生产重组蛋白的方法

文档序号:557878阅读:425来源:国知局

专利名称::生产重组蛋白的方法
技术领域
:本发明涉及生产重组蛋白的方法,更具体地涉及通过使用曲霉作为宿主生产重组蛋白的方法。
背景技术
:长期以来,在生产发酵食品和饮料中,就使用日本酒曲作为酶源。当将日本酒曲用于生产发酵食品和饮料时,一般使用固体曲,其通过将曲霉培养在谷物等的表面上获得。固体曲通过传统生产方法获得。然而,所述方法是一种特殊的培养方法,即固体培养,因此不适合于大规模生产。另一个方面,液体曲可以容易地控制培养物,所述液体曲是通过液体培养曲霉获得的曲霉的培养产物,并且是一种进行有效生产的适合的培养方法。然而,已经公知的是,液体曲霉不能提供生产发酵食品和饮料所需的足够的酶活性,因此,很少有将液体曲用于实际生产的实例(见,非专利文献l陽4)。曲霉容易增殖,因此可以以低成本制备培养基,并且不需要特殊的培养器具,因此培养成本很低。已经在很长的时间,将曲霉用于生产发酵食品和饮料,因此其被认为是安全的宿主。因此,已经一般性尝试使用曲霉作为宿主插入来自曲霉或其他生物的基因从而强表达所述基因,以生产来自所述基因的产物,即重组蛋白(见非专利文献5)。还已经报道了通过用麦麸进行固体培养以高产量生产重组蛋白的成功实例(见非专利文献6)。然而,所述生产以特殊的培养方式,即固体培养进行,因此不适合大规模生产。另一方面,认为液体培养物本身在如上所述的细胞外部提供极少的蛋白,并且因此不适合于大量生产重组蛋白。非专利文献l:HataY.等J.Ferment.Bioeng(发酵生物工程杂志).,84,532-537(1997)非专利文献2:HataY.等Gene(基因),207,127-134(1998)非专利文献3:IshidaH.等J.Ferment.Bioeng(发酵生物工程杂志),,86,301-307(1998)非专利文献4:IshidaH.等Curr.Genet(当代基因).,37,373-379(2000)非专利文献5:R.J.Gouka,等,Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物生物技术),47,1-11(1997)非专利文献6:K.Tsuchiya,等,Biosci.Biotech.Biochem.(生物科学生物技术生物化学),58,895-899(1994)发明公开内容本发明待解决的问题本发明的一个目的是提供通过使用曲霉作为宿主,用液体培养方法,大量生产重组蛋白的方法,其常规上被认为不适合于生产重组蛋白,因为上述原因。解决问题的方式本发明的发明人已经提出了生产具有足够的酶活性的液体曲的方法(见,日本专利申请号.2004-350661,2004-352320,2004-352324,2004-378453禾n2005-290648,禾口JP-A-2003-265165)。那些方法使用这样的原料作为培养基,所述原料的表面被完全或部分用至少外壳(husk)所覆盖从而阻止营养物从原料释放到培养系统中,并且由此获得需要的酶活性,特别是淀粉分解酶,纤维素分解酶和蛋白水解酶的活性。根据所述方法,其获得的酶活性高于通过使用脱壳大麦或脱壳水稻作为原料的液体培养物获得的那些酶活性,所述脱壳大麦或脱壳水稻是烧酒(shochu)的原料。曲霉的实例包括白曲霉,黑曲霉,黄曲霉和红曲霉。据认为,上述生产液体曲的方法增加了编码酶的基因的转录水平,并且由此生产来自那些基因的产物(即,目的酶)并且将其分泌到曲霉的细胞外部,所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸浓度的分解代谢物阻抑的影响。将编码目的蛋白质的基因连接到编码酶的基因的启动子下游,由此产生在其中结合连接产物的重组曲霉,根据上述生产液体曲的方法培养重组曲霉,并且因此以高产量生产目的重组蛋白,所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸的浓度的分解代谢物阻抑的影响。在生产重组蛋白中的另外的重要的因素是翻译的重组蛋白被适当地运输到宿主的细胞外部。甚至即使仅仅是转录水平被增加,翻译的重组蛋白通常可以积累在细胞内,或由宿主固有分泌的酶所分解。此外,除非重组蛋白在其转运到宿主的细胞外部的过程中进行了需要的修饰,否则不能生产被正确折叠的并且具有与天然蛋白的活性等价的活性的蛋白。然而,通过如上所述使用曲霉作为宿主,通过生产液体曲的技术生产和分泌更大量重组蛋白是高度可能的。目的重组蛋白还可以以高产量通过下列方式获得容许其在宿主曲霉的外部生产,作为重组蛋白与宿主曲霉固有地产生并分泌的酶的融合蛋白,并且在培养物上清液中包含的融合蛋白在其连接位点被定向位点蛋白酶裂解。基于上述发现,因此完成了本发明。艮P,根据权利要求1的本发明是提供通过使用重组曲霉生产重组蛋白的方法,所述重组曲霉通过转化作为宿主的曲霉获得,所述方法包括在液体培养基中培养重组曲霉,所述液体培养基包含选自由下列各项组成的组的至少一种作为培养原料其表面被至少外壳完全或部分覆盖的谷类,其表面被壳覆盖的豆类和/或块茎以及苋属植物(amaranthus)和/或藜属(quinoa)植物,其不需要经过预处理如研磨或压碎;和从培养产物中收集重组蛋白。根据权利要求2的本发明是提供根据权利要求1的生产重组蛋白的方法,其中重组曲霉通过将编码目的蛋白的基因连接到编码酶的基因的启动子下游,以获得连接的产物,并且将连接的产物引入作为宿主的曲霉而获得,所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸的浓度的分解代谢物阻抑的影响。根据权利要求3的本发明是提供根据权利要求2的生产重组蛋白的方法,其中所述启动子是编码选自由淀粉分解酶,纤维素分解酶和蛋白水解酶组成的组的任意一种酶的基因的启动子。发明效果根据本发明,提供通过用曲霉作为宿主,用液体培养方法大量生产重组蛋白的方法。曲霉容易地增殖,因此培养基可以以低成本制备,并且不需要特殊的培养器具。长期以来,所述曲霉用于生产发酵的食品和饮料,因此其是安全的宿主。此外,与固体培养比较,曲霉的液体培养可以更加严格地控制,因此其适合于高效生产。此外,可以通过使用各种原料和曲霉菌株选择多种生产模式,并且有效地和稳定地大量生产目的重组蛋白。实施本发明的最佳实施方案在下文,更详细地描述本发明。本发明使用的液体培养基包含选自由下列各项组成的组的至少一种培养原料其表面被至少外壳完全或部分覆盖的谷类,其表面被壳覆盖的豆类和/或块茎以及苋属植物和/或藜属植物,其不需要经过预处理如研磨或压碎。在本发明中,用作培养原料的谷物的实例包括大麦,水稻,小麦,荞麦,稗子(barnyardmillet),粟(foxtailmillet),小米,高粱,玉米等。所述培养原料需要具有其表面被至少壳完全或部分覆盖的形式。其可以使用未脱壳的原料或其具有相同或更多的脱壳比率(polishingratio)的原料,其中其以这样的脱壳比率脱壳-使得外壳至少被保留在谷粒的表面上,还可以使用粗水稻,粗大麦等。在水稻的情形中,可以使用粗水稻,具有全部糠的水稻和具有部分糠的水稻。当培养原料是大麦时,可以使用脱壳比率为100%的未脱壳的原料。备选地,如果未脱壳原料的脱壳比率被限定为100%,具有的脱壳比率不少于通过从未脱壳原料的脱壳比率(100%)中减去大麦的外壳比率(通常是7-8%)而确定的值的原料,所述值即约92-93%。术语"脱壳比率"指在谷物脱壳后剩余的谷物的比率。例如,术语"90%的脱壳比率"指在谷物的表面层部分有10%的外壳等被脱去。在本发明中,术语"粗大麦"包括那些从未脱壳的大麦到外壳仍保留在谷粒表面上的脱壳大麦,即具有90%和更多脱壳比率的原料。术语"外壳"指覆盖谷物颗粒表面的外面部分。在本发明中,用作培养原料的豆类和块茎的实例包括大豆,红豆,甜马铃薯等。那些培养原料仅经过了将它们壳上的土洗去的处理,没有经过如切割,压碎等的处理,并且用于制备完全覆盖有壳的液体培养基。在本发明中,豆类和块茎作为培养原料可以被加热或冷冻处理,而其壳仍然保留。在本发明中,用作培养原料的"苋属植物"是属于苋科(Amamnthaceae)家族苋属的植物的通用术语。在谷物中,苋属植物具有高的蛋白质含量和作为氨基酸之一的赖氨酸含量,与大豆中的含量相同。除此之外,与脱壳的水稻相比,苋属植物是包含大量钙、铁和纤维的高营养谷物。出产地区是南/中美州国家,印度,喜马拉雅山脉和尼泊尔的具体区域。另一方面,藜属植物是Agatha家族的一年生草本,其主要生长在高原如位于秘鲁南部和玻利维亚西部的安迪斯山脉。藜属植物富含矿物质,维生素,蛋白质和膳食纤维。可以单独或组合使用苋属植物和藜属植物作为培养原料。那些原料可以直接用于制备液体培养基,而无需经过预处理如研磨或压碎。上述培养原料的一种或其两种或多种的组合用于制备如下所述的液体培养基。上述培养原料与水混合以制备液体培养基。可以调节培养原料的混合比率到目的重组蛋白被选择性地产生并且在曲霉培养产物中积累的程度。例如,当将大麦用作培养原料时,通过将1-20%(重量/体积)的大麦加入水中制备液体培养基。当使用未脱壳的大麦时,更优选地加入8-10%(重量/体积)制备液体培养基。当将95%-脱壳的大麦用作培养原料时,通过加入更优选地1-4%(重量/体积)制备液体培养基。接下来,当将其糠被去除的未脱壳水稻用作培养原料时,通过加入1-20%,优选地5-13%,或更优选地8-10%(每个值以重量/体积表示)的未脱壳水稻到水中来制备液体培养基。当将豆类用作培养原料时,通过加入1-10%的豆到水中,优选地,通过加入8-10%的大豆或1-2%(每个值以重量/体积表示)的红豆到水中制备液体培养基。当将块茎用作培养原料时,通过加入l-10%(重量/体积)的块茎到水中制备液体培养基。当将苋属植物用作培养原料时,通过加入1.5-15%,优选地2-10%,或更优选地2-8%(每个值都以重量/体积表示)的苋属植物到水中制备液体培养基。当将藜属植物用作培养原料时,通过加入1.5-7%,优选地2-6%,或更优选地2-4%(每个值以重量/体积表示)的藜属植物到水中制备液体培养基。可以对待混合的培养原料的量进行适当地选择,因为最适合的量根据所用的培养原料的脱壳程度或种类,所用的作为宿主的曲霉菌株,所用的启动子,生产的重组蛋白等而变化。当所用的培养原料的量超过上限时,培养液体的粘度增加并且需氧培养重组曲霉所需的氧或空气的供应变得不足。这减少了培养产物中的氧含量,限制了培养进程,因此不是优选的。另一方面,当所用的原料的量少于下限,目的重组酶不能以大量产生。可以在培养前首先将培养原料中存在的淀粉进行胶凝化。可以根据,但不特别限于常规方法的任一种来胶凝化淀粉,所述常规方法包括蒸汽方法,烘烤方法等。可以在如后面所述的对液体培养基灭菌的步骤中,当通过在高温和高压下灭菌将它们加热到胶凝化温度或更高时,进行淀粉的胶凝化。除了上述培养原料之外,理想地将有机物质,无机盐等加入用于本发明的液体培养基作为营养源。例如,当将白曲霉如y^/ergz7/wA:awac/z/z'或黑曲霉如泡盛曲霉(A;ergz7/wawamon〕和黑曲霉04^ergZ〃wm'ger)用作宿主时,优选地组合使用硝酸盐和磷酸盐,或更优选地,除它们之外联合使用硫酸盐。硝酸盐的实例包括硝酸钠和硝酸钾,并且硝酸钾是特别优选的。磷酸盐的实例包括磷酸二氢钾和磷酸铵,并且特别优选磷酸二氢钾。硫酸盐的实例包括七水合硫酸镁,七水合硫酸铁和硫酸铵,并且特别优选七水合硫酸镁和七水合硫酸铁。可以组合使用它们的两种或更多。当使用白曲霉或黑曲霉时,液体培养基中的无机盐的浓度被调节到目的重组蛋白被选择性地产生并且积累在曲霉培养产物中的程度。具体而言,硝酸盐的浓度是O.l-2.0%,优选地0.2-1.5%,磷酸盐的浓度是0.05-1.0%,优选地0.1-0.5%,并且硫酸盐的浓度是0.01-0.5%,优选地0.02-0.1%(每个值以重量/体积表示)。当使用黄曲霉如米曲霉"we7^7/woo^ae)和酱油曲霉(Aspergillussojae)时,优选地在液体培养基中一起使用硝酸盐,磷酸盐和硫酸盐。硝酸盐的实例包括硝酸钠和硝酸钾,并且特别优选硝酸钠。磷酸盐的实例包括磷酸二氢钾和磷酸铵,并且磷酸二氢钾是特别优选的。硫酸盐的实例包括七水合硫酸镁,七水合硫酸铁和硫酸铵,并且特别优选七水合硫酸镁和七水合硫酸铁。可以组合使用那些无机盐的两种或更多。当使用黄曲霉时,液体培养基中的无机盐的浓度被调节到目的重组蛋白被选择性地产生并且积累在曲霉培养产物中的程度。具体而言,硝酸盐的浓度是0.1■2.0%,优选地0.2画1.5%,磷酸盐的浓度是0.05■1.0%,优选地0.1-0.5%,硫酸盐的浓度是0.01-0.5%,优选地0.02-0.1%(每个值以重量/体积表示)。可以适当地将除上述无机盐之外的有机物质和无机盐加入本发明的液体培养基中作为营养源。没有对那些添加剂进行特别的限制,只要它们是通常用于培养曲霉的。有机物质的实例包括米糠,麦麸,玉米浆,豆饼和脱脂大豆。无机盐的实例包括水溶性化合物如铵盐,钾盐,钙盐和镁盐。可以同时使用有机物质和/或无机盐的两种或多种。没有对其添加量进行特别限制,只要其促进了重组曲霉的增殖。有机物质的添加量优选地是约0.1-5%(重量/体积),无机盐的添加量优选地是约0.1-1%(重量/体积)。不优选那些营养源的添加量超过上限,因为会抑制重组曲霉的生长。也不优选添加量少于下限,因为目的重组蛋白不能大量产生。如果必要,可以将由此获得的液体培养基进行灭菌处理并且不对处理方法进行特别的限制。例如,其可以是在121。C的温度进行15分钟的高温和高压灭菌方法。将灭菌的液体培养基冷却到培养温度,接着将重组曲霉接种到液体培养基中。用在本发明中的重组曲霉是通过转化作为宿主的曲霉获得的原料,并且可以是通过如下所述的培养方法,用上述液体培养基培养的原料。用作宿主的曲霉可以是这样的原料,其产生受由于营养物如糖和氨基酸浓度造成的分解代谢物阻抑的影响的酶。其实例包括白曲霉如」^Wg///^bwac/n'"黑曲霉如泡盛曲霉和黑曲霉,和黄曲霉如米曲霉和酱油曲霉。本发明的重组曲霉通过将编码目的蛋白的基因与启动子的下游连接,并且将连接产物引入作为宿主的曲霉而获得。可以将任何启动子用在本发明中,只要其在作为宿主的曲霉中表达下游基因,并且其优选的是以高产量在曲霉的细胞外生产的酶的启动子。更优选使用编码这样的酶的基因的启动子,所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸的浓度造成的分解代谢物阻抑的影响。其具体的实例包括编码淀粉分解酶如葡糖淀粉酶(GlaA或GlaB)和a-淀粉酶(AmyB),纤维素分解酶如葡聚糖酶(EglA)和蛋白水解酶如酸性蛋白酶(PepA)的基因的启动子。在本发明中,通过使用上述培养原料培养重组曲霉,因此原料中的营养物如糖和氨基酸的分解耗费很多时间,从而阻碍了营养物向培养系统中的释放率。因此,激活了编码这样的酶的基因的启动子,所述酶受到由于那些营养物的浓度造成的分解代谢物阻抑的影响,存在于启动子下游的编码目的蛋白的基因的转录水平增加,由此大量产生目的重组蛋白。在本发明中,编码目的蛋白质的基因可以是这样的材料,其可以在作为宿主的曲霉中表达,并且可以是cDNA或染色体DNA。在本发明中,术语"蛋白质"包括糖蛋白。编码目的蛋白的基因不限于来自曲霉的基因。来自其它生物种类的基因也可以使用,只要所述基因适合于使用曲霉作为宿主来生产重组蛋白。除了启动子和编码目的蛋白的基因之外,可以任选地将其中连接了终止子,选择标记物等的连接产物等引入本发明的重组曲霉中。终止子可以是在作为宿主的曲霉中发挥功能的材料,并且优选使用以高产量在曲霉的细胞外部生产的酶的终止子。在本发明中,可以通过典型方法如在PEG存在下将质粒载体引入宿主的原生质体的方法(Unkles,等,Mol.Gen.Genet(分子基因遗传).,218,99-104(1989))进行作为宿主的曲霉的转化。可以将任何质粒用于载体,只要其适合于宿主曲霉。例如,根据目的,所述质粒可以通过使用pPTRIDNA,pPTRIIDNA(塔卡拉生物公司(TAKARABIOINC))等产生。然而,所述质粒不受限于那些。为了将编码上述目的蛋白质的基因引入上述载体中,可以使用众所周知的方法。其中一个方法包括,用适合的限制性内切酶裂解编码目的蛋白质的纯化的基因,将裂解的基因插入适合的载体DNA的限制性酶位点或多克隆位点从而将裂解的基因与载体连接。使用适合的选择培养基培养如上所述转化的曲霉。随后,分离得到的菌落以获得其中插入编码目的蛋白的基因的重组曲霉。可以将由此获得的重组曲霉用于单菌株培养,或用于两个或多个同种或异种菌株的混合培养。容许使用在预培养中获得的孢子或菌丝体的任一形式。然而,优选使用菌丝体,因为对于对数生长阶段需要更短的时期。没有对接种到液体培养基中的重组曲霉的量进行特别限制,但是孢子的数量可以在约1x104-1x106/ml液体培养基的范围内。对于菌丝体,优选地接种约0.1-10%的预培养液体。可以优选地将重组曲霉的培养温度设定到25-45°C,或更优选地30-40°C,但是没有对其进行特别限制,只要生长没有被不利地影响。如果培养温度低,其可能会被感染性微生物所污染,因为重组曲霉的生长变慢。当将黄曲霉用作宿主时,酶活性通过根据黄曲霉的生长阶段控制培养温度而得到增加。具体而言,在细胞的增殖阶段,培养温度可以维持在25-35°C,优选地在28-33。C,所述细胞的增殖阶段起始于培养的开始阶段,并且在起始的12-36小时后终止,在随后的酶生产阶段,培养温度在35-45°C,优选地在37-42。C。培养装置可以是能够进行液体培养的那些的任一种。曲霉必须需氧培养,因此培养应该在需氧条件下进行,其中将氧或空气供应到培养基中。此外,优选在培养过程中搅拌培养基从而将原料,氧和重组曲霉在培养过程中均匀分布在装置中。搅拌条件和通风量可以是任意的只要培养环境维持在需氧环境,并且可以根据培养装置,培养基的粘度等进行适当选择。通过上述培养方法培养重组曲霉从而以高产量在培养产物中生产目的重组蛋白。在本发明中,接着从得到的曲霉培养产物中收集重组蛋白。可以将任何众所周知的技术用于收集重组蛋白的方法。例如,采取过滤,离心培养产物等以获得培养上清液,和任选通过使用吸附树脂,电泳等浓縮、纯化培养上清液的方法。实施例在下文,本发明将通过实施例等的方式更详细描述。然而,本发明并不限于这些实施例。实施例1(通过使用黄曲霉作为宿主生产重组蛋白的方法)(制备培养基)用于黄曲霉的液体培养基的组成如下:2.0%的98%-脱壳大麦(斯特灵,产于澳大利亚(Starling,madeinAustralia)),1.2%的硝酸钠,0.8%的氯化钾,0.4%的磷酸二氢钾,0.2%的七水合硫酸镁和0.08%的七水合硫酸铁(每个值以重量/体积表示)。作为对照,使用DPY培养基(包含2G/。的糊精,P/。的聚胨(polypeptone)),0.5%的酵母提取物,0.5%的磷酸二氢钾和0.05%的硫酸镁(每个值以重量/体积表示))。将20ml的每种培养基分别置于100-ml的带挡板的锥形烧瓶中,并用高压灭菌器以121°C灭菌15分钟。C重组曲霉)使用niaD300-Derfl作为重组曲霉,其己经于1997年7月30日以保藏号FERMBP-10667保藏在国际专利生物保藏机构,日本产业技术研究心6,1-1-1Higashi,筑波,茨城,日本(旧的名称和地址发酵研究所、,产业技术研究所,国际贸易与工业部门,1-1-3Higashi,筑波,茨城,日本),并且其于2006年8月28日从最初的保藏处被转移到国际保藏处。重组曲霉niaD300-Derfit根据在JP-A-11-75840中所述的方法,使用在其中结合了DerflE(-l)K的分解硝酸盐的突变体菌株米曲霉niaD300作为宿主获得,所述DerfIE(-l)K即通过将糖蛋白Derfl的cDNA前序列中3'端的谷氨酸密码子改变为赖氨酸密码子获得的DNA片段,所述糖蛋白Derfl是粉尘螨(Dermatop/zagoz'^s/an'm^)中存在的主要的变应原(见,H.Shoji,等:Biosd.Biotechnol.Biochem.,61(10),1668-1673,1997)。在niaD300-DerflDNA中,将来自米曲霉的glaA启动子连接到DerflE(-l)KDNA上游,并且将来自米曲霉的amyB终止子连接在DerflE(-l)KDNA的下游。(培养重组曲霉)将获得的重组曲霉niaD300-Derfl的约106的分生孢子分别接种到20ml的如上所述获得的培养基的每一种中,并且在30°C和100ipm摇动培养24小时。(纯化重组蛋白DerflE(-l)K)在液体培养结束后,将每种培养液体以3,000xg在4°C离心10分钟。直接将内切糖苷酶Hf(生物实验室公司(BiolabsCompany))以10单位/ml的浓度加入培养上清液中并容许其在保持37°C时反应3小时,从而进行糖链的修剪。将得到的反应液体通过强阴离子交换柱(商标名QMA,Waters公司),所述柱已经用20mM的磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡以吸附a-淀粉酶,其在反应液体中大量存在。将赖氨酰内肽酶(瓦克纯化学品工业公司(WakoPureChemicalIndustriesInc.)加入已经通过但没有被吸附到QMA柱上的级分中从而使终浓度是10|ag/ml以裂解DerfIE(-l)K前序列。随后,在4。C,将产物通过50mMTris-HCl(pH9.0)透析过夜。将由此获得的浓縮物直接负载到DEAE-Sephacel柱(阿莫仙生物科学K.K.(AmershamBio-SciencesK.K).)上,其已经用50mMTris-HCl(pH8.0)平衡,接着用20mMTris-HCl(pH8.0)以柱的量的3倍的量洗涤。随后,通过使用NaCl浓度梯度洗脱吸附到柱上的成熟的重组蛋白DerflE(-1)K。通过使用抗-Derfl抗体的蛋白质印迹分析来检测包含成熟重组蛋白DerflE(-1)K的级分以收集具有高纯度的级分并且作为纯化的样品使用。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实纯化的样品的纯度为90%或更多。通过使用BCA蛋白质测定试剂盒(皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology,Inc.))进行纯化样品的蛋白质量化分析。(结果)重组蛋白DerfIE(-l)K的产率当使用DPY培养基时,获得约8mg成熟重组蛋白DerflE(-l)K/L培养基。当使用黄曲霉的液体培养基时,获得约24mg成熟重组蛋白DerflE(-1)K/L培养基。以这种方式,发现根据本发明生产的重组蛋白的量是通过使用常规DPY培养基的方法产生的量的三倍。重组蛋白DerflE(-l)K具有不同于天然Derfl的糖链的糖链。然而,重组蛋白DerflE(-1)K显示IgE-结合能力并且其皮肤刺激与天然Derfl的那些相等。因此,将重组蛋白用作天然Derfl的备选来制备抗体,治疗变态反应等。实验实施例1(测量各种酶基因在用于烧酒的白曲霉中的启动子活性)为了证实在白曲霉中的各种酶基因的启动子可用于本发明,通过下列方法测量那些启动子的表达水平。<使用的菌株>v^/e/^〃wbvrac/7"NBRC4308<培养条件>培养基的组成如下2.0%的98%-脱壳大麦(斯特灵,产于澳大利亚(Starling,madeinAustralia)),0.2%的硝酸钠和0.3°/。的磷酸二氢钾(每个值以重量/体积表示)。将100ml的培养基置于500-ml带挡板的锥形烧瓶中,并用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟。将Ape^7/wAzwacMNBRC4308的约106的分生孢子接种到100ml的如上所述获得的培养基中,并且在37。C和100rpm摇动培养18小时。对于比较对照,用如上所述的相同的培养基组成和培养条件进行培养,除了在培养基中使用65%-脱壳大麦或98%-脱壳大麦压碎产物(它们都是斯特灵,产于澳大利亚(Starling,madeinAustralia))来取代98%-脱壳大麦。〈制备总RNA〉在培养结束后,快速收集细胞并在液态氮存在条件下充分压碎。从压碎的曲霉细胞,通过使用总RNA提取试剂盒(即,Rneasy植物微型试剂盒,由QIAGEN生产),按照其方法制备总RNA。〈制备cDNA〉从得到的总RNA,通过使用高能cDNA获得试剂盒(由应用生物系统(AppliedBiosystems)生产),按照其方法合成cDNA。<定量实时PCR>通过使用得到的cDNA作为模板,并且通过使用如下所述的根据目的酶基因的碱基序列设计的引物进行定量实时PCR,以对酶基因的表达水平进行定量。通过使用引物设计软件(PrimerExpresssoftware)(由应用生物系统(AppliedBiosystems)生产)分别设计用于定量实时PCR的引物。具体地,将引物序列如下所述表示。将编码组蛋白的H2A基因用作比较定量方法的内标。通过使用SYBRGreenPCRMasterMix(由应用生物系统(AppliedBiosystems)生产)作为定量实时PCR的试剂,按照所附的方法进行PCR和信号检测。通过使用ABIPRISM7700(由应用生物系统(AppliedBiosystems)生产)进行PCR和信号检测。<使用的基因和引物序列>(1)葡糖淀粉酶gla-l(来自^s/erg说w^W(3c/z",GenBank登记号.D00427)正向引物1589-ccagctcgacctatagcagcat(SEQIDNO:1在序列表中)反向引物1761-aagtctgatggcgacgagct(SEQIDNO:2)设计引物对从而扩增由上述gla-l(GenBank登记号D00427)的第1,589到第1,780碱基组成的DNA片段。(2)酸稳定性a-淀粉酶asaA(来自A^erg说wfewac/2",GenBank登记号AB008370)正向引物994-cggcacggcagatgatc(SEQIDNO:3)反向引物1044-gaatgtacctcatggtcgacgtc(SEQIDNO:4)设计引物对从而扩增由上述asaA(GenBank登记号AB008370)的第994到第1,066碱基组成的DNA片段。(3)a-淀粉酶amyA(来自A戸g/肠A;a丽c械GenBank登记号AB109452)正向引物1874-acactcctgggcacattcg(SEQIDNO:5)反向引物1989-ttacaccaacgacatagccct(SEQIDNO:6)设计引物对从而扩增由上述amyA(GenBank登记号AB109452)的第1,874到第2,009碱基组成的DNA片段。(4)组蛋白H2A(来自黑曲霉,GenBank登记号Y15320)正向引物289-actgaacaagctcctgggtca(SEQIDNO:7)反向引物322-ccagggtggtgtcctcccc(SEQIDNO:8)设计引物对从而扩增由上述H2A(GenBank登记号Y15320)的第289到第340个碱基组成的DNA片段。<结果>将各个酶基因的表达水平定量为相对于组蛋白H2A的表达水平的值。表1显示结果。在其中使用98%-脱壳大麦的实验设计(本发明)中,与在对照设计中的那些比较,各个基因的表达水平增加。因此,揭示那些酶基因的启动子有效用于本发明的生产重组蛋白的方法中。表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实验实施例2(测量在用于烧酒的黑曲霉中的酶基因的启动子活性)为了证实在黑曲霉中的各种酶基因的启动子可用于本发明,通过下列方法测量那些启动子的表达水平。艮口,通过与实验实施例1中相同的方法培养泡盛曲霉NBRC4388。随后,在培养结束后,以与实验实施例l相同的方式从获得的细胞中提取总RNA,并合成cDNA。此外,通过使用得到的cDNA作为模板,以与实验实施例1相同的方式定量如下所述的目的酶基因的表达水平。用在定量实时PCR中的引物序列如下所述。<所用的基因和引物序列>(1)a-淀粉酶amyA(如在实验实施例1中所述相同的amyA)使用与实验实施例1中相同的引物对(SEQIDNOS:5和6)(2)酸性蛋白酶pepA(来自泡盛曲霉,GenBank登记号M34454)正向引物793-ttttgggactggcctttagct(SEQIDNO:9在序列表中)反向引物900-ttcttcgacaccgtcaagtcc(SEQIDNO:10)设计引物对从而扩增由上述pepA(GenBank登记号M34454)的第793到第920碱基组成的DNA片段。(3)组蛋白H2A(与实验实施例1中所述相同的H2A)使用与在实验实施例1中相同的引物对(SEQIDNOS:7和8)。<结果>将各个酶基因的表达水平定量为相对于组蛋白H2A的表达水平的值。表2显示结果。在其中使用98%-脱壳大麦的实验设计(本发明)中,与在对照设计中的那些比较,各个基因的表达水平增加。因此,揭示那些酶基因的启动子有效用于本发明的生产重组蛋白的方法中。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实验实施例3(测量用于日本米酒的黄曲霉的酶基因的启动子活性)为了证实在黄曲霉中的各种酶基因的启动子可用于本发明,那些启动子的表达水平通过下述方法进行测量。<所用的菌株>米曲霉NRIB40<培养条件>培养基的组成如下:2.0%的98%-脱壳大麦(斯特灵,产于澳大利亚(Starling,madeinAustralia)),1.2%的硝酸钠,0.8%的氯化钾,0.4%的磷酸二氢钾,0.2%的七水合硫酸镁和0.08%的七水合硫酸铁(每个值以重量/体积表示)。将100ml的培养基置于500-ml的带挡板的锥形烧瓶中,并用高压灭菌器在121°C灭菌15分钟。将约106的米曲霉RIB40的分生孢子接种到100ml的如上所述获得的培养基中,并在30。C和100rpm摇动培养42小时。对于比较对照,用如上所述相同的培养基组成和培养条件进行培养,除了使用65%-脱壳大麦或98%-脱壳大麦压碎产物(它们都是斯特灵,产于澳大利亚(Stirling,madeinAustralia))取代98%-脱壳大麦。随后,在培养结束后,以与实验实施例l相同的方式从获得的细胞提取总的RNA,并合成cDNA。此外,通过使用得到的cDNA作为模板,以与实验实施例l相同的方式定量如下所述的目的酶基因的表达水平。用于定量实时PCR的引物序列如下所述。将编码组蛋白的H4基因用作比较定量方法的内标。<所用的基因和引物序列>(1)葡糖淀粉酶glaA(来自米曲霉,GenBank登记号D01035)正向引物1247-cgtgcagatcgtccaaacct(SEQIDNO:11在序列表中)反向引物1357-acttctcacggccaacaacc(SEQIDNO:12)设计引物对从而扩增由上述glaA(GenBank登记号D01035)的第1,247到第1,376碱基组成的DNA片段。(2)a-淀粉酶amyA(来自米曲霉,GenBank登记号AB021876)正向引物21762-cactcctgggcacattcgt(SEQIDNO:13)反向引物21875-gttacaccaacgacatagccctc(SEQIDNO:14)设计引物对从而扩增由上述amyA(GenBank登记号AB021876)的第21,762到第21,897碱基组成的DNA片段。(3)(3-葡聚糖酶ce旧(来自米曲霉,GenBank登记号D83"2)正向引物1137-caaactgggaatgccacaaa(SEQIDNO:15)反向引物1187-tgaagacggagagaactattccatg(SEQIDNO:16)设计引物对从而扩增由上述ce旧(GenBank登记号D83732)的第1,137到第1,211碱基组成的DNA片段。(4)酸性蛋白酶pepA(来自米曲霉,GenBank登记号D13894)正向引物897-cgctagcaagattagcgatcagt(SEQIDNO:17)反向引物958-gctttcagctcgatcaacactg(SEQIDNO:18)设计引物对从而扩增由上述pepA(GenBank登记号D13894)的第897到第979碱基组成的DNA片段。(5)组蛋白H4(来自米曲霉,GenBank登记号AB033943)正向引物110-cgtgacaacatccagggtatca(SEQIDNO:19)反向引物171-tcaagcgtatctctgccatga(SEQIDNO:20)设计引物对从而扩增由上述H4(GenBank登记号AB033943)的第110到第191碱基组成的DNA片段。<结果>将各个酶基因的表达水平定量为相对于组蛋白H4的表达水平的值。表3显示结果。在其中使用98%-脱壳大麦的实验设计(本发明)中,与在对照设计中的那些比较,各个基因的表达水平增加。因此,揭示那些酶基因的启动子有效用于本发明的生产重组蛋白的方法。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>工业应用性根据本发明,提供了通过使用曲霉作为宿主大量生产重组蛋白的方法。曲霉在廉价的培养基中培养,并且不需要特殊的培养装置,因此生产需要的蛋白的成本较低。此外,长期以来,就已经将曲霉用于生产发酵食品和饮料,因此其作为宿主是高度安全的,并且得到的重组蛋白可以用于各种目的。权利要求1.一种通过使用重组曲霉生产重组蛋白的方法,所述重组曲霉通过转化作为宿主的曲霉获得,所述方法包括在液体培养基中培养重组曲霉,所述液体培养基包含选自由下列各项组成的组的至少一种作为培养原料其表面完全或部分被至少外壳所覆盖的谷物,其表面被壳所覆盖的豆类和/或块茎以及不需要经过预处理如研磨或压碎的苋属植物和/或藜属植物;和从培养产物中收集重组蛋白。2.根据权利要求l的生产重组蛋白的方法,其中重组曲霉通过将编码目的蛋白的基因连接到编码酶的基因的启动子下游,以获得连接的产物,并且将连接的产物引入作为宿主的曲霉中而获得,所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸的浓度造成的分解代谢物阻抑的影响。3.根据权利要求2的生产重组蛋白的方法,其中所述启动子是编码选自由淀粉分解酶,纤维素分解酶和蛋白水解酶组成的组的任意一种酶的基因的启动子。全文摘要本发明的目的是提供大量生产重组蛋白的方法,其是用曲霉作为宿主,通过液体培养方法进行的。根据本发明,提供通过使用重组曲霉生产重组蛋白的方法,所述重组曲霉通过转化作为宿主的曲霉获得,所述方法特征在于包括在液体培养基中培养重组曲霉,所述液体培养基包含选自由下列各项组成的组的至少一种作为培养原料其表面完全或部分被外壳所覆盖的谷物,其表面被壳所覆盖的豆类和/或块茎以及不需要经过预处理如研磨或压碎的苋属植物和/或藜属植物;和从培养产物中收集重组蛋白。文档编号C12R1/69GK101283103SQ20068003771公开日2008年10月8日申请日期2006年9月26日优先权日2005年10月12日发明者小路博志,杉本利和申请人:朝日啤酒株式会社
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1