花生△¹²-脂肪酸脱氢酶突变基因及其编码的蛋白质以及克隆方法

专利名称：花生△¹²-脂肪酸脱氢酶突变基因及其编码的蛋白质以及克隆方法
技术领域：
本发明属于脂肪酸代谢工程领域，具体涉及-一种花生脂肪酸脱氢 酶突变基因及其编码的蛋白质以及克隆方法。
背景技术：
花生是重要的油料作物，富含优质蛋白和脂肪，是人们健身增寿的食疗保健佳品。花生仁中含油量为45-51%，其中大约80%由油酸 和亚油酸组成。油酸在人体的脂类代谢中发挥着特殊的作用，它可以 降低有害胆固醇(低密度脂蛋白，LDL),但保持有益胆固醇(高密 度脂蛋白，HDL)的水平，从而减缓动脉粥样硬化，有效预防冠心病 等心血管疾病的发生。而亚油酸为多不饱和脂肪酸，虽能降低有害胆 固醇但也能降低有益胆固醇的含量，因而对健康不利。而油酸与亚油 酸比值的高低决定了花生的品质性状。油酸与亚油酸的比值高，抗氧 化能力就强，在夏季高温的情况下不易氧化酸败，货架周期较长，耐 储能力也较强。因此，油酸含量高的花生品种具有更好的商品性。提 高油酸的相对含量，增加油酸/亚油酸(0/L)的比值，已成为目前油 料作物品质改良育种的重要内容。本发明所用的花生品种EU油酸含 量为76.6%,亚油酸含量5.2%; ￡16油酸含量为78.1%,亚油酸含量 3.7%。 Ell和m6的油酸含量与普通品系花生相比，油酸含量翻番， 属于高油酸品种。A^脂肪酸脱氢酶是油酸脱氢形成亚油酸的关键酶，在油酸的 厶12位上加上一个双键形成亚油酸。1993年，Rayetal的研究发现普 通花生品系中厶12-脂肪酸脱氢酶的活性是高油酸花生品系中的十倍。 2000年，Y.Lopez的研究表明，在厶12-脂肪酸脱氢酶基因的编码区序 列中有两个单核苷酸多态性，可能是控制高0/L值的数量性状位点。本发明从高油酸花生品种(E11和E16)中鉴定了厶12-脂肪酸脱氢酶 基因，其与普通花生品系中厶'2-脂肪酸脱氢酶基因序列相比，发生了 碱基突变，致使编码区提前终止，从而使花生脂肪酸脱氢酶活性大大 降低甚至丧失。发明内容本发明的目的在于公开一种花生厶。-脂肪酸脱氢酶基因的突变 序列及其编码的蛋白质，该基因的突变使脂肪酸脱氢酶活性丧失，使 油酸转变为亚油酸的途径受阻，从而使花生中油酸含量增加。同时， 本发明还要提供该花生脂肪酸脱氢酶突变基因的克隆方、法。本发明所提供的花生厶12-脂肪酸脱氢酶突变基因，它来自花生 (血aeto勿pog您a),命名为颜MD2 '基因，核苷酸序列SEQ ID NO. 1:1actcacttctcttctctctgttggaattgcntcacggagctttaacaacacaac腿tgggagctggagggCgtgtCElCtaagattg幼gctcaa卿aagectcl.ttcaagggttccacatt(:aaaccctccattcagtgttggccaactca鄉卿caattceaccacaUgctttgaacgUctct.tttcatatcattctcatatgttgtctatgatctcttaatggcctacttac241tcttctacattgccaccacttetttccaeaagcttccatacccattttecttccttgctt飢ggcc腿tctattgggccatcC卿gCtgC8ttctca卿gtgtug認tgattgctcatg361agtgtggccaccatgccttcagc卿taecaacttgttgatgacat.ggttggttt卿cc似ttcactcttgccttatttctcat鹏a幼tc鄉caccgccgccaccact舰cc拟icac鄉ttccctcagaccgcgacgaagtgtttgtcccgaaa(:eaaaatcaaaggta511acaagtacatgaacaatccacc鄉g鄉gctatttcccttttcatcaea601ctcacactaggatggcccttgtacttggccUcaatgtUctggcagaccctatgat卿gfiltttgcaagccactatgacccttatgctcccatatact.ctaacagggaaaggcttct幼tt721tatgtctcag3ttcatctgtctttgctgtaac'atat(:tgctatat('acatagcaacttt.g781舰ggtttgggttgggtggtatgtgtttat.g鹏tgceattgetcattgtgaatgggttt841ctagtteccataacctatttgcagcacaeacatgcat.cattgcctcactat糾tcatcc恥l卿tgggactg,ag娜agcattggcaacagtggacagagattatgggatact卿t細aaggcatttcatcatataactgatacgcmtgtggctcatcstttgttctcaac肪tgcct鹏cattaceatgcaatgg卿c咖caatgC8ataaagccaatattgggtgattactaec肪tttgatggcaccccagtttaca卿cattgtggagag卿ccaaa卿tgcctctatgtg蘭卿cc卿tgatggagcttctcaga鄉gtgtUattggtBcaagaacaagttctgatgc鹏atagteagagttggaaacgtttgtgttaaatta卿acttgtaacttgtsr旭agaatgtgtgtgtggaUtgc上述_--种花生脂肪酸脱氣酶突变基因编码的蛋白质，它来自花生04rac/H's/0^og做fl)，命名为AhFAD2'蛋白质，它具有如下所示的氨基 酸序列SEQIDNa2:Met Gy AlaGly(;lyArg ValThrLyslie(;luAla Gin{,ysPro1510〗5l.eu Ser ArgVal 20ProHis SerAsnPro 25ProPheSer Y'rtl加Ginl.eul-ys Lys AlalieProPro HisCysPheGluArgSer UmPhelieSer354045Phe Ser TyrValValTyr AspLeuLeuMetAlaTyr LeuL>euPheTyr505560lie Ala Th.rThrTyrPhe HisLysLeuProTyrPro PheSerPhe1-eu7075抑Ala Trp ProlieTyr 85Trp AlalieGinGly 恥Cyslie LeuThrGly 95ValTrp Val lieAla 咖HisGlu CysGlyHis 105HisAlaPhe SerLys 110Tyr(;lnLeu Vh〗AspAspMetVal GlyLeuThrLeuHisSer CysLeuLeuVal115120125Pro Tyr PheSerTrpLys lieSerHisArgArgHis HisSerAsnThr13 135140Giy Ser LeuArgProArg ArgSerValCysProGlu ThrlieLys145150155160Gl.y He MetVal165170175上述花生脂肪酸脱氢酶突变基因JWMD2'的克隆方法，包括如(1) 选用Ell或E16的花生种子置于研钵中，室温下加入0.5ml 植物RNA提取试剂(可使用天为时代公司的RNAplant试剂)，充分 研磨后，转移至1.5mlEP管中，振荡至彻底混匀，抽提总RNA,用 甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA 含量；(2) 根据已经扩增的花生i^"部分序列(8Slbp),设计引物: GSP1:5-AGTGGTGGCGGCGGTGGCTGATTTTC-3 GSP2:5-GGCAACAGTGGACAGAGATTATGGG-3以获得的总RNA为模板，经反转录合成5，-RACE~Ready cDNA 和3'-RACE-ReadycDNA,用高保真Taq酶进行PCR扩增，5'-RACE的PCR程序如下94"预变性2min, 94C变性30s, 72。C延伸2min， 5个循环后，94'C变性30s， 70t!复性30s， 72"C延 伸2min, 5个循环后，94'C变性30s, 68C复性30s, 72"延伸2min, 26个循环后，72°C 15min;3，-RACE的PCR程序如下94"C预变性2min, 94t:变性30s， 68。C复性30s, 72。C延伸2min, 27个循环后，72r 15min;PCR产物回收后克隆至pMD18-T载体；委托上海英骏公司测 序后获得AhFAD2'的5'端序列和3'端序列。(3)根据已经获得的^W5li)2'基因的5'端序列和3'端序列，设 计两端引物FADf5: 5，腸ACTCACTTCTCTTCTCTCTG-3，腿f3: 5'-GCAAATCCACACACACATTC-3' 以歩骤(2)获得的5'-RACE-Ready cDNA为模板，用高保真Taq酶 进行PCR扩增，PCR程序如下:94匸预变性4分钟,94'C变性30s, 复性50s, 72'C延伸2min， 32个循环后，72°C 15min。最终将PCR 产物进行克隆、测序获得了花生么12-脂肪酸脱氢酶突变基因的全长 cDNA序列。本发明公开了一种花生厶12-脂肪酸脱氢酶突变基因"AEIi)2'基 因)及其所编码的蛋白质。该基因来自高油酸花生(^rac/^ A^ogfl郎), 该基因编码截短的脂肪酸脱氢酶，致使脂肪酸脱氢酶失去活性，从而 使油酸转变为亚油酸的途径被终止，因此花生中油酸含量提高。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步详细的描述。 选用花生高油酸品种Ell或E16的种子(不多于0.1克)于研钵中，室温下加入0.5ml植物RNA提取试剂(天为时代公司的RNAp!ant 试剂)，充分研磨，转移至l.SmLEP管中，振荡至彻底混勾，抽提总 RNA,用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测 定RNA含量。以获得的总RNA为模板,经反转录合成5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA，利用RACE技术获得了脂肪酸脱氢 酶突变基因的5'端序列和3，端序列。根据脂肪酸脱氢酶突变基因的5' 端序列和3'端序列设计两端引物腦f5:5'-ACTCACTTCTCTTCTCTCTG-3';FADS:5'-GCAAATCCACACACACATTC-3' 采用RT-PCR方法进行cDNA克隆，PCR反应程序为94'C预变性4 分钟，94"C变性30s, 59'C复性50s, 72'C延伸2min， 32个循环后， 72'C 15min。最终将PCR产物进行克隆、测序获得了花生脂肪酸脱 氢酶突变基因JW51D2'的cDNA序列。突变的脂肪酸脱氢酶基因JM^2'与已经注册的FAD2B (注册 号AF272950)基因序列相比,发生了碱基突变，在起始密码子后442bp 处有碱基A的插入，从而使编码区提前终止，编码了一个截短的脂 肪酸脱氢酶蛋白。本发明的J涵肪2'全长B01bp,其第一个开放阅读框位于57-551 处。DNAssist软件分析表明屈趨D2'共编码164个氨基酸。FAD2B (注册号AF272950)基因的开放阅读框含有ll邻bp，编码379个氨 基酸。屈祝D2基因与MD2S基因相比，在起始密码子后442bp处 有碱基A的插入，从而使编码区提前终止，编码了-个截短的脂肪 酸脱氢酶蛋白。所有已知的脂肪酸脱氢酶都有3个组氨酸簇，可能涉 及到酶活性位的形成。由于4W5li^'基因编码区提前终止，引起第 三个组氨酸框缺失，可能使脂肪酸脱氢酶活性减弱甚至丧失，从而使 花生中油酸脱氢形成亚油酸的途径受阻，因此花生中油酸含量提高。用实例中设计的4W54D2'两端引物进行半定量RT-PCR分析花 生根、茎、叶和种子的表达，以18SrRNA基因(Sancen6n等，2003) 的表达作为内参，结果表明，4W54D2'基因在花生不同组织中都有表 达。上述实施例表明本发明中克隆的花生脂肪酸脱氢酶突变基因4W^D2',是引起花生油酸含量提高的主要原因。本发明人从双子叶植物花生(JracMs ty/ oga郎)中克隆了--个突变的脂肪酸脱氢酶基因^E4D2'。 mRNA表达分析表明JMM/32'在检测的花生根、茎、叶片以及种子中都有表达。厶12-脂肪酸脱氢酶是脂肪酸代谢中催化油酸形成亚油酸的关键酶。如果花生种子厶^脂肪酸脱氢酶基因核苷酸序列发生碱基插入或缺失突变，厶'2-脂肪酸脱氢酶形成就会受阻，从而减少亚油酸的合成，达到积累大量油酸的目的。 本发明涉及的序列及记号分列如下(1) SEQIDNO. l的信息 (i)序列特征(A) 长度13(Hbp(B) 类型核苷酸(C) 链性单链(D) 拓扑结构线性(ii) 分子类型核苷酸(iii) 序列描述SEQIDNO.l(2) SEQIDM).2的信息 (i)序列特征(A) 长度164 a.a(B) 类型氨基酸(C) 链性单链(D) 拓扑结构线性 (ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQIDN0.2核苷酸序列SEQIDNO. 1:1actcacttctcttctctctgttggaattgctttcac鹏gctttanc腿cacaac幼tgg卵gctggagggcgtgtcactaagattgaagctc幼aagaagcctx'tttcaagggttccacmiit,tc肌ac;cctccattcagtgttggccaactcaagaaagcaattet:accacattgctttg181aacgttctcttttcatatcattctcatatgttgtctatgatctcttaatggcctacttac2 txttctacattgccaccacttatttccacaagcttccatacccatt.ttccUccttgctt301ggccaatctattgggccatcc卿gctgcattctcaccggtgtttgggtgattgctcatg361agtgtggccaccatgccttcagc卿taccaacttgttgatgacatggttggtttgaccc421Ucaetcttgtctattagttccttatttetcatggaaaatcagccaccgccgccaccsct柳ccaacacaggttccctc卿ccgcgacgaagtgtttgtcccgaaaccaaaatcaaaggta541tcatggt咖ac卿tacatgaac幼tccaccagggagggctatttccctUtcatcaca601ct.cacactaggatggcccttgtacttggcettcaatgtttctggcagaccctatgataga6ttlmgcaagccactatgacecttatgctcccatatactctaacagggaaaggcttctaatt721tatgtctcagattcatctgtctttgctgtaacatatetgctatatcacatagcaactttg781aaaggtttgggttgggtggtatgtgtttatggggtgccattgctcattgt卿tgggttt841ctagttaccataacctatttgcagcacBtmcatgcatcattgcctcactatgattcatcc恥igaatgggactggttaagagg鄉attggcag卿ttatgggatactgaat卿gcatttcatcatataactgatacgcatgtggctcatcatttgttctcaacaatgcct鹏cattaceatgcaatgg卿caaccaatgcaat肪卿caatattgggtgattactaccaa鹏tttgatggcaccccagtttaca幼gcattgtgg卿卿gccaaa柳tgcctctatgtg■gagccagatgatggagcttct卿aagggtgtttat1:ggtgttctgatgc讓at过gtc卿gUggsaacgtttgtgttaaattagaaaettaagtactttagt;aacttgta1261atggtcatcaacaaaaataa卿atgtgtgtgt卿t:ttgc氨基酸序列SEQIDNO,2:Met Gly Aia GJy (;iy Arg Val Thr Lys lie Glu Ala Gin Lys Lys ProJ 5 10 15Leu Ser Arg Val Pro His Ser Asn Pro Pro Phe Ser Val Gly Gin Leu20 25 30Lys Lys Ala lie Pro Pro His Cys Phe Glu Arg Ser Leu Phe lie Ser35 40 45Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Leu Met Ala Tyr Leu Leu Phe Tyr50 55 60lie Ala Thr Thr Tyr Phe His Lys Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Phe Leu 65 70 75 抑Ala Trp Pro lie Tyr Trp Ala lie Gin Gly Cys lie Leu Thr Gly V'al85 恥 95Trp Va〗lie Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser Lys Tyr (;ln100 鹏 110Leu Val Asp Asp Met Val Gly Leu Thr Leu His Ser Cys Leu Leu Val115 120 125Pro Tyr Phe Ser Trp Lys lie Ser His Arg Arg His His Ser Asn Thr130 135 140Gly Ser Leu Arg Pro Arg Arg Ser Val Cys Pro Glu Thr Lys lie Lys 145 150 155 160Gly lie Met Val165 170 17权利要求
1.一种花生Δ12-脂肪酸脱氢酶突变基因，具有如下核苷酸序列1 actcacttct cttctctctg ttggaattgc tttcacggag ctttaacaac acaacaatgg61 gagctggagg gcgtgtcact aagattgaag ctcaaaagaa gcctctttca agggttccac121 attcaaaccc tccattcagt gttggccaac tcaagaaagc aattccacca cattgctttg181 aacgttctct tttcatatca ttctcatatg ttgtctatga tctcttaatg gcctacttac241 tcttctacat tgccaccact tatttccaca agcttccata cccattttcc ttccttgctt301 ggccaatcta ttgggccatc caaggctgca ttctcaccgg tgtttgggtg attgctcatg361 agtgtggcca ccatgccttc agcaagtacc aacttgttga tgacatggtt ggtttgaccc421 ttcactcttg tctattagtt ccttatttct catggaaaat cagccaccgc cgccaccact481 ccaacacagg ttccctcaga ccgcgacgaa gtgtttgtcc cgaaaccaaa atcaaaggta541 tcatggtata acaagtacat gaacaatcca ccagggaggg ctatttccct tttcatcaca601 ctcacactag gatggccctt gtacttggcc ttcaatgttt ctggcagacc ctatgataga661 tttgcaagcc actatgaccc ttatgctccc atatactcta acagggaaag gcttctaatt721 tatgtctcag attcatctgt ctttgctgta acatatctgc tatatcacat agcaactttg781 aaaggtttgg gttgggtggt atgtgtttat ggggtgccat tgctcattgt gaatgggttt811 ctagttacca taacctattt gcagcacaca catgcatcat tgcctcacta tgattcatcc901 gaatgggact ggttaagagg agcattggca acagtggaca gagattatgg gatactgaat961 aaggcatttc atcatataac tgatacgcat gtggctcatc atttgttctc aacaatgcct1021cattaccatg caatggaagc aaccaatgca ataaagccaa tattgggtga ttactaccaa1081tttgatggca ccccagttta caaagcattg tggagagaag ccaaagagtg cctctatgtg1141gagccagatg atggagcttc tcagaagggt gtttattggt acaagaacaa gttctgatgc1201atagtcagag ttggaaacgt ttgtgttaaa ttagaactt aagtacttta gtaacttgta1261atggtcatca acaaaaataa agaatgtgtg tgtggatttg c
2.—种花生厶12-脂肪酸脱氢酶突变基因编码的蛋白质，具有如下氨基酸序列5tet Gly Ala Gly Gly Arg Val Thr Lys lie Glu Ala Gin Lys Lys Pro15 10 15Leu Ser Arg Val Pro His Ser Asn Pro Pro Phe Ser Val G.ly (;ln Leu20 25 加Lys Lys Ala lie Pro Pro His Cys Phe Glu Arg Ser Leu Phe lie Ser35 40 45Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Leu Met Ala Tyr Leu Leu Phe Tyr50 55 60lie Ala Thr Thr Tyr Phe His Lys Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Phe Leu 65 70 75 80Aia Trp Pro lie Tyr Trp Ala lie Gin Gly Cys lie Leu Thr (;ly Val85 90 95Trp Val He Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser Lys Tyr (;ln 100 105 110L u VaJ Asp Asp Met Val Gly Leu Thr Leu His Ser Cys Leu Leu ValUS 120 125Pro Tyi' Phe Ser Trp Lys lie Ser His Arg Arg His His Ser Asn Thr130 135 140(;ly Ser Leu Arg Pro Arg Arg Ser Val Cys Pro Glu Thr Lys lie l,ys 113 150 155 160Gly 11c Jfet Val165 170 175
3. --种花生^|2-脂肪酸脱氢酶突变基因的克隆方法，包括如下 歩骤(1) 选用Ell或E16的花生种子置于研钵中，室温下加入0.5ml 植物RNA提取试剂，充分研磨后，转移至L5mlEP管中，振荡至彻 底混匀，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在 分光光度计上测定RNA含量；(2) 根据已经扩增的花生F力)2部分序列(88ibp)，设计引物 GSP1:5-AGTGGTGGCGGCGGTGGCTGATTTTC-3 GSP2:5-GGCAACAGTGGACAGAGATTATGGG-3以获得的总RNA为模板，经反转录合成5'-RACE-Ready cDNA 和3'-RACE-ReadycDNA，用高保真T叫酶进行PCR扩增，5'-RACE的PCR程序如下94'C预变性2min， 94"C变性30s， 72t延伸2min， 5个循环后，94"变性30s， 7(TC复性30s, 72"延 伸2min, 5个循环后，94'C变性30s, 68'C复性30s， 72"C延伸2min, 26个循环后，72'C i5min;3'-RACE的PCR程序如下94"C预变性2min, 94"C变性30s, 68。C复性30s， 72'C延伸2mta, 27个循环后，72°C 15min;PCR产物回收后克隆至pMD18-T载体，测序后获得AhFAD2'的5'端序列和3'端序列(3) 根据已经获得的^ ^/>2'基因的5'端序列和3'端序列，设FADf5: 5'-ACTCACTTCTCTTCTCTCTG-3,FADS: 5，-GCAAATCCACACACACATTC-3' 以歩骤(2)获得的5'-RACE-Ready cDNA为模板，用高保真T叫酶 进行PCR扩增，PCR程序如下941C预变性4分钟，94'C变性30s, 59。C复性50s， 72"C延伸2min, 32个循环后，72°C 15min,最终将 PCR产物进行克隆、测序获得了花生厶12-脂肪酸脱氢酶突变基因的全 长cDNA序列。
全文摘要
本发明首次公开了引起花生品种E11和E16油酸含量增高的突变基因△¹²-脂肪酸脱氢酶基因(AhFAD2’)的核苷酸序列及所编码的截短的蛋白质序列。本发明还提供了该花生脂肪酸脱氢酶突变基因的克隆方法。本发明基因AhFAD2’的mRNA表达分析表明该基因呈组成型表达。
文档编号C12N9/04GK101235380SQ20071000308
公开日2008年8月6日 申请日期2007年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者曹玉良, 杨庆利, 潘丽娟, 禹山林, 平 闵 申请人:山东省花生研究所