淀粉吸附区域及其用途的制作方法

专利名称：：淀粉吸附区域及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及淀粉吸附区域，重组蛋白质及其组合物。本发明还涉及分离包含淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法。
背景技术：
：利用微生物系统表达蛋白质已成为制造高价、重要医药蛋白质的主要来源，而如何纯化和回收重组蛋白质则为发酵工艺设计上的重要考虑。传统的蛋白质纯化方法可用以纯化单一产物，改良的方法，更进一步包括使用重组蛋白质。重组蛋白质可通过亲和性管柱层析法加以纯化，所欲纯化之重组蛋白质之成份可通过其与亲和性基质上结合的多肽形成共价性链接而被纯化。某些系统通过亲和性管柱层析的原理来分离蛋白质。美国专利第5643758号揭示一种包含麦芽糖结合蛋白质(MBP)的系统。将克隆基因插入pMAL载体内可产生MBP的malE基因下游。将此载体转载至宿主细胞，在宿主细胞中表达该重组蛋白质。将细胞溶离物或培养基分层载入含有亲和性基质-直链淀粉的管柱中并洗涤数次，再使用大量的麦芽糖溶离重组蛋白质。美国专利第5202247号说明一种包含纤维素吸附区域的系统。纤维素管柱可用于纯化含有纤维素吸附区域的重组蛋白质。将细胞溶离物或培养基分层载入该管柱并加以洗涤。纤维素吸附区域和纤维素间的交互作用来自于彼此间在中性pH值下的疏水性交互作用所产生。一般使用低极性溶液，如乙二醇，进行溶离，之后再以透析和过滤移除低极性溶剂。此等现行的蛋白质纯化系统的缺点包括其纯化过程不方便且费力、用于纯化的管柱昂贵。此等蛋白质纯化系统的限制包括不能在某些条件之下纯化重组蛋白质，例如含EDTA的样本、使用的蛋白质巻标比标的蛋白质大，而本发明的蛋白质标签较现有的蛋白质标签小。
发明内容本发明涉及一种淀粉吸附区域(starchbindingdomain),其具有如下显示于SEQIDNos.1、2或3的氨基酸序列；SEGIDNo.1:ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVVYADGSDNWNNNGNIIAASFSGPISGSNYEYWTFSASVKGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS;SEQIDNo.2:ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVIYADGSDNWNNNGNTIAASYSAPISGSNYEYWTFSASINGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS;或SEQIDNo.3:ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVIYANGSDNWNNNGNTIAASYSAPISGSNYEYWTFSASINGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS;或其SEQIDNO.l、2或3的等位变体及衍生物，其具有淀粉吸附能力者。本发明中的淀粉吸附区域可取得自同类的碳水化合物结合模块(CarbohydrateBindingModule),如CBM20或CBM21。本发明一实施例中，淀粉吸附区域可取自CBM21葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附区域。本发明较佳的实施例中，淀粉吸附区域可取自根霉属(i^/加;myspp.)。本发明的更佳实施例中，淀粉吸附区域可取自根霉属(^/^op^spp.)的葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附区域。本发明的淀粉吸附区域包含配体结合位置(或碳水化合物结合位置)，该部位位于芳香性基团上，而该芳香性基团则位于用以和碳水化合物结合的氨基酸序列上第32、47、58、67、83、93和94残基的酪氨酸或/及色氨酸上。本发明的较佳实施例中，活性位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基58酪氨酸、残基83酪氨酸、残基93酪氨酸和残基94酪氨酸。本发明还涉及一种重组蛋白质，其包含下列序列(SBD)m-Ln-X-L，p-(SBD)qSBD指淀粉吸附区域，L指连接子，L'指连接子，X指目标蛋白质或多胜肽，m为0、l或2，n为0或l，p为0或l，q为0、1或2，其中m和q不会同时为0。本发明的较佳实施例中，该连接子为ioLK(朋izo;^GA的连接子)；PH:六个组氨酸；PK:八个赖氨酸；PPT:—个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4];或58L:在载体pET39b(+)上介于限制酶切位SpeI及NcoI间的区域。本发明亦关于一种复合物，其包含下列序列(SBD)m誦X画(SBD)qSBD指淀粉吸附区域，X指碳水化合物，m为0、l或2，q为0、1或2，其中淀粉吸附区域利用不同部位同时和碳水化合物结合。本发明的较佳实施例中，其中X为碳水化合物，其结构包含cc-l，4-葡萄糖键接或oc-l，6-葡萄糖键接。本发明的更佳实施例中，其碳水化合物为寡醣或环状碳水化合物。其中该淀粉吸附区域和碳水化合物系用配体结合位置(碳水化合物结合位置)或构型方式结合。该淀粉吸附区域包含多个单位系依据碳水化合物的大小决定。本发明进一步关于一种用以纯化如前所述包含淀粉吸附区域重组蛋白质的方法，其包含a.将含有重组蛋白质d生物液体直接施加于亲和性基质；和b.调整温度、pH值、离子强度、含糖浓度或酵素组成以溶离重组蛋白质。本方法中的亲和性基质在其任意部分结构，包含主链、侧链或经修饰残基的内包含下式-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>X指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键接为cc-l,4-键接或a-l,6-键接，且n为1或大于1。本发明的较佳实施例中，其该亲和性基质为淀粉，温度改变范围指37°C或更高，且步骤a于0~25。C下操作。图1显示SBD-L-eGFP及eGFP-L-SBD重组蛋白质的载体；图2显示以聚丙烯胺胶体电泳分析于大肠杆菌表达的SBD-PK-eGFP及SBD-PPT-eGFP融合蛋白质的纯化结果；图3显示以聚丙烯胺胶体电泳分析于大肠杆菌表达的eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD融合蛋白质的纯化结果；图4显示以聚丙烯胺胶体电泳分析纯化后的融合蛋白质；图5显示以改良的淀粉层析管柱法纯化SBD-PH-eGFP的结果；图6显示pH值对于SBD-PH-eGFP和玉米淀粉吸附能力的效用；图7显示温度对于融合蛋白质和玉米淀粉吸附能力的效用。(A)SBD位于重组蛋白质的N端；(B)SBD位于重组蛋白质的C端；图8显示7oCBM21的NMR光谱。爿7oCBM21在'H-"NHSQC光谱中的指认酰胺共振图。除了和Y12重叠的Q10及和E87重叠的Y86之外，所有的骨架酰胺峰皆以解出。&残基F21到Y26在HNCACB光谱中的实例指认条带。Ox为正相位峰(黑色)，Cp为负相位峰(灰色)。C及D:位于N-折板的反向平行之二及结构及其突出物及C-折板的环状物。粗箭头为NOEs;粗双箭头为条带间的Ha-HaNOEs;细双箭头为条带间的酰胺质子及酰胺质子NOEs;细箭头为条带间的Ha至酰胺质子NOEs;虚线为条带间的氢键。环状区域中的NOEs未标示；图9显示ioCBM21在溶液中的结构。AWoCBM21组合的立体视图。7oCBM21之前示图以N端环状物在上、C端环状物在下。S及C显示ioCBM21的N-折板端及C-折板端的p-三明治折迭图。D及￡为S及C的表面图示；图IO显示SBD的第一类及第二类拓朴结构。红、橙、黄、绿、蓝、紫分别代表在ioCBM21上的八个卩-条带及其在其它SBD中相对应的条带。以紫色标示的条带七及八会和条带六形成氢键。在7VCBM34I的N端前二个(3-条带间额外的环状物为粉红色。ASBDs的一级结构。其二级结构依前述原则标示。A第一类及第二类拓朴结构的结构概视图。条带的顺序如A所述并标示于第二类拓朴结构的上端。C:第一类(如爿"CBM20)及第二类(如ioCBM21)拓朴结构的三度空间构造；图11显示ioCBM21的配体结合和配体嵌合的研究。A以配体(3-环状糊精选汰前(黑色峰)及选汰后(红色峰)的ioCBM21iH-15N异核单量子关系光谱(HSQCspectrum),具较大化学位移扰动的高峰以绿色箭头标示。A权重平均化学位移扰动依残基数目而改变。黑色、浅黄色、及红色分别代表麦芽三糖、麦芽七糖、p-环状糊精。星号代表位于poly-Nloop中其化学位移扰动改变高于0.1的天冬酰氨酸残基(aspamgine，N)。扰动临界值定为高于0.1及0.06-0.1(横截面)。C:显示位于ioCBM21结构上依选汰而改变之残基。化学位移改变高于0.06的残基列为显著影响者，以绿色标示；化学位移改变高于0.1者(因此假定其在配体结合时扮演重要角色)，以柱状结构标示。"显示二个p-环状糊精分子与ioCBM21的嵌合。￡及F显示cyclomaltohexaicosaose(v-直链淀粉)与ioCBM21的嵌合。￡、F分别为ioCBM21与v-直链淀粉嵌合的结构概视图及表面图。在E中蛋白质条带为黄色，v-直链淀粉以球-棍模式显示。在F中蛋白质为黄色，v-直链淀粉为白色；图12显示7oGACBM21-pCD复合物的结晶；图13显示ioGACBM21+CD的复合物。具体实施例方式以下实施例为非限制性的，仅作为本发明各个方面及特征的典型实微生物菌株及质体以大肠杆菌五"/zen'c/^co//Top10F'(F'(praAB/aclq,focZAM15,Tn70(TetR)}wcrA,A(m/r-fefiRMS-wcrBC),80/acZAM15,A/acX74,deoR,尸ecAl,araD139,A("ra-/ew)7697,伊/U,ga/K,，L(StrR)ewt/Al,ww/G人-)做为载体构建及DNA操作的寄主细胞。以大肠杆菌^&c/zeWc/^co//BL21-CodonPlus(DE3)(Stratagene,USA)(BF_om/r/w必(rB—mB—)dcm+Tefga/人(DE3)e/WJHte[orgt/;ra丄Camr][^^/z7e:r/w『Strep/Specr])做为生产融合蛋白质的之寄主细胞。载体pET-23a(+)(Novagen,USA)中的T7启动子做为在大肠杆菌中表现融合蛋白质及序列分析之用。细菌培养将大肠杆菌培养于含有50吗/ml氨苄西林(ampicillin)的Luria-Bertani(LB)培养基[1。/。(w/v)tryptone,2%(w/v)酵母菌萃取物，2%(w/v)氯化钠，pH7.5]中，另以含有1.5%洋菜及50pg/ml氨苄西林的固态LB培养基于37。C筛选转形菌株。实施例l(A)质粒的构建重组载体的构建如图1所示。eGFP、连接子及SBD片段皆以设计的引物通过PCR扩增产生，其引物序列如表l所示。连接子序列可由以下五种候选序列取代(ioLK:i^izc^MGA的连接子、PH:六个组氨酸、PK:八个赖氨酸、PPT:—个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4]及58L:在载体pET39b(+)上介于限制酶切位and脸ol间的区域)。PCR反应的过程如下混合10ng模板，0.5pi各引物(10pM)，5|il反应缓冲液(10x)，5|il脱氧核苷酸(2.5mM)，0.8ExTaqDNA聚合酶(TakaraMinisBio,Japan,5U/|ul),加水至50终体积。此混合物依下列循环反应l循环的95。C/5分钟—30循环的[95。C/30秒(高温变性)，53°C/30秒(引物黏合)，72°C/20秒至2分钟(聚合反应)]—禾[]l循环的72。C/5分钟。表l合成寡核苷酸引物l物名称合成寡核苷酸引物序列LK-F-历威Ilk-r-争i58L-F-倫郝58l-R-mmsbd-F-争isbd-F-她iSBD-R-勘I;'-TCCCAAGCTTTCCAAGCCCACTACTACT;，-ACGGGGTACCGTTACCAGTTGGGAATGA-CCCAAGCTTACTAGTGGTTCTGGTCATCAC;，-AACATATGCATGGTTGAGGAGAAGCCCG;，-TTCGGGGTACCGCAAGTATTCCTAGCA5，-GGGAATTCCATATGGCAAGTATTCCTA;'-TCCGCTCGAGTCATGTAGATACTTGGPK-F-历威I5，-TGCGCCCAAGCTTAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGCAAGTATTCCTAGCAGTGCTTCPK-R-争I5，-CCGGGGTACCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTTCTAGATACTTGGTAATTGGCPH-F-历"郝5，-TCCCMeOUCACCACCACCACCACCACGCAAGTATTCCTAGCAGTGCTTPH-R-争I5，-ACGGfi2IM￡GTGGTGGTGGTGGTGGTGTGTAGATACTTGGTAATTGGCPPT-F-历威I5，-TCCCAMeiIACTCCGACTCCGACTCCGACTCCGACTGCAAGTATTCCTAGCAGTGCTTCPPT-R却"I5，-TCGG^I4e￡AGTCGGAGTCGGAGTCGGAGTCGGAGTTGTAGATACTTGGTAATTGGCSBD-F-7VcM5，-GGGAATTCCATATGGCAAGTATTCCTAmFT-F,"i5，—tttcggGGTACCCAGAGTGAGCCGGAGGFP-F-五coRI5，-GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGFP陽F-争I5，-TATCGGeSmeeATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTGFP-R-幼威I5'-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTC限制酶切位以底线标示。将前一步骤取得的片段与pGEM-TEasy载体(Promega，USA)进行接合反应。混合100ng嵌入DNA片段，1W载体，1pi接合酶缓冲液[66mMTris-HCl(pH7.6)，6.6mMMgCl2，10mMDTT，0,1mMATP]及1|^1T4接合酶(TakaraMimsBio，Japan),加双蒸水至10pl终体积，置于16°C反应16小时。将接合反应产物转载至大肠杆菌胜任细胞，具有T-载体及所欲克隆序列的转载菌株可通过蓝白菌落筛选得到。大量培养克隆后的菌落，以Gewe-Sp/"MiniprepPurificationKit(Protech，Taiwan)纯化质粒，纯化后的质粒以特定限制酶裁剪后，以P/。洋菜胶体电泳/lxTAE缓冲液(40mMTrisBase,40mM醋酸和1mMEDTA)于100V下分析处理后的DNA片段大小。随后以EtBr(ethidiumbromide,0.5mg/ml)溶液进行胶体染色10分钟，DNA片段即可显示于UV灯之下。将欲得的片段以Gel/PCRDNAfragmentextractionkit(GeneaidBiotech,Taiwan)纯化后可供后续实验使用。在进行接合反应之前，载体pET-23a(+)先通过特定限制酶裁剪。为了构建SBD于5'端，载体先以7WM及EcoRI裁剪，含有SBD及连接子之DNA片段再以及iQwI裁剪，含有eGFP之DNA片段则以《戶I及五coRI裁剪。另一方面，为了构建SBD于3，端，载体先以EcoRIan(HoI裁剪，含有60及连接子的0忖八片段则以&0111及///^/111裁剪，而含有SBD及连接子的DNA片段以历"dl1及lol裁剪。将接合反应产物转载至大肠杆菌co//Topl0F'胜任细胞进行DNA操作及序列确认，之后再转载至大肠杆菌Eco//BL21-CodonPlus(DE3)。(B)胜任细胞的制备及大肠杆菌转载以Mandel及Higa于1970年研发的氯化钙转载技术用于制备大肠杆菌胜任细胞[五.co/ZTopl0F，及BL21-CodonPlus(DE3)]。将100分装好的冷冻大肠杆菌细胞接种于含有50昭/ml四环素(tetracycline)的5mlLB培养基中，于37。C培养16小时，再取100pl过夜培养的细胞，培养于含有四环素的5ml新鲜LB培养基，于37°C培养，待OD,达到0.5~0.6。的后以16,000xg于4。C离心5分钟以收集细胞，再以10ml冰氯化钙溶液(100mM)重新悬浮离心后的细胞。将重新悬浮的细胞置于冰水浴中30分钟后再离心，离心后以500pl含有15%甘油的冰氯化钙溶液小心缓慢的重新悬浮沉淀的细胞约3小时，以完成胜任细胞的制备。大肠杆菌的转载是将100|il分装的胜任细胞和10^接合反应产物混合，静置于冰上30分钟，在热休克步骤中以42°C处理此混合物90秒，再加入500piLB培养基，于37。C培养30分钟。最后于25。C以16,000xg离心细胞10分钟，并将其涂布于含有50)ig/ml安比西林的LB平板培养基，于37。C培养16小时。(C)小量制备质粒于37°C，将重组大肠杆菌培养于LB培养基中16小时，再于4°C以16,000xg离心5分钟以收集细胞。质粒DNA以Gwe-*/"MiniprepPurificationKit纯化之。将离心后的菌体重新悬浮于200pi溶液I(50mMEDTA,25mMTrispH8.0,50mMglucose)中，随后加入200pi溶液II(0.2NNaOH，1。/。SDS)于微量离心管中，将离心管缓慢的上下倒置混合至溶液澄清为止，再加入200[il溶液III(KOAc,11.5%冰醋酸，pH4.8)于管中，并将管子上下倒置混合5-6次。不溶物可于4。C以16,000离心5分钟。将上清液直接移至离心管柱，于16，000xg离心30秒。将离心后的液体弃置，加入700^11清洗溶液(70%酒精)并以16,000xg离心l分钟，弃置离心后的液体，再以16,000xg于4°C离心3分钟以移去残余的酒精。将离心管柱置于新的微量离心管上，加入50-100^无菌水，最后于4°C，以16,000离心5分钟以溶离DNA，并储存于-20。C。(D)原位聚合酶链式反应(/"w'似PCR)自平板培养基上挑选数个大肠杆菌转载菌落作为PCR模板。混合转载菌落模板，0.3pl的10pM正向引物，0.3pl的10pM反向引物，2^1的2.5mM脱氧核苷酸(dGTP，dATP，dCTPanddTTP)，2|ul的lOx反应缓冲液，0.3pi的5U/|ilVio%《DNA聚合酶(Viogene,USA)及15.1|il双蒸水，以PerkinElmerGeneAmpPCRsystem2400进行反应。加热循环反应条件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(E)DNA测序以BigDyeTerminatorV3.1CycleS叫uencingKit(ABI,USA)进行定序反应。反应物混合后进行下列循环1循环的96。C/1分钟—25循环的[96°C/30秒，50。C/30秒，60°C/2分钟]。将产物和2^3M醋酸钠，pH4.6，50pi95%酒精及10fil双蒸水混合，置于25°C/15分钟以沉淀聚合反应的产物。于4。C以16,000xg离心20分钟，移除上层液，再加入180(il70%酒精。混合均匀后，以16,000xg于4。C离心5分钟，再完全移除上清液。离心管中聚合反应的DNA产物以真空离心5分钟干燥的，加入10|ilHi-Diformamide以溶解产物，最后以ABIPRISM3100GeneticAnalyzer进行DNA自动测序。(F)利用大肠杆菌表达融合蛋白以大肠杆菌co//BL21-CodonPlus(DE3)表达融合蛋白。含有融合蛋白基因片段的质粒转载至大肠杆菌五.co/z'BL21-CodonPh^(DE3)胜任细胞中，以含有50吗/ml安比西林的LB平板培养基于37°C培养16小时进行筛选。将单一菌落接种于含有50pg/ml氨苄西林的1mlLB培养基，于37°C培养，待OD,达到0.4-0.6。再加入终浓度ImM异丙基-P-D-硫化半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质产生，于20。C培养16小时，之后收集细胞并重新悬浮于0.1ml结合缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)，再以超音波震荡器(Misonix,USA)将细胞打破，可溶及不可溶的融合蛋白可于4。C以16，000xg离心10min分离之。(G)聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)依据Laemmli方法[25]，以lmm平板胶体，包含分离胶体(pH8.8)及焦集胶体(pH6.8)，进行不连续聚丙酰胺胶体电泳。样品以样品缓冲液[100mMTris-HC1(pH6.8),200mMDTT,4%SDS,0.2%溴酚蓝，及20%甘油]于99。C处理10分钟，12%(w/v)聚丙酰胺胶体电泳以ElectricalSupplyMP-250,于25mA分析60分钟。以考马斯亮蓝溶液(2.5%考马斯亮蓝R-250，45%甲醇，及10°/。醋酸)漂染电泳分析完的胶片15分钟，将胶片置于退染缓冲液I(40%甲醇及10%醋酸:>中退染1小时，再置于退染缓冲液11(7%甲醇及5%醋酸)中，移除剩下的染剂。蛋白质分子量标志(Fermentas,USA)亦于同时分析之。(H)蛋白质浓度定量样品的蛋白质浓度以二辛可宁酸试剂套组(BCAAssayKit,Pierce,USA)定量的，以牛血清蛋白(bovineserumalbumin)为标准品。(I)以直链淀粉树脂层析法纯化融合蛋白将直链淀粉树脂倒入2.5x10公分管柱中，将离心后含有融合蛋白的大肠杆菌细胞以结合缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)重新悬浮，再以超音波震荡。于4。C以16,000xg离心15分钟后，保留上清液以进行层析法。将管柱以8倍管柱体积的结合缓冲液清洗后，将澄清的细胞溶出物以流速lml/min注入管柱中。将管柱以12倍管柱体积的结合缓冲液清洗后，再将融合蛋白以溶离缓冲液(IOmM甘氨酸/NaOH,pH1l.O)析出。(J)结果为了增加以SBD为亲和性标签的应用潜力及研发不同的多胜肽连接子对于蛋白质表达及纯化的效用，将eGFP及SBD与不同连接子如58L、7oLK、PH、PK及PPT构建重组克隆，如图1所示。十个融合蛋白中，其中五个融合蛋白的SBD位于#端，其余则位于C端。位于端的SBD，于大肠杆菌中可大量表达可溶的SBD-58L-eGFP、SBD-AoLK-eGFP及SBD-PH-eGFP，而SBD-PK-eGFP及SBD-PPT-eGFP则以内涵颗粒方式表达。当SBD位于C端时，eGFP-58L-SBD、eGFP-ioLK-SBD及eGFP-PH-SBD亦可于可溶性分层中大量表达，但eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD的表达亦会导致内涵颗粒产生。大量表达不可溶的SBD-PK隱eGFP及SBD漏PPT-eGFP与eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD，分别如图2、图3所示。大量表达的SBD-PK-eGFP、SBD-PPT-eGFP、eGFP-PK-SBD及eGFP-PPT-SBD的分子量，以12%聚丙酰胺凝胶电泳分析后，粗估为40kDa。六个融合蛋白(SBD-58L-eGFP、SBD-7oLK-eGFP、SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-ioLK-SBD及eGFP-PH-SBD)于大肠杆菌[五.co//BL21-CodonPlus(DE3)]中于20°C诱导16小时，而成功的表达可溶性融合蛋白。细胞以离心方式收集，重新悬浮于结合缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)以超声波震荡，利用离心方式收集含有大量表达的可溶性融合蛋白上层液，再注入充填直链淀粉树脂的亲合性层析管柱中，以溶离缓冲液(IOmMglycine/NaOH，pHll.O)自管柱中溶离纯化融合蛋白。纯化的重组蛋白以12%聚丙酰胺胶体电泳分析，如图4所示。从1L重组细胞培养液中，约可取得100-150mg的纯化融合蛋白，以进行下列分析。实施例2(A)pH值对于吸附能力的效用在测试pH值对于吸附能力效用的实验中，将纯化的融合蛋白(16|_iM)于25。C搅动入含不同pH值，含终浓度O.lmg/ml的玉米淀粉缓冲液中(Sigma-Aldrich,EC232-679-6,USA)约1小时。结合测试在pH2.0-11.0的缓冲液[100mM甘氨酸/盐酸(pH2-3)，100mM醋酸钠/醋酸(pH4-5)，100mMNa2HP04/NaH2P04(pH6-7)，100mMTris/HCl(pH8)，100mM甘氨酸/氢氧化钠(pH9-ll)]中进行。以二辛可宁酸试剂套组(BCAassay)测定于上层液中未吸附的融合蛋白于吸附前及吸附后的浓度。100%融合蛋白的相对吸附能力以pH5.0时的测定值为基准。(B)温度对于吸附能力的效用在测试温度对于淀粉吸附能力效用的实验中，将纯化的融合蛋白(16pM斤4。C、25。C及37。C搅动入含有终浓度0.1mg/ml玉米淀粉的吸附缓冲液(50mMNaOAc，pH5.5)约3小时。以二辛可宁酸试剂套组(BCAassay)测定于上层液中未吸附的融合蛋白于吸附前及吸附后的浓度。100%融合蛋白的相对吸附能力以4。C的测定值为基准。(C)以搅拌法纯化搅拌纯化法是沿用纯化尸化Mt/o,"os調y/ot/era附osaisoamylase(Fang:T.Y.etal.,(1994)￡"2^扬'cra6Tec/z16，247-252)的方法。将含有融合蛋白的大肠杆菌的细胞悬浮于吸附缓冲液(50mMNaOAc，pH5.5)中，再以超声波震荡。之后于4。C以16,000xg离心15分钟，舍弃不溶的沉淀物。以lml溶离缓冲液(10mM甘氨酸/氢氧化钠，pH1l.O)清洗50mg玉米淀粉(Sigma,EC232-679-6)三次，再以1ml双蒸水清洗。之后以16,000xg离心5分钟去除双蒸水。含有融合蛋白的1ml上层液和50mg淀粉混合后，于25。C连续搅拌3小时。将上层液于4。C以16,000xg离心10分钟去除，淀粉沉淀以1ml吸附缓冲液清洗三次，再以250pl溶离缓冲液溶离四次，保留清洗及溶离的分层液供聚丙烯胺凝胶电泳及其它分析。(D)以淀粉管柱层析法纯化此纯化方式沿用含有粗淀粉的漏斗式玻璃过滤器以纯化户"^/omo"osam_y/<%fenw7asaisoamylase(Lin，L.L.etal.,(1994)丄e〃^(/p/A//cro6/o/19,383-385)的方法。将含有融合蛋白的大肠杆菌细胞悬浮于吸附缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)中，再以超声波震荡。之后于4°C以16,000xg离心15分钟，舍弃不溶的沉淀物。将200mg的玉米淀粉(Sigma)以2ml溶离缓冲液(10mM甘氨酸/氢氧化钠,pH1l.O)清洗三次，再以2ml双蒸水清洗。淀粉沉淀以2ml吸附缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)清洗三次，再悬浮于吸附缓冲液中。将淀粉溶液填充于5-ml可抛弃式针筒中，其中针头已被移除并将滤纸置于底部以防止淀粉流失。超声波震荡后，收集3ml细胞可溶分层液，加入淀粉管柱中，以地心引力带动液体流动。以6ml吸附缓冲液洗去非专一性吸附蛋白，再以3ml溶离缓冲液溶离融合蛋白。清洗及溶离步骤可以位于底部的另一的针筒吸取以加速的。保留清洗及溶离的分层液供聚丙烯胺胶体电泳及其它分析。(E)以改良的淀粉管柱层析法纯化此淀粉管柱层析法结合流体化床吸附法(fluidizedbedadsorption,Hicketier,M.andBuchholz，K.(2002)J飾tec/wo/93,253-268;Roy，I.etal.，(2000)尸rate/"五x;^P鹏/20，162-168)并改良之。将含有融合蛋白的大肠杆菌细胞悬浮于吸附缓冲液(50mMNaOAc，pH5.5)中，再以超声波震荡。的后于4。C以16,000xg离心15分钟，舍弃不溶的沉淀物。以3ml溶离缓冲液(IOmMglycine/NaOH,pH1l.O)清洗600mg的玉米淀粉(Sigma)三次，再以双蒸水清洗三次。淀粉沉淀以3ml吸附缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)清洗三次，最后悬浮于吸附缓冲液中。将淀粉溶液充填于5-ml可抛弃式针筒中，其中针头已被移除，并将滤纸置于底部以防止淀粉流失。此一改良的淀粉管柱设计如图5所示。超声波震荡后的细胞可溶分层液以蠕动式帮浦P1(AmershamPharmaciaBiotech,USA)依1ml/min流速强迫注入淀粉管柱的底部，以6ml吸附缓冲液洗去非专一性吸附蛋白，再以溶离缓冲液溶离融合蛋白。保留清洗及溶离的分层液供聚丙烯胺凝胶电泳及其它分析。(F)结果pH值及温度对于粗淀粉吸附的效用SBD本身于pH5.0-6.0时即对粗淀粉具有良好的吸附能力，其吸附作用在低于pH5.0或高于pH6.0时则会被破坏。因此选择融合蛋白SBD-PH-eGFP，在25°C时，于不同pH值下测试吸附反应，其范围为pH2.0-11.0，以确认含有SBD的融合蛋白，于不同pH值的下仍保有吸附能力。如图6所示，SBD-PH-eGFP与玉米淀粉的最佳吸附能力产生于pH4.0-5.0，最弱吸附能力产生于pH11.0时。此相对吸附能力是以pH5.0时的吸附能力为100%来计算。融合蛋白与粗淀粉于pH4.0-8.0时的吸附能力十分良好，而当pH值低于4或高于8时，吸附能力则快速下降。除此之外，于不同温度下，测定纯化的融合蛋白于吸附缓冲液(50mMNaOAc,pH5.5)中的吸附能力，如图7所示。其对于玉米淀粉的最佳吸附效用温度为4。C;于25°C时下列融合蛋白SBD-58L-eGFP、SBD-ioLK隱eGFP、SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-AoLK-SBD及eGFP-PH-SBD对于玉米淀粉相对的吸附能力分别降至92。/。、94°/。、95%、88%、81%及74%。吸附能力于37。C时更进一歩被干扰。于37°C时下列融合蛋白SBD-58L画eGFP、SBD-7oLK-eGFP、SBD國PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-ioLK-SBD及eGFP-PH-SBD对于玉米淀粉相对的吸附能力分别降至14%、37%、9%、21%、16%及8%。因此，为了达成玉米淀粉及融合蛋白的高效吸附能力，温度范围必须介于4°C及25°C;同时又考虑到实验系统降温的成本，因此选用25。C进行后续的实验。实施例3(A)以NMR光谱决定结构NMR资料以BrukerAvance600MHz或800MHz光谱仪分析之。为了测定结构，将1mMioCBM21(未标记、"N-标记或13C,"N-双标记)溶于10mM醋酸钠，pH4.5，以于25。C进行NMR实验。蛋白质浓度以二辛可宁酸试剂套组(Bio-RadProteinAssay)定量。骨架归属(assignment)乃以HNCA，丽(CO)CA、丽CACB、CBCA(CO)NH、HNCO及HN(CA)CO实验进行(Cavanagh,J.etal"(1996)尸r她/w7VMKspe"冊cojcy，AcademicPressInc.)。由于ioCBM21含有相对较高比例的芳香族残基，其芳香族支链的归属由HBCBCGCDHD及HBCBCGCDCEHE实验协助完成(Yamazaki,T.etal.,(1993)/115,11054-11055)。其余原子的归属则由homonucleartwo-dimensionalnuclearOverhauserenhancementspectroscopy(NOESY)及15Nheteronuclearsingle-quantumcoherence-NOESY(HSQC-NOESY)通过化学键相关光谱(through-bondcorrelationspectra)协助完成。禾!j用Homonucleardoublequantum—filteredcorrelatedspectroscopy(DQF-COSY)，homonucleartotalcorrelationspectroscopy(TOCSY)及15NHSQC-TOCSY以取得化学键相关光谱(through-bondcorrelations)。其混合期如下TOCSY光谱为90ms，NOESY光谱为50，100或150ms。所有二维光谱皆以512tl增量记录之，而2048t2复合物的资料取样点则以TopSpin1.3(Bruker)处理。NOESY光谱产生的距离限制以100-ms混合期记录的。以二维15NHSQC光谱记录于25°C溶解于99%D2036小时的冷冻干燥/oCBM21，以鉴别被保护的酰胺质子。i^CBM21在冷冻干燥后无法快速溶解，因此要加入过量的D20以溶解蛋白质。过量的D20以冷冻干燥去除，以产生500卞1样品。氢键限制得自于HSQC酰胺质子保护作用，由周围NOE信号及HNCOHB(through-hydrogenbondcoherence)(Cordier，F.，andGrzesiek,S.(1999)J爿m.CTzem.iSoc.121，1601-1602)确认的。双平面角限制以TALOS程序(Comilescu,G.etal.，(1999)J历owo/7VMin3,289-302)伴随着N、HA、CA、CB及C原子的化学位移所取得。以Sodium2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulphonate(DSS)做为质子化学位移的内部基准，异核化学位移则以设定的？SN/H=0.101329118及y"C/^H=0.251449530为基准。ioCBM21化学位移以编号BMRB7083存入BiologicalMagneticResonanceDataBank(BMRB)。(B)结构计算及分析部分归属峰列表及化学位移表以SPARKY程序(Goddard,T.D.，andKneller，D.G.(1999))的手动归属法完成。其波峰强度依设定的peakfittingprotocol,依据Lorentzianlineshapes完成。ioCBM21结构计算以CNSU(Bmnger，A.T.etal"(1998)^ctoOj"D54，905-921)及ARIA2.0(Nilges,M,etal.，(1997)/Mo/.说o/.269,408-422)依torsionangledynamics(TAD)及standardsimulatedannealingprotocols进行(Nilges，M.etal"(1988)丄故239,129-136)。此等计算完成后，利用OPLS力场进行explicitwaterrefinement(Linge，J.P.etal.，(2003)50，496-506)。自200个结构中，选取15个具最低能量结构者做进一步的分析。以PROCHECK-nmr(Laskowski，R.A.etal.，(1993)J!26,283-291)分析其质量。组合结构的原子坐标以编号(accessionID)2DJM存入ProteinDataBank(PDB)。(C)化学位移扰动为了了解ioCBM21的配体结合残基及交互作用，利用麦芽三糖、麦芽七糖及(3-环状糊精研究化学位移扰动。制备100-mM麦芽三糖及麦芽七糖为标准液，而制备20-mM卩-环状糊精为标准液，因其溶解度低。将7oCBM21(1mM)以各单独配体选汰，利用二维"NHSQC实验以监控其交互作用。套用下列公式以计算iH及"N的加权平均化学位移改变AS^=[(A3画)2+(0.17AS15N)2]1/2(Saitoh,T.etal.,(2006)/編Ozem281，10482-10488》(D)结构比较用以比较SBD结构的CBMs来自于A"/gerglucoamylase(^"CBM20)(Sorimachi,K.etal.,(1996)/Mo/飾/259，970-987)，T7簡維"wo亭^VM/gaWsR-47a陽amylaseI(7VCBM34I)(Abe,A.etal.,(2004)/Mo/所o/335,811-822)，S(3"'〃1^Zza/。(iMram1maltohexaose-formingamylase(朋CBM25and5ZzCBM26)(Bomston,A.B.etal"(2006)/历o/C/zem281,587-598)及A7血/e〃a戸e訓om'aepulManase(^pCBM41)(Mikami,B.etal.,(2006)/M/说o/359,690-707)。结构重叠分析以网站服务器"FAST"进行(Zhu,J.，andWeng，Z.(2005)尸rafe/ra58，618-627)。(E)嵌合模拟利用AutoDock3.05(Morris,GM.etal.，(1998)JCowpMto"o"a/Ozem^o;19,1639-1662)仿真淀粉分子的于结合点的结合模式。Cyclomaltohexaicosaose的三维结构由PDB(code:1C58)下载。在不同模拟中，碳水化合物分子嵌合于不同结合点。亲合性网格设定为90x90x90，以程序autogrid计算，于0.375A间隔下，依三维置中于结合点(Morris，G.M.etal.,(1998)J.Com/wto/Zowa/Ozew^^y19，1639-1662)。利用Lamarckiangeneticalgorithm(LGA)研究构型。对位于二个结合点中任一处的碳水化合物，进行100组trials,其中族群大小为每组150个样品。最初的位置及构型为随机选择。其转换步骤为2.0A，旋转步骤为50。。其它嵌合系数如下mutationrate=0.02，crossoverrate=0.8，elitism=1，localsearchrate=0.06，{衣1millionenergyevaluations。从100纟且trials所f寻的最终构型丛集，以1.5A的根均方差(RMSD)容忍度决定之。(F)结果NMR光谱及分子结构7oCBM21的"NHSQC光谱显示一典型(3-条带的良好波峰分散模式(图8力。光谱质子规格宽度定为16ppm，以配合波峰。最大磁场化学位移为-1.181ppm，属于I79HS1;而属于W70的Hsl所造成的最大磁场化学位移为11.88ppm。由于ioCBM21含有大量芳香族残基(18/106)，数个化学位移受到芳香族环的7T-电子电流的影响。靠近芳香族环的电子可能经历兀-电子电流遮蔽(在环的上或下)或去遮蔽(位于芳香族环的平面)效应。部分归属化学位移曾被BMRB目前的检查化学位移极端值的软件视为可疑(Moseley,H.N.etal.，(2004)/祝omo/7VM/28,341-355)，而被BMRBannotator要求仔细的检视。例如，V39H卩(0.739)的化学位移可能被Y83及W47的环所影响；N52H卩3(0.775)被W47环，N97Hp3(—0.09)被Y102环，179Hyl2(-0.22)被Y40环及Y102Hp3(0.482)被F82环所影响；结果造成此等化学位移移动磁场。于HNCA,HN(CO)CA，CBCA(CO)NH，HNCACB，HNCO及HN(CA)CO光谱中，其骨架连续吸附力透过整个蛋白质序列持续进行，除了脯氨酸残基及甘氨酸18。介于Aspl7、Glyl8及Serl9的吸附力于所有骨架吸附实验中皆不存在，因此Glyl8酰胺中氮原子的化学位移无法明确归属。一条带图例显示HNCACB光谱中的骨架吸附力如图8B所示。结构计算依实验步骤中所述的2247限制2071NOE衍生的距离限制，102双平面角限制及74距离限制。N-及C-P-折板的NOEs如图8所示。依ARIA最终重复计算共产生200个结构，其中15个具最低总能量者存入PDB及用于进一步分析。相对于平均结构来说，以根均方差(RMSD)最低的结构做为代表结构(图9^4)。NMR的统计结果归纳于表2。对于已定义区域，根均方差相对于平均结构处，于骨架为0.48±0.06A，重原子为0.96±0.11;对于所有残基，其骨架为1.14±0.31A，重原子为1.43±0.29。于Ramachandranplot中，95%的非甘氨酸及非脯氨酸残基位于最适区域或其它额外被允许的区域，98.5%位于一般允许区。大部分组合的N97残基及数个N45及N101残基位于不被允许区。N97及N101位于环8,而N45位于环4，此等环状物位于/oCBM21最具弹性区。表2及oCBM21于pH4.5及298K水溶液中的结构统计试验限制总计2071内部残基973连续(II-jH)509中间距离(]l-jl《4)142长距离(|1-」|>4)447氢键限制74双平面角限制102来自实验数据的根均方差距离(A)0.0557±0.0077与平均结构有关的根均方差(A)已定义区域骨架(N,Ca,C，)0.48±0.06重原子0.96±0.11所有残基骨架1.14±0.31重原子1.43±0.29水纯化后的总能量(Kcdmor1)-2730±66理想状态共价几何的根均方差骨架(A)0.0046±0.0004角度(0)0,546±0.035误差(°)0.522±0.046拉氏分析最适区域内的残基67.3%额外被允许区域内的残基27.7%一般允许区内的残基3.5%不被允许区内的残基_^_ioCBM21domain包括106个残基，其序列与其它SBD家族成员相似度低(<25%)，然而ioCBM21溶液结构显示出多数CBMs特征一传统卩-三明治折叠，及一类免疫球蛋白结构(Boraston,A.B.etal.,(2004)所oc/zem7382，769-781)。p-三明治结构是对称的，并由八个反向平行的p-条带构成卩l(V9-Y16)、卩2(F21画V27)、(33(V34-D42)、卩4(153陽G60)、卩5(Y67画A74)、卩6(I79-V88)、P7(T92-N95)及(38(Y102-V104)。这些|3-条带可再分成包含卩-折板(N-折板)的N端条带(图9外如pi(3邻5;及包含P-折板(C-折板)的C端条带(图9C)，如与P4相连的(33(36P7/8。位于N-折板中间的条带p2，与卩1及P5反向平行配对；而位于C-折板中间的条带P6，则与|33、|37及卩8反向平行配对。位于二P-折板的间的条带P4，与P3及(35反向平行配对。及oCBM21的疏水性核由位于N-折板的V9、Lll、114、Y16、F21、125、V27、W70及F72，及位于C-折板的V36、V38、Y40、F82、184、Y86、V88、Y93、Y102及V104所组成。于卩l中，残基L11-Y14与|32非由氢键相连，而是形成一突起(图8C)。|37及P8皆以氢键与|36相连，其间由环8隔开(图8D)。勐CBM21的溶剂可接触表面结构显示于图9Z)及五。DelPhi静电电位(Rocchia,W.etal.,(2001)/Cfe肌5105，6507-6514)位于其表面。有趣的是，N-及C-折板的表面具有十分特殊的静电电位分布，其中N-折板的表面带有较多带负电的残基，而C-折板的表面带有较多带正电的残基。SBDs的结构比较将ioCBM21的结构与其它不同的SBD家族成员相互比较(表3)。图1(L4-D显示一级、二级、三级及四级结构的相似度。于不同SBDs家族中，依i^CBM21的结构标示及着色出相对的(3-条带及环状物(图1(L4)。二类拓朴学可由结构比较辨别的』wCBM20、5/zCBM25、5/zCBM26及《/X:BM41的结构为第一类拓朴，而/oCBM21，s及7VCBM34，s的结构为第二类拓朴。此二类拓朴构造相似，除了一条带必须位移使的重叠，例如:位于J"CBM20的(31相当于ioCBM21的P2;其后的相对应的条带可一一列出，ioCBM21最终条带(38可和JwCBM20的条带7重叠。值得一提的是，^"CBM20的最终条带于ioCBM21的pi中所扮演的角色为与N端(3-折板的中间条带(p2或其相对的条带)形成氢键。所有ioCBM21的卩-折板皆为反向平行，但^"CBM20的第一及最后的条带则为平行。总的，ioCBM21(第二类拓朴)的整体拓朴与j"CBM20(第一类拓朴)相似，但其相对的条带则位移一个位置。大多数的N端SBDs属于第二类拓朴，而C端的SBDs则为第二类拓朴(i^CBM41例外)(表3)(Mikami,B.etal.,(2006)J7kfo/所o/359,690-707).及oCB!VmB'CBM34'4wCBM20说，CBM2SBACBMMJT/iCBM415/zCBM25禾卩在pdb档中的序列对应到开启读码(openreadingframe)BH0413各为第863-958氨基酸序列和第771-863氨基酸序列。配体结合及化学位移扰动于本实验中测试的三种直链键接的碳水化合物(麦芽三糖，麦芽七糖，及P-环状糊精)显示相似的化学位移扰动模式；相同的氨基酸残基在选汰中会受影响，但其改变幅度则依碳水化合物而不同。AoCBM21的15NHSQC光谱在(3-环状糊精选汰前后为重叠(图1L4)，其化学位移改变及受影响的残基归纳于图11^。ioCBM21具有显著化学位移扰动(X).lppm及分子排列NN(N端或C端)PDB编码2DJM1UH3序列范ffl1-106.1-123(PDB编3)序列一致件(%)10010.6序列相似度(%)100216相刘于RoCBM21的根均方差(A)028拓扑类型nnc5《cN,16IO，IO:1-9853-155&L、i3力J&cJ12i20%7-60.06-0.1ppm)的残基，标示于三维结构中(图IIC)。依据此类扰动结果，受配体结合影响的残基可归成三类。第一类包含残基A41、W47、N52、Y83、K85、K91、D95、N96、N97及S99，其位于相对于前述SBDs的结合点一。同理，残基N29、130、A31、Y32、S33、K34、S57、F58、162、N66、Y67、E68及Y69构成相对的结合点二。具有显著化学位移扰动改变及二碳水化合物结合点的残基标示于AoCBM21结构上(图IIC)。有趣的是，数个位于疏水性核的残基亦受配体结合的影响，分别为Lll、V36、V38、W70及I79。环l、4及8为有弹性的区域，其平均根均方差〉1.5A。除了高弹性外，包含于结合点一的环4及8具有另一特点一皆富含天冬氨酸(asparagines)残基(位于环4的N46、N48、N49、N50及N52及环8的N96、N97、N98及N101)。碳水化合物配体选汰导致天冬氨酸N50、N52、N96、N97及N98大幅度的化学位移扰动。此类poly-N环状物可做为CBM-淀粉交互作用的分子决定点，这些poly-N环状物的出现为某些CBM21成员的特点(Machovic,M.etal.,(2005)/272,5497-5513)。二个(3-环状糊精分子分别嵌合于AoCBM21结合点一及结合点二(图IIZ))，于结合点一中，在嵌合的(3-环状糊精分子及ioCBM21富含天冬氨酸的环状物中，氢键介于葡萄糖残基的羟基02及03处；于结合点二中，N29及Y32的支链以氢键和(3-环状糊精相结合，此处同时也具有较大的化学位移扰动改变。由于多数用于SBDs研究中的配体相对较小(葡萄糖数目$7)，且不含完整的淀粉螺旋结构。为了模拟较大的直链淀粉分子吸附方式，利用cyclomaltohexaicosaose分子(Gessler，K.etal.,(1999)iVoc7Vfl//JcadSc/[/S爿96，4246-4251)(v-直链淀粉，PDBcode:1C58)分别嵌合于ioCBM21的结合点一与结合点二(图1LE及巧。于嵌合复合物的结合点一，环4与v-直链淀粉的交互作用于介于G1-G13及G14-G26的螺旋槽结构间，环8与葡萄糖残基交互作用于螺旋槽G2-G4及G8-G10螺旋槽结构间。于结合点二，环3插入螺旋槽G1-G13及G14-G26的间，而N29及Y32则与葡萄糖残基交互作用。环5与v-直链淀粉构造结合于边缘而非螺旋槽内。实施例4(a)材料及方法ioGACBM21用于结晶中的浓度约为10mg/mL。ioGACBM21-^-环状糊精((3CD)复合物结晶以莫耳浓度1:2培养，以悬式扩散结晶法进行。1(il蛋白质溶液与1^结晶溶液混合，并与Linbroplates中的500(il结晶溶液进行平衡。最初的结晶条件由HamptonResearchCrystalScreenkits取得，的后再进一步最佳化以得到可供绕射质量的结晶。^GACBM21-I3CD复合物结晶的X光绕射资料于台湾国家同步辐射研究中心的BL13C1仪于波长0.9762A时收集。结晶置于尼龙环上，再以液态氮流于100K时急冻。数据以HKL2000程序处理。(b)结果7oGACBM21-(3CD复合物结晶(图12)在四天中于293K以18%PEG8000及0.2M醋酸鋅in0.1MNaCacodylate缓冲剂(pH6.5)所得的最大规格为0.2x0.2x0.5mm。及oGACBM21-卩CD复合物结晶绕射为1.8A,属于orthorhombicP2^!2ispacegroup,其单位细胞系数a=42.58A，b=42.71A，c=70.06A，a=卩=y=卯。及imerge=3.4%。其VM(Matthews1968)估算为2.73A30^1，相对于55%溶剂时，结晶中每一个不对称单位含有一个分子。在ioGACBM21-卩CD复合物中(图13)中，一个ioGACBM21分子和P-环状糊精分子结合。于ioGACBM21-pCD复合物观察到二个结合处，结合处一及结合处二。结合处一位于(32-卩3环，包含关键的Y32残基；结合处二位于P3-(34环，包含另一个多醣辨识残基W47。尽管此发明已详尽描述于实施例中，使得所属
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的技术人员可以制造及实施，其衍生物、变体及改良亦在不背离此发明的精神及范围下可得。所属
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的技术人员会了解此发明已大为改进计划的执行，可得的结果及其内涵。实施例中的胚胎、动物、植物、微生物及其制造步骤及方法仅为代表例，而非用以限制此发明的范畴。所属
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的技术人员可进一步改良及开发其它用途，改良包含于此发明的精神亦属于本发明的权利要求中。权利要求1.一种淀粉吸附区域，其特征在于具有如下显示于SEQIDNo.1、2或3的氨基酸序列；SEQIDNo.1ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVVYADGSDNWNNNGNIIAASFSGPISGSNYEYWTFSASVKGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS；SEQIDNo.2ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVIYADGSDNWNNNGNTIAASYSAPISGSNYEYWTFSASINGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS；或SEQIDNo.3ASIPSSASVQLDSYNYDGSTFSGKIYVKNIAYSKKVTVIYANGSDNWNNNGNTIAASYSAPISGSNYEYWTFSASINGIKEFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS；或其SEQIDNO.1、2或3的等位变体和衍生物，其具有淀粉结合能力者。2.根据权利要求1所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自CBM20或CBM21。3.根据权利要求2所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自CBM21葡萄糖淀粉酶之淀粉吸附区域。4.根据权利要求3所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自根霉属。5.根据权利要求4所述的淀粉吸附区域，其特征在于其可取得自根霉属葡萄糖淀粉酶的淀粉吸附区域。6.根据权利要求5所述的淀粉吸附区域，其特征在于其在氨基酸序列的残基32、47、58、67、83、93和94的芳香性基团上具有用于碳水化合物结合的活性位点。7.根据权利要求6所述的淀粉吸附区域，其特征在于该氨基酸残基为酪氨酸或/及色氨酸。8.根据权利要求6所述的淀粉吸附区域,其特征在于该活性位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基58酪氨酸、残基83酪氨酸、残基93酪氨酸和残基94酪氨酸。9.一重组蛋白质，其特征在于包含下列序列(SBD)m國Ln國X-L，p-(SBD)qSBD指淀粉吸附区域，L指连接子，L'指连接子，X指目标蛋白质或多胜肽，m为0、l或2，n为0或l，p为0或l，q为0、1或2，其中m和q不会同时为0。10.根据权利要求9所述的蛋白质，其特征在于该淀粉吸附区域系如权利要求1的淀粉吸附区域。11.根据权利要求9所述的蛋白质，其特征在于该连接子为及oLK:及Wzo/WSOO^aeGA的连接子；PH:六个组氨酸；PK:八个赖氨酸；PPT:一个苏氨酸及四个脯氨酸-苏氨酸重复序列[T(PT)4];或58L:在载体pET39b(+)上界于限制酶切位S/el及间的区域。12.—复合物，其特征在于包含下列序列(SBD)m-X-(SBD)qSBD指淀粉吸附区域，X指碳水化合物，m为0、1或2,q为0、1或2，其中淀粉吸附区域利用不同部位同时和碳水化合物结合。13.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该碳水化合物的结构包含a-l,4-葡萄糖键接或a-l,6-葡萄糖键接。14.根据权利要求12所述的复合物,其特征在于该碳水化合物为环状碳水化合物。15.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该淀粉吸附区域和碳水化合物用配体结合位置或构型方式结合。16.根据权利要求12所述的复合物，其特征在于该淀粉吸附区域包含多个单位依据碳水化合物的大小决定。17.—种用以纯化含有如权利要求1淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法，其特征在于包含a.将含有重组蛋白质的生物液体直接施加于亲和性基质；和b.调整温度、pH值、离子强度、含糖浓度或酵素组成以溶离重组蛋白质。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于该亲和性基质在其任意部分结构，包含主链、侧链或经修饰残基之内包含下式(X-X)nX指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键接为a-l,4-键结或cc-l，6-键接且n为l或大于l。19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于该亲和性基质为淀粉。20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于温度改变范围指37。C或更高。21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于步骤a于025。C下操作。全文摘要本发明涉及淀粉吸附区域，重组蛋白质及其组合物。本发明还涉及分离含有淀粉吸附区域的重组蛋白质的方法。文档编号C12N15/66GK101605809SQ200680056250公开日2009年12月16日申请日期2006年10月31日优先权日2006年10月31日发明者吕平江,孙玉珠,张大慈,许嘉钦申请人:善笙生物科技股份有限公司