专利名称：：一种简易高效的pcr产物纯化回收方法及其专用装置的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种简易高效的PCR产物纯化回收方法及其专用装置。
背景技术：
：琼脂糖凝胶电泳回收DNA片断的常用方法主要包括以下几种柱回收试剂盒可谓目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上样到包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。但是这个方法不适合用于大片断的回收。玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒这个方法比柱回收试剂盒方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，溶胶缓冲液溶解，加入纯化填料吸附混合，快速加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩掉，再用洗脱缓冲液洗脱即可。低熔点琼脂糖传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65'C保温融化，用传统的酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。透析袋电洗脱法切下目的DNA条带放在充满TAE的透析袋中再电泳一段时间，让DNA走出凝胶，走向溶液中，再反向电泳一会儿，将附在透析袋上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE溶液清洗袋子，合并溶液后釆用酚、氯仿抽提。由于透析袋难绑，只有在DNA片段断很大的时才考虑此法，这也是聚丙烯酰胺凝胶回收产物的方法之一。DEAE纤维素膜纸片法和其他改良法早期实验室最常用方法之一；将DEAE纤维素膜裁成小条进行活化处理，而后在将电泳后在目的条带前切一窄口，同时将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，继续电泳，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65'C保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚-氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA,因为洗脱比较困难。以上方法存在搡作步骤繁瑣、成本高、稳定性差、不适合回收小片段DNA(<200bp)等不同缺点。
发明内容本发明目的在于提供了一种简易高效的PCR产物纯化回收方法。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为纯化回收方法1)用0.5xTAE缓冲液配制浓度0.5%-1.5°/。的琼脂糖凝，将30-50ul待纯化的样品在O.5xTAE缓冲液下电泳，50V,30-60分钟；2)在紫外灯下切下待纯化样品在步骤1)电泳的电泳胶片上的目的条带，而后将琼脂糖胶条在无菌水中清洗l-3遍，除净无菌水待用；3)将琼脂糖胶条平铺在过滤管中的滤纸片上，然后装入离心管中，以12000-14000转/分钟，离心5-10分钟，离心管收集到的液体即为纯化后的产物。步骤1)所述的待纯化的样品可为PCR产物或腿A片段。所述步骤2)中待纯化样品电泳的电泳胶片上的目的条带为100-3000bp。纯化回收方法的专用装置:所述试管4为内部插置过滤管1的离心管3,过滤管1底部铺设滤纸片2。本发明所具有的优点1.简便快捷。切胶、装柱、离心，整个操作过程可在io分钟内完成。2.成本低。纯化装置取材容易，整个装置及纯化用试剂成本不超过0.5元(腿B)3.结果稳定可靠。回收率能保持在90%以上。4.适用范围广泛。纯化的待测样品可为50-3000bp。图l为本发明实验装置分解图。图2为本发明实验装置图。图3为PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，A1、A2:179bp,Bl、B2:566bp,Cl、C2:1485bp,M:DL2000Marker，凝胶浓度0.8%,上样40ul，电压50V,电泳30min。图4为PCR产物第一次回收结果0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，A:179bp,B:566bp,C:1485bp,M:DL2000Marker,凝胶浓度0.8%,上样40ul，电压50V,电泳30min。图5为PCR产物第二次回收结果0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，A:179bp,B:566bp,C:1485bp,M:DL2000Marker,凝胶浓度0.8%,上样40ul,电压50V,电泳30min。图6为PCR产物第二次回收结果l.Oy。琼脂糖凝胶电泳图谱,其中A:179bp，B:566bp，C:1485bp,M:DL2000Marker,凝胶浓度1.0%,上样10ul，电压50V,电泳60min。图7为179bpPCR产物在不同浓度琼脂糖凝胶中的电泳图谱，其中M:DL2000Marker,上样40ul，电压50V,电泳60min。具体实施方式实施例1纯化方法参见图1-2组装试管4，所述试管4为内部插置过滤管1的离心管3,过滤管1底部铺设滤纸片2。1)用G.5xTAE缓冲液配制浓度0.8。/。的琼脂糖凝胶，将40ul待纯化的样品在O.5xTAE缓冲液中电泳，电压为50V,电泳60min(参见图3);所述待纯化的样品为选取细菌16SrRNA序列上的三对通用引物341F/519R,341F/907R,27F/1492R。以大肠杆菌DH5a的基因组DAN为摸板，扩增得到三段16SrRNA基因部分序列，并分别称取40ul。所述0.5xTAE:50xTAE用时稀释100倍(1000ml50xTAE配方242克Tris,57.1ml冰醋酸，100ml0.5MEDTA，PH8.0)2)在紫外灯下切下待测样品在步骤1)电泳的电泳凝胶上的目的条带，而后将琼胶条在无菌水中清洗l遍，除净无菌水待用；其中，待测样品为扩增得到三段16SrRNA基因部分序列，在紫外灯下观察待测样品在琼脂糖凝胶上的迁移位置，根据DNA分子量MarkerDL2000确定三段待测样品的目的条带为长度分别为179bp,566bp,1485bp的片段。3)将琼脂糖胶条平铺在过滤管中的滤纸片上，然后装入1.5ml离心管中，放入离心机中，12000转/分钟，离心5分钟，离心管收集到的液体即为纯化后的产物。釆用蛋白质/核酸含量测定仪测定产物浓度(参见图4和表1)。由图4可知初次回收产物足以满足测序、酶切等后续实验的需要，凝胶浓度以回收产物体积控制在50ul左右为宜，短DNA片段用高浓度胶，长DNA片段用低浓度胶；如果初始PCR产物浓度太低(电泳条带亮度弱)，应先用无水乙醇或异丙醇沉淀浓缩PCR产物；如果PCR产物回收体积过大，回收产物浓度偏低，应用无水乙醇或异丙醇沉淀浓缩回收产物，而后在通过本发明提供的方法进行纯化。实施例2将实施例1一次纯化得到的179bp,566bp，1485bp三片段分别称取40ul,按照实施例1的步骤再次纯化，得二次纯化产物。其中琼脂糖凝胶浓度0.8%(参见图5和表1)由表l可以看出三种PCR产物回收率均在90%以上，长片段回收率高于短片段。由于短片段DNA在低浓度琼脂糖凝胶电泳中分辨率低，条带较宽，回收体积大于长片段DNA。由图4可见三段PCR产物在经过二次回收后仍可得到整齐清晰的电泳条带。初次回收产物足以满足测序、酶切等后续实验的雷更wy而文。表l.三种PCR产物回收结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>回收率=(二次回收产物浓度x二次回收体积)/(初次回收产物浓度x40u1)x100%实施例4与实施例2不同之处在于，将实施例1一次纯化得到的179bp，566bp，1485bp三片段分别称取40ul,按照实施例1的步骤再次纯化，得二次纯化产物。其中琼脂糖凝胶浓度1.0%,上样量10ul，电压50V,电泳60min。(参见图6)实施例51)用0.5xTAE缓冲液配制浓度分别为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的琼脂糖凝胶，将40ul待纯化的样品在0.5xTAE缓冲液中电泳，电压为50V,电泳60min(参见图3);所述待纯化样品为选取细菌16SrRNA序列上的一对通用引物341F/519R,以大肠杆菌DH5a的基因组DAN为摸板，扩增得到179bp的DNA片段，并称40ul。2)在紫外灯下切下步骤l)电泳凝胶上的目的条带，而后将琼脂糖凝胶条在无菌水中清洗l遍，除净无菌水待用；3)将琼脂糖胶条平铺在过滤管中的滤纸片上，然后装入1.5ml离心管中，放入离心机中，12000转/分钟，离心5分钟，离心管收集到的液体即为纯化后的产物。釆用蛋白质/核酸含量测定仪测定产物浓度(参见图7)。由图4可见，琼脂糖凝胶浓度越低，电泳条带越宽。因而回收体积越大，但回收产物的浓度差别不明显，琼脂糖凝胶浓度越低产物回收率越高。本发明的纯化方法根据待测样品长度的不同，可选用不同的DNA分子量Marker,同时在紫外灯下切下待测样品在电泳胶片上的目的条带。权利要求1.一种简易高效的PCR产物纯化回收方法，其特征在于1)用0.5×TAE缓冲液配制浓度0.5％-1.5％的琼脂糖凝，将30-50ul待纯化的样品在0.5×TAE缓冲液下电泳，50V，30-60分钟；2)在紫外灯下切下待纯化样品在步骤1)电泳的电泳胶片上的目的条带，而后将琼脂糖胶条在无菌水中清洗1-3遍，除净无菌水待用；3)将琼脂糖胶条平铺在过滤管中的滤纸片上，然后装入离心管中，以12000-14000转/分钟，离心5-10分钟，离心管收集到的液体即为纯化后的产物。2.按权利要求1所述的简易高效的PCR产物纯化回收方法，其特征在于步骤l)所述的待纯化的样品可为PCR产物或DNA片段。3.—种按权利要求1所述简易高效的PCR产物纯化回收方法的专用装置，其特征在于所述试管(4)为内部插置过滤管(1)的离心管(3)，过滤管(1)底部铺设滤纸片(2)。全文摘要本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种简易高效的PCR产物纯化回收方法及其专用装置。具体为用0.5×TAE缓冲液配制浓度为0.5％-1.5％的琼脂糖凝胶，将待纯化的样品进行电泳；在紫外灯下切下包含目的片段的琼脂糖胶条，而后将琼脂糖胶条在无菌水中清洗1-3遍，除净无菌水，平铺在过滤管中的滤纸片上，然后装入1.5ml离心管中，以12000-1400转/分钟的速度，离心5-10分钟，离心管收集到的液体即为纯化后的产物。采用本发明方法回收产物可直接用于测序、酶切、克隆等，其结果稳定可靠，操作简便，经济实用。文档编号C12N15/10GK101376883SQ20071001265公开日2009年3月4日申请日期2007年8月31日优先权日2007年8月31日发明者张惠文,张成刚,旭李,李新宇,苏振成申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所