为了生产5-氨基乙酰丙酸，需要甘氨酸作为底物。提高用于5-氨基乙酰 丙酸(ammolevulmate )生产的甘氨酸的通量可能是有价值的。
我们已经鉴定了被认为在A. succmogenes 1!30Z草图基因组 序列中编码特定酶的基因序列，我们预期其对于改变(i) EMP通量、 (11) PPP通量、(111)底物摄取、(iv) 二羧酸转运、(v)以及甘氨 酸合成是重要的。这些基因序列作为附件附加并总结如下。在完整的 A. succinogenes基因组序列释放后，对这些序列进刊 修饰，因为所述草 图基因组序列包含不良序列质量的空隙和区域。 (i) EMP基因
contig 135上从14164-15858的磷酸葡糖异构酶(EC 5.3.1.9 )
contig 163上/人33518-34483的6-石岸酸果糖激酶(EC 2.7.1.11 )
contig 154上从16095-15022的磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1 )
contig 154上从40514-41299的磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1 )
contig 163上从42329-43099的磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1 )
contig 74上从2747-3760的果糖-l,6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11 ) (糖异生)[OO"] contig 138上从376-1的编码果糖1，6-二磷酸醛缩酶的N-末端 的两个ORF。注意所述完全序列不是已知的延伸出所述contig的边缘 的ORF。所述序列由于造成移码的低序列质量而纟皮分成2个ORF。(果 糖摄取途径)。
contig 127上从13295-12330的甘油醛-3-石舞酸脱氢酶(EC 1.2.1.12)。注意由于这个ORF的5，-末端延伸出所述contig的边缘之 外而使编码约20个氨基酸的预计60个碱基缺失。
contig 138上从1655-480的3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3 )
contig 133上从4053-3370的磷酸甘油酸变位酶(EC 5.4.2.1 )
contig 162上/人48008-48652的》岸酸甘油酸变位酶(EC 5.4.2.1 )
contig 157上从33951-33061的烯醇化酶(EC 4.2.1.11 )。注 意这只是烯醇化酶的C-末端。编码N-末端的区域延伸出所述contig 的边缘之外。潜在的EMP策略
为了提高将底物(即，PEP和丙酮酸)递送至C4-途径的通 量，可能需要过度表达一些或全部EMP酶。可以通过测量EMP通量(利 用"C-标记实验确定)和酶活性以及利用代谢控制分析计算来估计每种 EMP酶影响C4-途径通量的程度。作为可选方法，可以通过 Entner-Doudoroff ( ED )途径通量补充EMP通量，提供了将底物递送至 C4途径的两条途径。编码A. succmogenes ED酶6J舞酸葡糖酸脱水酶(6-phosphogluconate dehydratase ) (EC 4.2.1.12)的基因在草图基因组 序列中未找到，因此，如果其在完全基因组序列中不存在，则可能必须 过度表达编码这种酶的外源基因。编码A. succinogenes ED酶2-酮-3-脱 氧-6画磷酸葡糖酸醛缩酶(2画keto隱3画deoxy-6画phosphogluconate aldolase)(EC4.2.1.14)的基因于contig 148上从19472-18834和contig 159上从 15090-14452找到。 (ii) PPP基因
contig 146上从10225-8738的葡糖-6-磷酸脱氲酶(EC 1.1.1.49)
contig 115上从8607-7906的6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC 3.1.1.31 )
contig 115上/人5548-4094的6-石寿酸葡糖酸脱氬酶(EC 1.1.1.44)
contig 141上从5548-4094的6-磷酸葡糖酸脱氬酶(EC 1.1.1.44)[OO卯]核酮糖-磷酸3-差向异构酶(EC 5.1.3.1)未在任何contig上 找到，但是可能在完全基因组序列中找到，因为密切相关的 Pasteurellaceae具有这种基因。
contig 154上从20162-19710的核糖-5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)
contig 154上从37092-36643的核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)
contig 56上从2978-2337的核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6 )
contig 168上从64945-64286的核糖5-磷酸异构酶(EC 5.3丄6)
contig 159上从37734-36904的酮糖转移酶N-末端亚单位(EC 2.2.1.1 )
contig 159上从36911-35976的酮糖转移酶C-末端亚单位(EC 2.2.1.1 )
contig 86上从2744-738的酮糖转移酶(EC 2.2.1.1 )。
contig 105上从6033-5368的醛羧转移酶(transaldolase ) ( EC 2.2.1.2)
contig 135上从12149-13102的醛羧转移酶(EC 2.2.1.2 )
潜在的PPP策略通过PPP的通量导致1/6的碳作为C〇2 丟失，并非所有的碳都可以在C4途径中回收。在存在相当数量的PPP 通量的情况下(有待通过"C-标记研究确定)，使化学产品生产中的碳 回收最大化需要敲除葡糖-6-磷酸脱氢酶，或者如果需要ED途径通量， 则敲除6-磷酸葡糖酸脱氳酶。这两种酶是氧化性PPP的一部分。通过转 移最少量的通量通过非氧化性PPP以生产最基本的代谢中间产物而不 丟失作为C02的碳，所述细胞应仍能够存活，这已经在E. coli情况下示 出(Zhao et al. FEMS Microbiol. Lett. 2003. 220: 295-301 and Hua et al. J. Bacteriol. 2003. 185 ( 24 ) : 7053-7067)。
备选地，如果工业的经济情形允许丟失一些C02或者如果 还原能力的来源(C4途径需要)昂贵，则转移通量通过氧化性PPP是 值得的，其给每个葡萄糖提供2个NADPH。为此，EMP酶，葡糖磷酸 异构酶，可以被敲除。利用天然或外来的转氢酶或心肌黄酶(diaphorase) 将由此得到的NADPH转变为NADH也可能是必要的，对于E. coll葡糖 磷酸异构酶敲除突变体就是这种情况(Canonaco et al. FEMS Microbiol. Lett. 2001. 204: 247-252 ) 。 A. succinogenes转氢酶一皮contig 152上/人 24659-26191、 contig 152上从26203-27654和可能地contig 107上从 11481-10150编码。(ill)底物摄取基因
(a)阿拉伯糖contig 155上从6574-7389的ABC-型阿拉 伯糖转运系统周质蛋白；contig 155上从7413-8948的ABC-型阿拉伯糖转运系统ATP-结合蛋白；contig 155上从8964-9932的ABC-型阿拉伯糖 转运系统通透酶成分；contig 155上从12637-14124的L-阿拉伯并唐异构 酶(EC 5.3.1.4) ; contig 117上从3876-2419的L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53) ; contig 106上从2250-3704的L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53); contig 115上从2782-3474的核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(EC 5丄3.4 )。
( b )木糖contig 155上从21265-22578的木糖异构酶(EC 5.3.1.5) ; contig 165上从43481-41883的D画木酮糖激酶(EC 2.7.1.17) 或L-核酮糖激酶(ribulokinase ) (EC 2.7.1. 16) ; contig 155上从 22646-24091的D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.7 ); contig 155上从11012-12616 的D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.7) ; contig 155上从40497-38974的ABC-型木糖或核糖转运体ATP-结合蛋白；contig 155上,人21013-20015的 ABC-型木糖转运体周质蛋白(xylose transporter periplasmic protein ); contig 155上从18411 -17284的ABC-型木糖转运系统通透酶成分；contig 155上从19929-18415的ABC-型木糖转运系统ATP-结合成分；contig 165 上从44518-45636的木糖操纵子阻遏蛋白。[OOIO4] (c)葡萄糖contig 99上/人4340_3426的葡糖激酶转录调 节子(EC 2.7.1.2) ; contig 153上从411-13的葡萄糖特异性PTS蛋白 IIA; contig 153上从27639-29498的葡萄糖或(3-葡糖甙特异性PTS蛋白 IIC; contig 165上从40420-39968的葡萄糖或P-葡糖甙特异性PTS蛋白 IIA。
(d)果糖contig 106上从5534-3858的果糖-特异性PTS 蛋白IIC; contig 106上从7985-6483的果糖-特异性PTS蛋白(IIA/FPr ); contig 135上从9001-7952的果糖-特异性PTS蛋白IIC; contig 135上从 9331-9014的果糖-特异性PTS蛋白IIB; contig 135上从9799-9353的甘 露醇/果糖特异性PTS蛋白IIA; contig 106上/人6480-5539的l-石寿酸果 糖激酶(EC 2.7.1.56); contig 54上从6480-5539的l-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.56) ; contig 168上从10269-11198的D-果糖激酶。
( e )通用contig 153上从2202-475的PEP磷酸-转移酶系 统酶I(EI); contig 153上的石寿酸转移酶系统、HPr-相关蛋白；contig 165 上/人41787-40432的质子/糖同向转运蛋白(proton/sugar symport protein )。
(f)蔗糖contig 168上从11272-12720的蔗糖转化酶。
(g)糖流出contig 145上从25395-26780的潜在的主要易 化超家族糖通透酶 (potential major facilitator superfamily sugar permease ) ; contig 123上从16827-15997主要易化超家族糖通透酶。
底物摄取策略多种底物对于A. succinogenes的化学产品 生产是重要的，包括在一般的给料中丰富的那些底物，阿拉伯糖、木糖、 葡萄糖、果糖、以及蔗糖。所有这些糖均非常可能被磷酸转移酶系统 (PTS)、激酶、ABC-型转运系统摄取或者通过异化扩散(即，质子同 向转运通透酶)摄取。理想地，我们希望通过通透酶摄取每个糖以便释 放更多细胞需要的ATP。如果这不可能，其它系统比PTS更有利，因为 PTS将PEP转化为丙酮酸，其可能或可能不被容易地羧化为草酰乙酸或 苹果酸。
阿拉伯糖最可能通过ABC-型转运系统被内在化。 一旦内在 化，它可以通过许多途径进入代谢(图1)。利用13(3-阿拉伯糖应该可 以揭示哪条途径是最重要的。在这条途径中的一个、 一些、或者全部基 因可能需要被过度表达。
木糖最可能通过ABC-型转运系统内在化并在PPP中作为 木酮糖-5-磷酸进入中心代谢(图2)。如果木糖和葡萄糖共代谢，则提 议的PPP敲除将不是有害的，因为木糖进入6-磷酸葡糖酸脱氢酶的代谢 下游。然而，过度表达木酮糖下游的PPP^^直得的,…以提'高从木g同牆— 到PEP的通量。此外，我们已经鉴定了似乎是木糖操纵子阻遏蛋白的物 质。在存在木糖的情况下敲除这个阻遏物可能是值得的，以便使木糖摄 取最大化。
葡萄糖可能被PTS系统或者己糖激酶摄取，己糖激酶还没 有被鉴定但是活性已经被我们的实验室成员Pil Kim (Kim and Vieille. Glucose phosphorylation mechanisms in succinate-producing Actinobacillus succinogenes. Submitted )禾口 Mariet van der Werf ( Van der Werf etal. Arch. Microbiol. 1997. 167: 332-342 )检测到。如果证明难以 有效地将丙酮酸羧化为PEP,那么我们将希望敲除PTS系统并过度表达 己糖激酶。
果糖很可能被PTS或果糖激酶摄取并依赖于摄取系统以果 糖-6-磷酸或果糖1,6-二磷酸和甘油醛3^寿酸进入糖酵解中(图3)。与 葡萄糖一样，我们将最可能希望敲除PTS系统并过度表达果糖激酶。由于果糖在糖酵解中进入代谢早，在果糖是主要的碳源的情况下，不应当 使用提议的提高PPP通量的磷酸葡糖异构酶突变。
如果存在蔗糖，我们将希望过度表达蔗糖转化酶以有效地 将蔗糖转化为葡萄糖和果糖。
为了提高化学产品生产，我们还希望敲除阻遏底物:摄取的 基因，如糖流出基因。然而，取决于这些糖流出通透酶作用于什么糖， 可能不需要敲除它们。确实，如果足够的糖浓度梯度可以引起这些糖流 出通透酶摄取糖，那么通过过度表达所述基因以提高它们的糖摄取能力 可能是值得的。(iv ) 二羧酸转运体基因包括
contig 154上从18087-16792的TRAP C4-二羧酸转运(Dct) 系统蛋白。Contig 159上从20342-19050的TRAP-型C4-二羧酸转运系统 大亚单位
contig 117上7334-6057的TRAP-型C4-二羧酸转运系统小 通透酶成分
contig 122从13540-12269的TRAP-型C4-二羧酸转运系统 大蛋白成分
contig 148上/人27696-26689的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统周质成分(二羧酸-结合蛋白)
contig 159上/人21876-20890的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统周质成分(二羧酸-结合蛋白)
contig 122上从14033-13551的TRAP画型C4-二羧酸转运系 统小通透酶成分
contig 159上从20836-20345的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统小通透酶成分
contig 154上从18563-18087的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统小通透酶成分
contig 148上/人26666-26157的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统小通透酶成分
contig 148上从12484-12975的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统小通透酶成分
contig 117上/人7813-7331的TRAP-型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分
contig 154上从19646-18669的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统周质成分(二羧酸-结合蛋白)
contig 148上从12245-11259的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统周质成分(二羧酸-结合蛋白)
contig 122上从15018-14053的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统周质成分(二羧酸-结合蛋白)
contig 117上从5984-4998的TRAP-型C4-二羧酸转运系统 周质成分
contig 117上从4938-3949的TRAP-型C4-二羧酸转运系统 周质成分
contig 77上从4284-3718的TRAP-型C4-二羧酸转运系统整 体膜成分。注意N-末端编码区缺失，原因是所述编码区延伸到所述 contig的边纟象《夕卜。
contig 148上从26147-24867的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统整体膜成分
contig 148上从12987-14288的TRAP-型C4-二羧酸转运系统整体膜成分
contig 154上从18563-18087的TRAP-型C4-二羧酸转运系 统成分二羧酸转运体策略
由于存在许多二羧酸转运的4美选物，我们通过依次敲除每 个基因并检测对于特定化学产品生产率的作用来确定哪些基因对于特 定化学产品生产是重要的。 一旦鉴定出用于分泌特定化学产品的合适基 因，我们将过度表达这些基因。 (v)甘氨酸合成基因
丝氨酸脱氨酶或苏氨酸解氨酶(EC4.3.1.19)，位于contig 141上从10270-11808
contig 137上从2950-1682的甘氨酸羟甲基转移酶(EC 2.1.2.1 )
如果发现甘氨酸可用性限制5-氨基乙酰丙酸生产，则这些 基因均将被过度表达。表1.鉴定的Actinobacillus succinogenes基因核苷酸序列和开》文阅 读框(ORF )。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶苹果酸脱氬酶延胡索酸酶延胡索酸还原酶琥珀酰-CoA合成酶谷酰基-tRNA还原酶2-酮戊二酸脱氬酶谷氨酸脱氢酶天冬氨酸解氨酶天冬氨酸转氨酶丙酮酸激酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸-甲酸裂合酶乙醛脱氬酶 .醇脱氢酶酰基磷酸酶(acylphosphatase )醛脱氬酶 乙酸激酶磷酸乙酰基-转移酶 草酰乙酸脱羧酶实施例1
按照DOE/JGI,将A. succmogen6s 130Z ( ATCC 55618 )基 因组测序并将所述序列用于鉴定对于生产C4-相关化合物重要的基因。 这些基因的序列作为SEQIDNO:l到SEQ ID NO:l 19在本文中披露。
A. succinogenesC3和C4途径的基因和开》文阅读框(ORF ) 的核苦酸序列4皮露如下。可以,人American Type Culture Collection (ATCC )购买A. succinogenes 130Z。本文测序的基因组DNA来自从 ATCC获得的菌林。编码PEPCK的pckA和编码苹果酸脱氢酶的mdh 均已在E. coli中表达。PEPCK已经在A. succinogenes中被过度表达。
SEQ ID NO:l是A. succinogenes编码PEPCK的基因序列。 (PEPCK编号弁AY308832.1 GI:34582584>gi|34582584|gb|AY308832.1|A. succinogenes PEPCK基因，完全cds )。
SEQ ID NO:2是Contig 160上编码A. succinogenes苹果酸脱 氢酶的ORF (实-验室成员Maris Laivemeks先前将这个基因和编码 PEPCK的pckA测序)EC 1.1.1.37〉SPTR top hit: 'Q5U907 NAD ( H )-依赖性苹果酸脱氳酶-41924: 42862。
SEQ ID NO:3是苹果酸DH编号#: AY773261.1 GI:54873671〉gi|54873671|gb|AY773261.1|A. succinogenes质粒pKNJ NAD (H)-依赖性苹果酸脱氬酶(mdh)基因，完全cds
SEQ ID NO:4是Contig 92上编码A. succinogenes延胡索酸 酶的ORF EC 4.2.1.2 (〉SPTR top hit: 'Q65UJ3 FumC蛋白。Mannheimia sue-3526: 4920)。
Contig 120上编码A. succinogenes延胡索酸还原酶的ORF: frdB被分成2个重叠的ORF ( FRD铁硫蛋白和frdB ) 。 EC 1.3.99.1或 1.3.5.1。 SEQ ID NO:5是frdA。 ( 〉PRIAM:琥珀酸脱氲酶。-8954: 10744 )。 SEQ ID NO:6是FRD铁硫蛋白(〉SPTR top hit: 'Q7VPM7延胡索酸还原 酶铁-硫-10896: 10970)。 SEQ ID NO:7是FrdB。开头的11个碱基与铁 石克蛋白ORF重叠(>SPTR top hit: 'Q65S00 FrdB蛋白。Mannheimia sue -10960: 11541 )。 SEQ ID NO:8是frdC。开头的四个碱基与frdB产物 的C-末端重叠。(>SPTR top hit: 'Q65RZ9 FrdC蛋白。Mannheimia sue -11538: 11927)。 SEQ ID NO:9是frdD ( 〉SPTR top hit: 'Q65RZ8 FrdD 蛋白。Mannheimia sue-11947: 12291 )。
Contig 154上编码A. succinogenes琥珀酰-CoA合成酶的 ORF: EC6.2丄5 SEQIDNO:10是卩-亚单位(〉PRIAM:琥珀酸—CoA连 接酶[ADP-形成]。-44853: 46013 ) 。 a-亚单位大部分缺失，然而N-末 端发现于contig 154 P-亚单位J^因的下游的边缘，与其它基因组比较时， 它将预期位于此处。通过对a-亚单位核苷酸序列与A. succinogenes草图 基因组序列(draft genome sequence )进行blast发现它。SEQ ID NO: 11 是序歹寸 260 attttaattaataaaaacactaaagtgatctgccaggg—attcaccggcggacaagg 205。然而令人吃惊的是所述序列从260: l不匹配。所取的开放阅读框 从260:1没有终止密码子，并且针对nr数据库(88个氨基酸)中所有的细菌进行BLASTp搜索。搜索发现，在所查询的全部88个氨基酸上具 有对琥珀酰-CoA a-亚单位几乎相同的同一性，并包括保守的CoA-结合 4立点。SEQ ID NO:12是序歹寸260attttaattaataaaaacactaaagtga— tctgccagggsttcaccggcggscaaggcaccttccacagcgaacaggcattggcatscg gcacgaaattagtgggcggtac:cagtccgggtaaaggcggtacgacgcatttgggattgc cggtgtttgatacggtacgcgaagcggtgcaaaaaaccggagccsccgccagcgtgattt stgtgccggrcsecgttctgtaaggeGgccattctggaagcgattgacgccgg 1,
contig 154上编码A. succmogenes 2-酮戊二酸脱氬酶的 ORF: SEQ ID NO:14是E2 (EC 2.3.1.61 ) 二氲為乾辛酰胺琥珀酰转移酶 (Dihydrolipoamide succmylt認sferase ) 〉-43546: 44664。 SEQ ID NO: 15 是El (EC 1.2.4.2 ) ( 〉SPTR top hit: 'Q65SU8 SucA蛋白。Mannheimia suc-40638: 43463 )。 SEQ ID NO: 16是Contig 100上发现的E3( EC 1.8.1.4 ) 陽注意与丙酮酸脱氢酶相同的ORF (这是正常的)(>SPTR top hit: 'Q65SW9Lpd蛋白。Mannheimia succ-4439: 5863 )。
SEQ ID NO:17是contig 159上编码A. succinogenes谷氨酸 脱氬酶的ORF(EC 1.4.1.4) (〉PRIAM:谷氨酸脱氢酶(NADP+)。-12909: 14258)。
SEQ ID NO:13是contig 148上编码A. succinogenes天冬氨 酸解氨酶的ORF ( EC 4.3.11 ) ( 〉SPTR top hit: 'Q7VNH2 AspA蛋白。 Haemophilus ducreyi-5361: 3934 )。
SEQ ID NO: 119是contig 154上编码A. succinogenes天冬氨 酸转氨酶的ORF ( EC 2.6.1.1 ) ( 〉SPTR top hit: 'P44425天冬氨酸解氨 酶。Haemophilus influenzae-13745: 14935 )。
SEQ ID NO:18是Contig 122上编码A. succmogenes丙酮酸 激酶的ORF (EC 2.7.1.40) (>PRIAM:丙酮酸激酶。-7757: 9193 )。
Contig 100上编码A. succinogenes丙酮酸脱氬酶的ORF: SEQ ID NO: 19是EC 1.2.4.1 ( >SPTR top hit: 'P45119丙酮酸脱氩酶El co-2: 2437)。 SEQ ID NO:20是EC 2.3.1.12 ( 〉PRIAM: 二氲石克辛酰胺 S匿琥珀酰转移酶(Dihydrolipoamide S-succmyltransferase )。 -2498: 4381 )。 SEQ ID NO:21是EC 1.8.1.4 ( 〉SPTR top hit: 'Q65SW9 Lpd蛋白。 Mannheimia succ-4439: 5863 )。丙酮酸曱酸裂合酶的截短的ORF-EC 2.3.1.54.1..2023bp
SEQ ID NO:23是Contig 135上编码A. succinogenes乙醛脱氬酶的ORF。 (EC 1.2.1.10 )乙酰-CoA《"^乙醛(〉SPTR top hit: 'Q65QG3EutG蛋白。Mannheimia suc-211: 2835 )。
SEQ ID NO:24是contig 164上编码A. succinogenes醇脱氩酶的ORF(E.C. 1.1.1.1) ( 〉SPTR top hit: 'Q8DWE2推定的醇脱氬酶-4399: 5517)。
SEQ ID NO:25是Contig 64上编码A. succinogenes酰基磷酸 酶(acylphosphatase )的ORF ( EC 3.6.1.7 ) ( 〉SPTR top hit: 'Q9C丽1 假定(Hypothetical)蛋白PM0396。 -3935: 4207)。
SEQ ID NO:26是Contig83上编码A. succinogenes醛脱氲酶 的ORF EC 1.2.1.3 (〉SPTR top hit: 'Q65SA2 PutA蛋白。Mannheimia suc-1656: 1886 )。
SEQ ID NO:27是Contig 83上编码A. succinogenes醛脱氬酶 的ORF( 〉SPTR top hit: 'Q65SA2 PutA蛋白。Mannheimia suc-1883: 3139 )。
SEQ ID NO:28是Contig 93上从1070: 3编码A. succmogenes 乙酸激酶的ORF。在420个预期的氨基酸中约存在350个氨基酸(EC 2.7.2.1 )。
编码磷酸乙酰基-转移酶的ORF目前还不能被定位，但是 基于与密切相关的基因组的类似性和A. succmogenes的乙酸生产相信其 是存在的。
Contig 169上编码A. succmogenes草酰乙酸脱羧酶的ORF: EC 4.1.1.3。 SEQ ID NO:29是oadG ( >SPTR top hit: 'Q65WL3 OadG蛋 白。Mannheimia suc-74868: 75137 ) 。 SEQ ID NO:30是oadA ( >SPTR top hit: 'Q65WL4 OadA蛋白。Mannheimia suc-75157: 76965 )。 SEQ ID NO:31 是oadB (〉PRIAM:草酰乙酸脱羧酶。-76976: 78283 )。EMP基因
SEQ ID NO:32是contig 135上从14164-15858的编码A. succmogenes磷酸葡糖异构酶(EC 5.3.1.9)的ORF
SEQ ID NO:33是contig 163上乂人33518-34483的编码A. succinogenes 6-》寿酸果糖激酶(EC 2.7.1.11 )的ORF
SEQ ID NO:34是contig 154上从16095-15022的编码A.succmogenes磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1 )的ORF
SEQ ID NO:35是contig 154上从40514-41299的编码A. succmogenes磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1)的ORF
SEQ ID NO:36是contig 163上从42329-43099的编码A. succinogenes磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1)的ORF
SEQ ID NO:38是contig 138上从376-1的编码A. succmogenes果糖1,6-二-寿酸醛缩酶的N-末端的两个ORF。注意已知 所述完全序列不是延伸出所述contig的ORF。所述序列由于低序列质量 造成移码而^皮分为2个ORF。(果糖摄取途径)
SEQ ID NO:39是contig 127上从13295-12330的编码A. succmogenes甘油醛-3-磷酸脱氲酶(EC 1.2.1.12)的ORF。注意编码 约20个氨基酸的预计60个石咸基由于这个ORF的5'-端延伸出所述contig 的边缘之外而缺失。
SEQ ID NO:40是contig 138上从1655-480的编码A. succmogenes 3-磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)的ORF
SEQ ID NO:41是contig 133上从4053-3370的编码A. succmogenes磷酸甘油酸变位酶(EC 5.4.2.1 )的ORF
SEQ ID NO:42是contig 162上从48008-48652的编码A. succmogenes石寿酸甘油酸变4立酶(EC 5.4.2.1)的ORF
SEQ ID NO:44是contig 146上从10225-8738的编码A. succmogenes葡糖-6-磷酸脱氪酶(EC 1.1.1.49)的ORF
SEQ ID NO:45是contig 115上从5548-4094的编码A. succmogenes 6-石寿酸葡糖酸脱氪酶(EC 1.1.1.44)的ORF
SEQ ID NO:46是contig 115上从8607-7906的编码A. succmogenes 6-磷酸葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.31)的〇RF
SEQ ID NO:47是contig 141上从5548-4094的编码A.succmogenes 6-磷酸葡糖酸脱氬酶(EC 1.1.1.44)的ORF
编码A. succmogenes编码核酮糖-磷酸3-差向异构酶(EC 5.1.3.1)的ORF未在任何contig上发现，但是可能在完全基因组序列中 发现。密切相关的Pasteurellaceae具有这个基因。
SEQ ID NO:48是contigl54上从20162-19710的编码A. succmogenes核糖-5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)的ORF
SEQ ID NO:50是contig 56上从2978-2337的编码A. succmogenes编码核糖5-石寿酸异构酶(EC 5.3.1.6 )的ORF
SEQ ID NO:51是contig 168上从64945-64286的编码A. succmogenes编码核糖5-石粦酸异构酶(EC 5.3.1.6 )的ORF
SEQ ID NO:52是contig 159上从37734-36904的编码A. succmogenes转酮醇酶(transketolase) N-末端亚单位(EC 2.2.1.1)的 ORF
SEQ ID NO:54是contig86上从2744-738的编码A. succmogenes转酮醇酶(EC 2.2.1.1)的ORF
SEQ ID NO:55是contig 105上从6033-5368的编码A. succinogenes转醛醇酶(EC 2.2.1.2 )的ORF
SEQ ID NO:56是contig 135上从12149-13102的编码A. succmogenes转醛醇酶(EC 2.2.1.2)的ORF (in)底物摄取基因 (a)阿拉伯糖
SEQ ID NO:57是contig 155上从6574-7389的编码A. succinogenes阿4立伯并唐摔争运体周质蛋白(arabinose transporter periplasmic protein )的ORF
SEQ ID NO:58是contig 155上从7413-8948的编码A. succinogenes阿4立伯糖转运体ATP-结合蛋白的ORF
SEQ ID NO:59是contig 155上从8964-9932的编码A. succinogenes ABC-型阿拉伯糖转运系统通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:60是contig 155上从12637-14124的编码A. succmogenes L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4)的ORF
SEQ ID NO:61是contig 117上从3876-2419的编码A. succmogenes L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53 )的ORF
SEQ ID NO:63是contig 115上从2782-3474的编码A. succmogenes核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(EC 5.1.3.4 )的ORF (b )木糖
SEQ ID NO:64是contig 155上从21265-22578的编码A. succmogenes木糖异构酶(EC 5.3.1.5 )的ORF
SEQ ID NO:65是contig 165上从43481-41883的编码A. succmogenes D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17 )或L-核酮糖激酶(EC 2.7.1. 16 ) 的ORF
SEQ ID N〇:66是contig 155上从22646-24091的编码A. succmogenes D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的ORF
SEQ ID NO:67是contig 155上从11012-12616的编码A. succmogenes D-木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的ORF
SEQ ID NO:68是contig 155上从40497-38974的编码A. succmogenes ABC-型木糖或核糖转运体ATP-结合蛋白的ORF
SEQ ID NO:69是contig 155上从21013-20015的编码A. succmogenes ABC-型木糖转运体周质蛋白的ORF
SEQ ID NO:70是contig 155上从18411-17284的编码A. succmogenes ABC-型木糖转运系统通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:71是contig 155上从19929-18415的编码A. succmogenes ABC-型木糖转运系统ATP-结合成分的ORF
SEQ ID NO:72是contig 165上从44518-45636的编码A. succmogenes木糖操纵子阻遏蛋白的ORF (c)葡萄糖
SEQ ID NO:73是contig 99上从4340-3426的编码A. succinogenes葡糖激酶转录调节物(EC 2.7.1.2 )的ORF
SEQ ID NO:74是contig 153上从411-13的编码A.succmogenes葡萄糖特异性PTS蛋白IIA的ORF
SEQ ID NO:75是contig 153上从27639-29498的编码A. succmogenes葡萄糖或卩-葡糖戒(glucoside )特异性PTS蛋白IIC的ORF
SEQ ID NO:76是contig 165上从40420-39968的编码A. succmogenes葡萄糖或卩-葡糖戒特异性PTS蛋白IIA的ORF(d) 果糖
SEQ ID NO:77是contig 106上从5534-3858的编码A. succmogenes果糖特异性PTS蛋白IIC的ORF
SEQ ID NO:78是contig 106上从7985-6483的编码A. succmogenes甘露醇/果糖特异性PTS蛋白(IIA)的ORF
SEQ ID NO:79是contig 135上从9001-7952的编码A. succinogenes果糖或甘露并唐特异性PTS蛋白IIC的ORF
SEQ ID NO:80是contig 135上/人9331-9014的编码A. succmogenes果糖特异性PTS蛋白IIB的ORF
SEQ ID NO:81是contig 135上从9799-9353的编码A. succmogenes甘露醇/果糖特异性PTS蛋白IIA的ORF
SEQ ID NO:82是contig 106上从6480-5539的编码A. succmogenes l-石岸酸果糖激酶(EC 2.7.1.56)的ORF
SEQ ID NO:83是contig 54上从6480-5539的编码A. succmogenes l-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.56)的ORF
SEQ ID NO:84是contig 168上从10269-11198的编码A. succinogenes果糖激酶的ORF(e) 通用
SEQ ID NO:85是contig 153上从2202-475的编码A. succmogenes磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统酶I (EI)的ORF
SEQ ID NO:86是contig 153上从2565-2308的编码A. succmogenes石岸酸转移酶系统、HPr-相关蛋白的ORF
SEQ ID NO:87是contig 165上从41787-40432的编码A. succinogenes质子/糖同向4争运蛋白的ORF(f) 蔗糖
SEQ ID NO:88是contig 168上从11272-12720的编码A. succinogenes蔗斗唐摔争4^i酶^/〇RF(g)糖流出
SEQ ID NO:89是contig 145上从25395-26780的编码A. succmogenes潜在主要易化超家族糖通透酶的ORF
SEQ ID NO:90是contig 123上从16827-15997的编码A. succmogenes主要易化超家族糖通透酶的ORF (iv) 二羧酸转运体
SEQ ID NO:91是contig 154上从18087-16792的编码A. succmogenes TRAP C4-二羧酸转运(Dct)系统蛋白的ORF
SEQ ID NO:92是contig 159上从20342-19050的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统大亚单位的ORF
SEQ ID NO:93是contig 117上从7334-6057的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:94是contig 122上从13540-12269的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统大蛋白成分的ORF
SEQ ID NO:96是contig 159上从21876-20890的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统周质成分(二羧酸-结合蛋白) 的ORF
SEQ ID NO:97是contig 12上从14033-13551的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:98是contig 159上从20836-20345的编码A. succmogenes TRAP画型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:99是contig 154上从18563-18087的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:100是contig 148上从26666-26157的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:101是contigl48上从12484-12975的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO:102是contig 117上从7813-7331的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二狻酸转运系统小通透酶成分的ORF
SEQ ID NO: 103是contig 154上从19646-18669的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运体系统周质成分(二羧酸-结合蛋 白)的ORF
SEQ ID NO:104是contig 148上从12245-11259的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统周质成分(二羧酸-结合蛋白) 的ORF
SEQ ID NO:105 is contig 122上从15018-14053的编码A. succinogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统周质成分(二羧酸-结合蛋白) 的ORF
SEQ ID NO: 106 is contig 117上从5984-4998的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统周质成分的ORF
SEQ ID NO:107是contig 117上从4938-3949的编码A. succmogenes TRAP-二羧酸转运系统周质成分的ORF
SEQ ID NO: 108是contig 77上从4284-3718的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统整体膜成分的ORF。注意 N-末端编码区缺失，原因是所述编码区延伸到所述contig的边缘之外。
SEQ ID NO:109是contig 148上从26147-24867的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二叛酸转运系统整体膜成分的ORF。
SEQ ID NO:l 10是contig 148上从12987-14288的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统整体膜成分的ORF
SEQ ID NO:lll是contig 154上从18563-18087的编码A. succmogenes TRAP-型C4-二羧酸转运系统成分的ORF (v)甘氨酸合成
SEQ ID NO:112是编码A. succmogenes丝氨酸脱氨酶或苏 氨酸解氨酶(EC 4.3.1.19 )的ORF,存在于contig 141上从10270-11808。
SEQ ID NO:113是contig 137上从2950-1682编码A. succinogenes甘氨酸幾曱基转移酶(EC 2.1.2.1)的ORF。Entner-Doudoroff途径基因
SEQ ID NO:114是contig 148上从19472-18834编码A. succmogenes 2-酮-3-脱氧-6-裤酸葡糖酸醛缩酶(EC 4.2.1.14)的ORF。
SEQ ID NO: 115是contig 159上从15090-14452编码A. succmogenes 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.14)的ORF。转氢酶
SEQ ID NO:116是contig 152上从24659-26191编码A. succmogenes NAD/NADP转氲酶a亚单位的ORF
SEQ ID NO:l 17是contig 152上从26203-27654的编码A. succmogenes NAD/NADP转氬酶卩亚单位的ORF.
SEQ ID NO:118是contig 107上从11481-10150编码A. succinogenes NADH脱氛酶的〇RF.
虽然参照所示的实施方式描述了本发明，但是应当理解本 发明不限于此。具有本领域普通技术知识并从本文获得教导的技术人员 将认识到在本发明的范围内的另外的修改和实施方式。因此，本发明仅 由所附的权利要求限制。
权利要求
1. 一种用于生产来自A.succinogenes C4-途径的化学产品的方法，包括(a)提供包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰的基因工程化的A.succinogenes；(b)提供用于培养所述基因工程化的A.succinogenes的生长培养基；以及(c)在所述培养基中培养所述基因工程化的A.succinogenes以生产来自所述A.succinogenes C4-途径的化学产品。
2. —种用于生产来自A. succmogenes C4-途径的化学产品的方法， 包括(a) 提供能够过度表达一种或多种C4酶的基因工程化的A. succinogenes;(b) 提供用于培养所述基因工程化的A. succinogenes的生长培养 基；以及(c) 在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succinogenes 以生产来自所述A. succinogenes C4-途径的化学产品。
3. —种生产来自A. succmogenes C4-途径的化学产品的方法，包括(a) 提供包括一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰并且能够过 度表达一种或多种C4酶的基因工程化的A. succmogenes;(b) 提供用于培养所述基因工程化的A. succmogenes的生长培养 基；以及(c) 在所述生长培养基中培养所述基因工程化的A. succmogenes 以生产来自所述A. succmogenes C4-途径的化学产品。
4. 根据权利要求1、 2或3所迷的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品选自由琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、 5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、以及天冬氨酸构成的组。
5. 才艮据4又利要求1所述的方法，其中来自所述A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是琥珀酸并且抑制C3酶的所述一种或多种基因敲 除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其 组合构成的组。
6. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是琥珀酸并且所述一种或多种C4酶选自由PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合构成的组。
7. 根据权利要求3所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是琥珀酸，抑制C3酶的所述一种或多种基因敲除 或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氲酶、及其组 合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自由PEPCK、苹果酸脱氢酶、 延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合构成的组。
8. 才艮据权利要求1所述的方法，其中来自所述A. succinogenesC4-途径的所述化学产品是延胡索酸，并且抑制C3酶的所述一种或多种基 因敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、 及其组合构成的组。
9. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是延胡索酸，并且所述一种或多种C4酶选自由 PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、及其组合构成的组。
10. 根据权利要求3所述的方法，其中来自所述A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是延胡索酸，抑制C3酶的所述一种或多种基因敲 除或修饰选自丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其组 合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自PEPCK、苹果酸脱氬酶、 延胡索酸酶、及其组合构成的组。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制延胡索酸还原酶的基因敲除或》f饰。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是苹果酸，并且抑制C3酶的所述一种或多种基因 敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及 其组合构成的组。
13. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是苹果酸，并且所述一种或多种C4酶选自PEPCK、 苹果酸脱氲酶、及其组合构成的组。
14. 根据权利要求3所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是苹果酸，抑制C3酶的所述一种或多种基因敲除 或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其组合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自由PEPCK、苹果酸脱氬酶、及其组合构成的组。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括抑制延胡索酸还原酶的基因敲除或修饰。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制延胡索酸酶的基因敲除或修饰。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中其中来自所迷A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是5-氨基乙酰丙酸，并且抑制C3酶的所述一种 或多种基因敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-曱酸裂合酶、丙酮酸 脱氬酶、及其组合构成的组。
18. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A succinogenes C4-途径的所述化学产品是5-氨基乙酰丙酸，并且所述一种或多种C4酶选 自由琥珀酰-CoA合成酶、PEPCK、苹果酸脱氳酶、延胡索酸酶、延胡 索酸还原酶、及其组合构成的组。
19. 才艮据权利要求3所述的方法，其中来自所述A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是5-氨基乙酰丙酸，抑制C3酶的所述一种或多种 基因敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、 及其组合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自由琥珀酰-CoA合成 酶、PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合 构成的组。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes能够过度表达导致甘氨酸合成的酶。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括对一种或多种甘氨酸合成基因的修饰。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是2-酮戊二酸，并且抑制C3酶的所述一种或多种 基因敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氲酶、 及其组合构成的组。
23. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是2-酮戊二酸，并且所述一种或多种C4酶选自由 琥珀酰-CoA合成酶、PEPCK、苹果酸脱氲酶、延胡索酸酶、延胡索酸 还原酶、及其组合构成的组。
24. 才艮据权利要求3所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是2-酮戊二酸，抑制C3酶的所述一种或多种基因 敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氬酶、及 其组合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自由琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合构成 的组。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制2-酮戊二酸脱氢酶的基因敲除或修饰并且 还能够过度表达2-酮戊二酸受体氧化还原酶。
26. 根据权利要求1所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是谷氨酸，并且抑制C3酶的所述一种或多种基因 敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氲酶、及 其组合构成的组。
27. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是谷氨酸，并且所述一种或多种C4酶选自由琥珀 酰-CoA合成酶、PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原 酶、及其组合构成的组。
28. 根据权利要求3所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是谷氨酸，抑制C3酶的所述一种或多种基因敲除 或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其组 合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自由琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合构成 的组。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制2-酮戊二酸脱氲酶的基因敲除或^奮饰并且 还能够过度表达2-酮戊二酸受体氧化还原酶。
30. 根据权利要求28所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes还能够过度表达谷氨酸脱氢酶。
31. 才艮据权利要求1所迷的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是天冬氨酸，并且抑制C3酶的所述一种或多种基 因敲除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氲酶、 及其组合构成的组。
32. 根据权利要求2所述的方法，其中来自所述A. succinogenes C4-途径的所述化学产品是天冬氨酸，并且所述一种或多种C4酶选自由琥 珀酰-CoA合成酶、PEPCK、苹果酸脱氬酶、延胡索酸酶、延胡索酸还 原酶、及其组合构成的组。
33. 根据4又利要求3所述的方法，其中来自所述A. succmogenes C4-途径的所述化学产品是天冬氨酸，抑制C3酶的所述一种或多种基因敲 除或修饰选自由丙酮酸激酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸脱氢酶、及其 组合构成的组，并且所述一种或多种C4酶选自由琥珀酰-CoA合成酶、 PEPCK、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶、及其组合构成 的组。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制延胡索酸还原酶的基因敲除或修饰。
35. 根据权利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes还能够过度表达天冬氨酸解氨酶。
36. 根据权利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes进一步包括抑制2-酮戊二酸脱氢酶的基因敲除或4多饰并且 还能够过度表达2-酮戊二酸受体氧化还原酶。
37. 根据权利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes还能够过度表达谷氨酸脱氢酶。
38. 根据权利要求33所述的方法，其中所述基因工程化的A. succmogenes还能够过度表达天冬氨酸转氨酶。
39. 根据权利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succmogenes进一步包括对一种或多种提高通过EMP的通量的基因 的修饰。
40. 根据权利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succinogenes进一步包括对一种或多种提高通过PPP的通量的基因的修饰。
41. 根据权利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succmogenes进一步包括抑制苹果酸酶的基因敲除或修饰。
42. 根据权利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succmogenes进一步包括抑制草酰乙酸脱羧酶的基因敲除或修饰。
43. 根据权利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的A. succinogenes进一步包括对提高底物摄取的一种或多种基因的々多饰。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种基因提高底 物的摄取，所述底物选自由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、以及蔗糖 构成的纟且。
45. 根据权利要求1、 2或3所述的方法，其中所述基因工程化的 A. succinogenes进一步包括对提高化学产品分泌的一种或多种基因的修饰。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中所述一种或多种基因编码二 羧酸转运体。
全文摘要
本发明披露了Actinobacillus succinogenes基因和在基因工程化的A.succinogenes中利用这些基因以便提高化学产品的产量的方法，所述化学产品如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、5-氨基乙酰丙酸、2-酮戊二酸、谷氨酸、以及天冬氨酸。所述基因工程化的A.succinogenes菌株能够过度表达C4酶。所述基因工程化的A.succinogenes可以具有一种或多种抑制C3酶的基因敲除或修饰。在一些基因工程化的A.succinogenes中，也可以提高供应C4途径底物的通量。
文档编号C12N1/20GK101278041SQ200680036758
公开日2008年10月1日 申请日期2006年8月4日 优先权日2005年8月5日
发明者C·维埃耶, J·B·麦金莱, J·G·蔡库斯, M·莱夫尼克斯 申请人:密执安州大学