用于诊断流感a病毒的h5和n1基因的存在的寡核苷酸，其用途，检测方法和试剂盒的制作方法

专利名称：：用于诊断流感a病毒的h5和n1基因的存在的寡核苷酸，其用途，检测方法和试剂盒的制作方法用于诊断流感A病毒的H5和N1基因的存在的寡核苷酸，其用途，检测方法和试剂盒本发明涉及在存在至少一种固相支持物的条件下标记核酸的方法。本发明涉及寡核苷酸，其分别用于扩增和检测位于流感A病毒基因组的H5和N1基因中的两个耙序列。本发明还涉及利用这些寡核苷酸的用途，用于检测流感A病毒的H5和N1基因的存在的方法和用于诊断流感A病毒的H5和N1基因的存在的试剂在通常用于诊断流感的常规技术中，通常涉及凝集作用，抑制凝集作用或琼脂凝胶中的扩散。这些方法通常被使用并使得可以定性流感病毒A。这些方法的可选替代是在胚胎阶段的鸡卵中或在MDCK细胞中根据IOE[InternationalOfficeforEpizootics]手册中的方案进行病毒培养。然而，需要数天才能获得定性结果，这一延迟有时与临床需要或紧急情况有矛盾。用于检测抗体或抗原的ELISA技术或免疫荧光检测也得到极大发展，但这些"免疫学"检测方法与常规病毒培养相比通常敏感性和特异性较低。最近高致病形式的禽流感病毒H5N1亚型的出现重新唤起了对快速、特异性且高敏感性诊断检测的需要。为此，上述各种方法已经逐渐被"分子"技术取代，诸如RT-PCR技术(与聚合酶链反应相关的逆转录)。RT-PCR更为敏感，不需要样品中存在"活"病毒，由此使得将流感病毒的各种形式分类并分成亚类成为可能。该实时技术("实时RT-PCR")的发展也极大促进了其在诊断A型病毒中的应用。例如，D.M.Whiley等在最近公开的文献(DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDiseases(2005)，inpress)中描述了用于检测临床样品中的广谱流感病毒亚型的实验，其基于涉及5，-核酸酶的RT-PCR反应。选择两种寡核苷酸和探针，其与编码A病毒的23种亚型的M(基质)蛋白的基因同源。该检测由此使得检测临床样品中的流感A病毒成为可能，但是另一方面，仍不能精确检测所涉及类型的亚类。E.K.O.Ng等最近公开(EmergingInfectiousDiseases(2005)vol.11(8)，p.1303-1305)了基于多重RT-PCR反应的检测，其包含两个步骤，利用两组寡核苷酸和标记的探针，从而特异性耙向H5N1的HA基因的两个区域。这样使得能够开发快速并敏感地直接检测人样品中的H5亚型的检测法。该检测法已经在临床样品中证实，所述样品源自在香港和越南的感染流感病毒H5N1亚型的患者，但仍不能直接诊断所感染病毒的亚型。S.Payungporn等描述(ViralImmunology(2004)vol.17(4)，p.588-593andJournalofVirologicalMethods(2005)，inpress)同时检测H5N1亚型的M，H5和N1序列的方法，其基于实时多重RT-PCR检测法并一步完成。对应M,H5和Nl序列的寡核苷酸以及各种标记的TaqMan探针被选择并用于该检测法中从而同时检测三种荧光信号。H5和N1寡核苷酸从覆盖H5N1病毒的50个已知特异性序列的不变区中选择。但应注意该RT-PCR方法为非等温的，有时易于发生污染。另一种可用于检测感染因子存在的分子方法是NASBA技术(NucleicAcidSequence-BasedAmplification)。例如，R.A.Collins等描述(JournalofVirologicalMethods(2002)vol.103，p.213-225andAvianDiseases(2003)vol.47(3)，p.1069-1074)了禽流感H5亚型的检测(检测高致病性以及弱致病性亚型)，其利用与ECL(电子化学发光法)检测系统结合的NASBA技术。NASBA技术是涉及多种酶活性的核酸的等温扩增，其允许快速检测H5病毒。通过该方法扩增核酸适合RNA基因组，诸如流感病毒基因组，通过将逆转录步骤直接引入扩增反应。然而，尽管这篇文献中描述的方法使得可能检测并却分弱致病性菌株和高致病性菌株，仍不能特异性鉴别该菌株的H5N1型。利用转录扩增技术鉴别H5N1形式的流感A病毒的检测法，其尤其适合扩增和检测RNA病毒，由此仍有待开发。此外，多重检测法，即能同时扩增并检测H5和N1两个基因的检测法，其中的扩增技术是转录扩增技术诸如NASBA，尤其有利。本发明由此涉及两对寡核苷酸，其分别用于扩增位于流感A病毒基因组的H5基因和N1基因中的两个耙序列，其中用于扩增H5基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.1:TGTATGTTGTGGAATGGCA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.2:GCCGAATGATGCCATCAA或其互补序列，其中用于扩增N1基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.3:CGTGGATTGTCTCCGAAA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.4:GGAATGCTCCTGTTATCCTGA或其互补序列。本发明还涉及寡核苷酸对，用于扩增位于流感A病毒基因组的H5基因中的靶序列，所述寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.1:TGTATGTTGTGGAATGGCA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.2:GCCGAATGATGCCATCAA或其互补序列。类似地，本发明还涉及这样的寡核苷酸对，用于扩增位于流感A病毒基因组的N1基因中的耙序列，所述寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.3:CGTGGATTGTCTCCGAAA或其互补序列，和-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.4:GGAATGCTCCTGTTATCCTGA或其互补序列。在上述三种情况中，在寡核苷酸对中，第一寡核苷酸还包括可被DNA-依赖性RNA聚合酶识别的启动子序列。根据上述两种情况，其中当添加了启动子序列的寡核苷酸使得可能扩增位于H5基因中的耙序列时，其基本上由以下序列组成SEQIDNo.5:aattctaatacgactcactataggggTGTATGTTGTGGAATGGCA，或其互补序列。该序列中的小写字母对应T7启动子序列。如上文所述相同，当该寡核苷酸使得能够扩增位于Nl基因中的靶序列时，所述寡核苷酸基本上由以下序列组成SEQIDNo.6:aattctaatacgactcactataggggCGTGGATTGTCTCCGAAA，或其互补序列。在所有情况中，每个寡核苷酸的长度都为12-30个核苷酸并包含至少一个16个连续核苷酸的片段，优选每个寡核苷酸的长度为15-26个核苷酸并包含至少一个18个核苷酸的片段。本发明还涉及一对寡核苷酸，用作探针检测分别位于流感A病毒基因组的H5和N1基因中的两个靶序列，其中用于检测H5基因的探针由以下序列组成SEQIDNo.7:ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT或其互补序列；用于检测N1基因的探针由以下序列组成SEQIDNo.8:GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA或其互补序列，每个序列包含至少一种标记工具。本发明还涉及用作探针的寡核苷酸，所述探针用于检测扩增位于流感A病毒基因组的H5基因中的靶序列所产生的扩增的核酸序列，所述扩增通过利用上述的寡核苷酸对进行，所述检测探针的长度为10-50个核苷酸并包含源自以下序列的至少一个10个连续核苷酸的片段SEQIDNo.7:ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT，或其互补序列，所述序列包含至少一种标记工具。当需要检测流感A病毒基因组的N1基因时，本发明涉及用作探针的寡核苷酸，所述探针用于检测扩增位于检测流感A病毒基因组的N1基因中的靶序列所产生的扩增的核酸序列，所述扩增通过利用上述的寡核苷酸对进行，所述检测探针的长度为10-50个核苷酸并包含源自以下序列的至少一个10个连续核苷酸的片段SEQIDNo.8:GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA，或其互补序列，所述序列包含至少一种标记工具。本发明的一个优选实施方案中，检测探针由"分子信号"组成，其也称为分子探针。所述分子探针是单链寡核苷酸形式的检测探针，其具有本领域已知的茎环结构。该环含有与靶序列(通常为扩增子)互补的探针序列，并且所述茎通过两条成臂序列杂交而形成，其中每个序列位于探针的一个末端。荧光团共价连接于两条臂中一条的末端，淬灭剂(荧光吸收剂)连接于另一条臂的末端。分子探针在溶液中处于游离状态时不发荧光。但是，在存在互补扩增子时，它们与这些靶杂交，经历构象变化从而允许它们发出荧光。在缺乏靶时，茎结构使得荧光团与淬灭剂最为接近，从而导致荧光从荧光团转移到淬灭剂。所述淬灭剂是非荧光发色团，其将来自荧光团的能量消散为热量。当探针遇到分子靶时，形成探针-耙杂交子，所述杂交子比所述茎的两条臂形成的杂交子更长并且更为稳定。探针-耙杂交子的刚性和长度防止茎结构杂交子的同时存在。因此，分子探针经过自发构象重构，使得茎结构杂交子解离，荧光团和淬灭剂分开，从而恢复荧光。更具体的，所述检测探针其由分子探针组成，优选由以下序列组成SEQID9:[6-FAM]-cgatcgaCACCAAGTGTCAAACTCCAAtcgatcg-[DabSyl]，用于检测H5基因，SEQID10:-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl]，用于检测N1基因。当需要进行多重检测同时检测H5和N1基因并在单个容器中进行时，优选使用两种不同标记。在可能的荧光标记中，包括但不限于荧光素(FAM)四氯-6-羧基荧光素CTET)四甲基若丹明(TMR)5-羧基若丹明6G(RHD)羧基若丹明(ROX)，和花青苷5(CY5)。上述SEQIDNos.9和10中的每个序列可具有所述标记之一，使用的两种标记是不同的从而允许区分检测信号。本发明还涉及在扩增核酸的反应中使用上述一或两对寡核苷酸或将其用作探针检测可疑存在生物样品中的流感A病毒的基因组。本发明还涉及用于检测可能存在于样品中的流感A病毒的核酸的方法，其中对所述样品进行利用如上所述的寡核苷酸对扩增核酸的反应，所述反应在存在所述扩增所需的扩增剂的条件下进行，并且检测目的扩增子的存在。所述检测方法基于RT-PCR扩增反应。可选，所述检测方法基于转录扩增技术。优选，该技术是NASBA技术。本发明还涉及扩增可能存在于样品中的流感A病毒的H5和N1两基因的方法，包括以下步骤-在存在以下物质的条件下在扩增缓冲液中保温样品，两种扩增引物，每一种引物的长度均为10-50个核苷酸，一种还包含启动子序列，另一种与结合启动子序列的引物的极性相反，从而分别与位于流感A病毒的H5基因中的目的区域的上游和下游杂交，，两种扩增引物，每一种引物的长度均为10-50个核苷酸，一种还包含启动子序列，另一种与结合启动子序列的引物的极性相反，从而分别与位于流感A病毒的N1基因中的目的区域的上游和下游杂交，-将以下反应剂加入样品，具有RNA-依赖性DNA聚合酶活性的酶，，具有DNA-依赖性DNA聚合酶活性的酶，.具有RNaseH活性的酶，，具有DNA-依赖性RNA聚合酶活性的酶，以及-在适宜的条件下维持由此产生的反应混合物足以使得扩增发生的一段时间。在上文中列出了四种酶，但是完全可能利用具有两种甚至三种上述活性的一种酶;在这种情况中，使用三种甚至两种酶是可能的并且涵盖在本发明的范围中。此外，确立扩增所需的其他因素时必须的，诸如核苷酸。所述因素是本领域技术人员已知的。最后，本发明提供用于检测可能存在于样品中的流感A病毒的H5和N1基因的试剂盒，其包含-如上文所述的两对扩增寡核苷酸或引物，其用于扩增目的H5和N1的两个区域，-两种寡核苷酸，其为如上所述的标记的或可标记的形式，并且具有基本上与扩增的H5或N1核酸序列的至少一部分互补的核酸序列，-进行扩增反应所需的反应剂。术语"基本上互补"意指在标记或可标记的寡核苷酸(也称作检测探针)与所扩增的核酸序列或扩增子的至少一部分之间的杂交，该杂交的特异性和选择性足够高，允许检测目的扩增子。13此外，进行扩增反应所需的反应剂是用于NASBA扩增的反应剂。术语"可检测标记"意指至少一种标记，其可直接产生可检测信号。例如，生物素的存在被认为是直接标记，因为其是可检测的，尽管可能随后将其与标记的链霉抗生物素结合。这些标记的非限制性列表如下产生可通过例如比色法/荧光或发光检测的信号的酶，诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，P-半乳糖苷酶或6-磷酸葡萄糖脱氢酶；发色团诸如荧光化合物/发光化合物或染料化合物，可通过电子显微镜法或通过它们的电学性质诸如传导性，电流分析，电压分析或阻抗来检测的电子致密基团，可检测基团，例如大小足以诱导其物理和/或化学性质的可检测改变的分子;该检测可通过光学方法诸如衍射，表面等离子体共振，表面改变(surfacevariation),接角虫角改变(contactanglevariation),或物理方法诸如原子力分光镜，或隧道效应来进行，放射活性分子诸如32P，"S或1251。优选，所述标记不是放射活性标记，从而避免与这些标记有关的安全性问题。本发明的一个具体实施方案中，所述标记是电化学可检测的，并且具体的所述标记是铁复合体的衍生物，诸如二茂铁。术语"核酸"意指一系列至少两种脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，任选包括至少一种修饰的核苷酸，例如至少一种包含修饰的碱基的核苷酸，诸如肌苷，甲基-5-脱氧胞苷，二甲基氨基-5-脱氧尿苷，脱氧尿苷，二氨基-2，6-嘌呤或溴代-5-脱氧尿苷，或任何其他允许杂交的修饰碱基。该多核苷酸也可在核苷酸间键合的水平修饰，例如硫代磷酸酯，H-膦酸盐或烷基-膦酸盐，或在主链水平修饰，例如，a-寡核苷酸(FR2607507)或PNA(M.Egholmetal.，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2'-0-烷基核糖和LNAs(BW.Sunetal.，Biochemistry,4160-4169，43，2004)。核酸可为天然或合成的，寡核苷酸，多核苷酸，核酸片段，核糖体RNA，信使RNA，转运RNA，或通过下述酶扩增技术获得的核酸'PCR(聚合酶链反应)，描述于专利US-A-4，683，195，US-A-4，683，202和US-A-4，800，159，及其衍生物RT-PCR(逆转录PCR)，具体在一步反应模式中，如专利EP-B-0.569,272所述，LCR(连接酶链反应)，公开与例如专利申请EP-A-0.201.184，RCR(修复链反应)，描述于专利申请WO-A-90/01069，3SR(自主维持复制系统)，见于专利申请WO-A-卯/06995，.NASBA(基于核酸序列的扩增)，见于专利申请WO-A-91/02818，.TMA(转录介导的扩增)，专利US-A-5，399，491,和'RCA(滚环扩增)(US-6，576，448)。术语扩增子指通过酶扩增技术产生的核酸。这些修饰的每一种可组合使用。上文公开的扩增和检测步骤之前是纯化步骤。术语"纯化步骤"具体意指所述微生物的核酸和核酸纯化之前的裂解步骤中释放的细胞组分之间的分离。这些裂解步骤是已知的；例如，可利用专利申请中描述的裂解方法-WO-A-00/60049，通过超声裂解，-WO-A-00/05338,混合的磁裂解和机械裂解，-WO-A-99/53304，电裂解，禾口-WO-A-99/15621，机械裂解。本领域技术人员可利用其他已知裂解方法，诸如热休克或渗透休克或利用离液剂诸如胍盐进行处理(专利US-A-5，234，809)。该步骤通常可浓縮核酸。例如，可利用固相支持物，诸如磁性颗粒(参见专利US-A-4，672，040和US-A-5，750，338)，由此通过洗涤步骤纯化附着于这些磁性颗粒的核酸。如果需要随后扩增所述核酸该核酸纯化步骤尤其有利。尤其有利的这些磁性颗粒的实施方案描述于专利申请WO-A-97/45202和WO-A-99/35500。术语"固相支持物"包括所有可附着核酸的材料。合成材料或天然材料，其可选经过化学修饰，可用作固相支持物，尤其是多糖，诸如基于纤维素的材料，例如纸/纤维素衍生物诸如醋酸纤维素和硝酸纤维素或葡聚糖;聚合物，共聚物，尤其是基于苯乙烯类型的单体，天然纤维素诸如棉花，以及合成纤维诸如尼龙；矿物质诸如硅胶，石英，玻璃，陶瓷；橡胶；磁性颗粒；金属衍生物，凝胶等。固相支持物可为微量滴定板的形式，膜的形式，颗粒形式或基本平的玻璃或硅板的形式，或其衍生物。可在一个试管中进行整个过程(从样品获取到可用于杂交的扩增子)，人工或自动机器操作。所附实例代表具体的实施方案并且不理解为限制本发明的范围。在这些实施例中可进行多组对照。首先是利用水的阴性对照；在此情况中，没有检测到H5或N1的信号。其次，利用流感H3N2RNA的特异性对照；其中没有检测到H5或N1的信号。实施例1:在来自亚洲人临床样品的H5N1RNA上评估H5N1引物的试验寡核苷酸对的序列(N1—P^BN2_P2，用于扩增并检测N1序列，H5_P1和H5一P2，用于扩增并检测H5序列)以及以分子探针形式存在的检测探针(分子探针N1和分子探针H5)如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>粗体字所示序列对应T7启动子序列，由T7RNA聚合酶识别，并发现在P1寡核苷酸中进行NASBA技术。所述样品利用miniMAG系统处理，如操作方案中所述。所用试剂盒为-NucliSens裂解液，bioM6rieuxB.V.(Boxtel，Holland),批号200295，和-NucliSens磁性提取剂，bioM6rieuxB.V.，批号#200297。检测试验的操作方案根据NucliSensEasyQ基本试剂盒(bioM6rieuxB.V.，Boxtel，Holland,BatchNo.#285006)的说明，制备两种反应混合物，一种用于扩增和检测H5序列("混合物"H5)，另一种用于扩增并检测N1序列("混合物N1")。简而言之11nl水，13pi1.2M的KC1，分别为4^1的寡核苷酸(H5一P1和H5-P2或NLP1和N1—P2，原液为IO^M)以及0.8pl适合的检测探针(分子探针H5或分子探针Nl，原液为2nM)加入64pl稀释液。分别为IOnl的每种混合物加入5plRNA靶。同时，制备酶溶液，将5nl酶溶液加入试管中的反应混合物，使得终体积为20^。样品随后置于NucliSensEasyQ基本试剂盒推荐的反应条件下从而允许通过等温NASBA技术(Kievits，Tetal.J.Virol.Methods(1991)vol.35(3)，p.273-286)扩增并检测目的序列。为了证实该检测试验，所用RNA耙如下-H5N1:流感病毒A亚型H5N1越南1194/2004-流感病毒A:亚型H3N2，-H5对照RNA:亚型H5N3，-流感病毒B。适当(阳性和阴性)对照包含在试验中。在NucliSensEasyQ系统上扩增并检测之后，获得以下结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>这些结果显示H5N1检测探针以及寡核苷酸是特异性的并且确实检测到了它们各自的靶H5和N1。实施例2:在多重检测中评估H5N1的检测探针和弓I物的试验在多重检测中，所用的分子探针N1用CY5标记，而分子探针H5用FAM标记。为了证实所述序列在多重检测中的功能性，所用靶是合成转录物，其从重组H5N1RNA构建。其为RNA，仅仅包含H5和N1区域。其用作参照RNA评估针对H5和N1的扩增引物和检测探针的功效水平(因为其为合成转录物，可大量获得，因而不必使用非常昂贵的重组H5N1RNA)。根据NucliSensEasyQ基本试剂盒(bioM&ieuxB.V.，Boxtel，Holland,BatchNo.#285006)的说明，制备同时检测H5基因和N1基因的单个反应混合物。简而言之，将以下物质加入到64iil稀释剂中llpl水，13pll.2M的KC1，分别为8pl的寡核苷酸的溶液和分子探针的溶液(含有5^M寡核苷酸H5—P1和H5—P2用于H5，20^M寡核苷酸N1—P1和N1—P2，用于Nl,2iiM分子探针H5-FAM和2^M分子探针N1-CY5)。10nl混合物加入5plRNA耙(H5N1转录物，1000拷贝/NASBA)。H5引物和N1引物之间的浓度差异大约与敏感性差异成反比。H5引物的浓度由此比N1引物的浓度低4倍。同时，制备酶溶液，将5pl酶溶液加入试管中的反应混合物，使得终体积为20pd。样品随后置于theNucliSensEasyQ基本试剂盒推荐的反应条件下从而允许通过等温NASBA技术(Kievits，TWa/.J.Virol.Methods(1991)vol.35(3)，p.273-286)扩增并检测目的序列。结果见图l。这些结果显示了在单个试管内同时检测H5和N1对于合成转录物而言效果非常好。权利要求1.两对寡核苷酸，其分别用于扩增位于流感A病毒基因组的H5基因和Nl基因中的两个靶序列，其中用于扩增H5基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.1:TGTATGTTGTGGAATGGCA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.2:GCCGAATGATGCCATCAA或其互补序列，其中用于扩增N1基因的寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.3:CGTGGATTGTCTCCGAAA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.4:GGAATGCTCCTGTTATCCTGA或其互补序列。2.寡核苷酸对，用于扩增位于流感A病毒基因组的H5基因中的耙序列，所述寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.1:TGTATGTTGTGGAATGGCA或其互补序列，禾口-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.2:GCCGAATGATGCCATCAA或其互补序列。3.寡核苷酸对，用于扩增位于流感A病毒基因组的N1基因中的靶序列，所述寡核苷酸对由以下寡核苷酸组成-第一寡核苷酸，其长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.3:CGTGGATTGTCTCCGAAA或其互补序列，和-第二寡核苷酸，长度为10-50个核苷酸，包含至少一个10个连续核苷酸的片段，所述10个连续核苷酸源自SEQIDNo.4:GGAATGCTCCTGTTATCCTGA或其互补序歹廿。4.权利要求l-3之一的寡核苷酸对，其特征在于所述第一寡核苷酸还包括可以被DNA-依赖性RNA聚合酶识别的启动子序列。5.权利要求4的寡核苷酸对，其特征在于所述可以被DNA-依赖性RNA聚合酶识别的启动子序列是T7启动子序列。6.权利要求4或5之一的寡核苷酸对，其中当所述第一寡核苷酸使得能扩增位于H5基因中的靶序列时，所述第一寡核苷酸的特征在于其基本上由以下序列组成SEQIDNo.5:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATGTTGTGGAATGGCA，或其互补序列。7.权利要求4-6之一的寡核苷酸对，其中当所述第一寡核苷酸使得能扩增位于N1基因中的靶序列时，所述第一寡核苷酸的特征在于其基本上由以下序列组成SEQIDNo.6:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGATTGTCTCCGAAA，或其互补序列。8.权利要求l-7之一的寡核苷酸对，其特征在于每一寡核苷酸的长度均为12-30个寡核苷酸，并包括至少一个16个连续核苷酸的片段，优选每一寡核苷酸长度为15-26个核苷酸并包含至少一个18个核苷酸的片段。9.寡核苷酸对，其用作探针，用于检测分别位于流感A病毒基因组的H5和N1基因中的两个耙序列，其中用于检测H5基因的探针由以下序列组成SEQIDNo.7:ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT或其互补序列；用于检测N1基因的探针由以下序列组成SEQIDNo.8:GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA或其互补序歹!j,每个序列包含至少一种标记工具。10.寡核苷酸，其用作探针，用于检测通过扩增位于检测流感A病毒基因组的H5基因中的靶序列所产生的扩增的核酸序列，所述扩增通过利用权利要求2和4-8之一的寡核苷酸对进行，所述检测探针的长度为10-50个核苷酸并包含至少一个源自以下序列的10个连续核苷酸的片段SEQIDNo.7:ACACCAAGTGTCAAACTCCAAT，或其互补序列，所述序列包含至少一种标记工具。11.寡核苷酸，其用作探针，用于检测通过扩增位于流感A病毒基因组的N1基因中的靶序列所产生的扩增的核酸序列，所述扩增通过利用权利要求3-8之一的寡核苷酸对进行，所述检测探针的长度为10-50个核苷酸并包含至少一个源自以下序列的10个连续核苷酸的片段SEQIDNo.8:GCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGA，或其互补序列，所述序列包含至少一种标记工具。12.权利要求9-ll定义的检测探针，其特征在于其由分子探针组成。13.权利要求9-12之一定义的检测探针，其特征在于其由分子探针组成，优选由以下序列组成SEQID9:[6-FAM]-cgatcgaCACCAAGTGTCAAACTCCAAtcgatcg-[DabSyl]，用于检测H5基因，SEQID10:[6-FAM]-cgatcgGCGAAATCACATGTGTGTGCAGGGAcgatcg-[DabSyl]，用于检测N1基因。14.权利要求l-8之一的一或两对寡核苷酸的用途，其用于扩增核酸的反应中或作为探针用于检测可疑存在于生物样品中的流感A病毒的基因组。15.检测可能存在于样品中的流感A病毒的核酸的方法，其中对所述样品进行利用权利要求l-8之一的寡核苷酸对扩增核酸的反应，所述反应在存在所述扩增所需的扩增剂的条件下进行，并且检测目的扩增子的存在。16.权利要求15的方法，其特征在于所用的扩增反应为RT-PCR。17.权利要求15的方法，其特征在于所用的扩增反应是转录扩增技术。18.权利要求17的方法，其特征在于所用的扩增反应是NASBA技术。19.扩增可能存在于样品中的流感A病毒的H5和N1两基因的方法，包括以下步骤-在存在以下物质的条件下在扩增缓冲液中保温样品，两种扩增引物，每一种引物的长度均为10-50个核苷酸，一种还包含启动子序列，另一种与结合有启动子序列的引物的极性相反，从而分别与位于流感A病毒的H5基因中的目的区域的上游和下游杂交，，两种扩增引物，每一种引物的长度均为10-50个核苷酸，一种还包含启动子序列，另一种与结合有启动子序列的引物的极性相反，从而分别与位于流感A病毒的N1基因中的目的区域的上游和下游杂交，-将以下反应剂加入样品，具有RNA-依赖性DNA聚合酶活性的酶，，具有DNA-依赖性DNA聚合酶活性的酶，，具有RNaseH活性的酶，，具有DNA-依赖性RNA聚合酶活性的酶，以及-在适宜的条件下维持由此产生的反应混合物足以使得扩增发生的一段时间。20.检测可能存在于样品中的流感A病毒的H5和N1基因的试剂盒，包含-权利要求l-S之一所述的两对寡核苷酸，-权利要求9-13之一所述的两种寡核苷酸，其为标记的或可被标记，并且具有基本上与扩增的核酸序列的至少一部分互补的核酸序列，-进行扩增反应所需的反应剂。21.权利要求20的试剂盒，其中进行扩增反应所需的反应剂是NASBA扩增用反应剂。全文摘要本发明涉及两对寡核苷酸，其用于扩增分别位于流感A病毒基因组的H5和N1基因中的两个靶序列，所述寡核苷酸的长度为10-50个核苷酸，并且包括源自以下序列的至少10个连续核苷酸的片段SEQIDNo.1TGTATGTTGTGGAATGGCA，SEQIDNo.2GCCGAATGATGCCATCAA，SEQIDNo.3CGTGGATTGTCTCCGAAA，和SEQIDNo.4GGAATGCTCCTGTTATCCTGA，或其互补序列。本发明还涉及用于检测扩增子的寡核苷酸，所有上述序列的用途，检测流感A病毒的H5和N1基因的方法。本发明具体可用于诊断领域。文档编号C12Q1/70GK101313079SQ200680043972公开日2008年11月26日申请日期2006年11月23日优先权日2005年11月25日发明者A·勒弗夫尔,G·韦尔内,J-N·特莱斯申请人:生物梅里埃公司