专利名称：：一种计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的方法
技术领域：
：本发明涉及定向酶解制备活性肽的方法，属海洋生物
技术领域：
。本发明以鱼皮胶原蛋白为原料，采用定向酶解、膜过滤、低温干燥等高新技术生产目标活性肽，并采用生物传感器和计算机系统，实现酶解过程的辅助控制，本发明可为活性肽的规模化生产提供技术支持。
背景技术：
：我国作为渔业大国，水产品总量呈逐年增长的趋势。随着人们生活水平的提高，水产品除了少量鲜销外，大部分加工成鱼片、鱼糜、鱼丸等成品或半成品销售。在加工过程中会产生大量的鱼头、鱼鳍、鱼皮等废弃物，目前这些废弃物只有少部分被加工成鱼粉等低值产品，更多的被废弃掉并且造成环境污染。因此，低值海洋生物资源的优化利用和高值化开发是十分重要的。胶原蛋白由于其特有的生理活性及丰富的营养，在医药、食品、化妆品等高附加值领域中得到广泛开发和应用。从水产品中获取胶原蛋白，从胶原中制备活性肽成为水产研究的热点。随着我国渔业的发展，水产品的综合利用也越来越引起人们的重视。在加工时，产生出占鱼体总重约4055的下脚料(包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉)，而这些废弃物是制备胶原蛋白的优良原料，对这些废弃物的再利用不仅保护了环境还可提高水产品的附加值。胶原蛋白中蕴藏着多种生物活性肽，如抑制血管紧张素转化酶活性、抑制血小板凝结活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性等。胶原活性肽是以胶原为原料，经多种蛋白酶定向梯度水解后的产物，其分子量在2000Da以下。目前活性肽的生产方式主要有三种(l)从天然生物体中提取；(2)体外酶水解蛋白质产生；(3)通过化学方法和重组DNA技术合成。不同的生产方式各有特点，这取决于目的肽的长短、数量以及用途。天然产物中生物活性肽的含量很少，可作为生物活性肽进行研究，而用作食品是不可行的。化学合成法广泛用于生产高价的药用级肽，但是它的成本高，而且副产物会对人体有害。重组DNA技术合成法也被广泛应用，但是这种方法多用来生产长肽和蛋白质，而许多生物活性肽都是短肽，所以也限制了这种方法的使用。酶法生产生物活性肽具有很多优点，即生产条件温和、安全性高、价廉且控制反应时间就可以得到特定的活性肽，目前酶法在生物活性肽生产中得到广泛应用。在蛋白质水解产品的开发上，肽的开发可能为传统食品业开创出新的机会。酶法生产生物活性肽虽具有很多优点，但在工业上酶解制备活性肽时，仍存在酶解过程复杂、繁琐、难于控制的问题，需探讨一种可行、快速、适于工业生产操作的技术，以控制酶解产物的水解过程，获取目标活性肽，从而实现酶解制备活性肽的规模化生产。
发明内容本发明的目的是针对酶解制备活性肽时存在酶解过程复杂、繁琐、难于控制的问题提出的，本发明可为胶原蛋白酶解制备活性肽的产业化生产过程提供辅助控制技术，从而按要求获取一定分子量大小的目标活性肽。(1)鱼皮胶原蛋白最佳水解酶的确定选用胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，3942中性酶，碱性蛋白酶6种酶对鳕鱼皮胶原蛋白溶液进行水解(各种酶的水解条件见表1)，比较6种酶对鳕鱼皮胶原蛋白的水解效果。水解工艺如下鱼皮胶原蛋白—缓冲液调pH—保温—加酶水解—灭酶C100。C,5min)—离心(4000r/min，15min)—上清液定容—水解度测定。依上述酶解工艺进行酶解，其酶解效果见图l。六种蛋白酶中，水解强度最大的是碱性蛋白酶，水解度达12.84%。(2)鱼皮胶原蛋白酶解产物的制备在碱性蛋白酶最佳水解条件下，即水解温度45°C，pH8.5，加酶量90ug/g下，制备底物浓度为5%、不同酶解时间下的(1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h)酶解产物。(3)计算机辅助控制酶解过程，通过生物传感器检测酶解产物水解度大小，推算产物中活性肽分子量，将信息返还控制主机，终止酶解过程，超滤，低温喷雾干燥，获取目标活性肽。采用甲醛滴定法和生物传感器法，分别对不同时间段的酶解产物进行测定，得到酶解产物中谷氨酸含量与水解度的回归曲线(图2)，两者之间的回归方程为y=0.781lx+5.9172，相关系数检验r=0.9658，F值为69.46，表明Y(水解度)与X(谷氨酸含量)有十分显著的线性关系。根据水解度的大小本发明的核心技术是采用固定化酶生物传感器测定酶解物中的谷氨酸含量，然后依此推导出水解度和活性肽相对分子量大小，并通过生物传感装置，与微机联机，实现计算机辅助控制酶解过程，获取不同相对分子量的活性肽。具体实施例方式将鳕鱼皮胶原蛋白溶于0.02mol/L,PH为6.5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为3%"/"的溶液，在45。C水浴下，加入90ug/g碱性蛋白酶恒温搅拌酶解，酶解过程中，采用谷氨酸氧化酶生物传感器检测酶解产物水解度及相对分子量，达到目标活性肽分子范围后，终止酶解过程，超滤，低温干燥，可得到相对分子章范围在1000-10000Da的系列活性肽。工作流程如图3所示，具体实施过程见图4。附图简要说明图l是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，3942中性酶，碱性蛋白酶6种蛋白酶对鳕鱼皮胶原蛋白的水解效果，以水解度为指标。图2是酶解产物中谷氨酸含量与水解度的关系曲线。图3是计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的工作流程图。图4是活性肽制备具体实施过程图。表l六种蛋白酶的水解条件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.一种计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的方法。将鳕鱼皮胶原蛋白溶于0.02mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为3％(w/v)的溶液，调节pH值至8.5，在45℃水浴下，加入90ug/g碱性蛋白酶恒温搅拌酶解，酶解过程中，采用谷氨酸氧化酶生物传感器检测酶解产物水解度及相对分子量，谷氨酸含量与水解度的之间的回归方程为y＝0.7811x+5.9172，相关系数检验r＝0.9658，F值为69.46。达到目标活性肽分子范围后，终止酶解过程，超滤，低温干燥，可得到相对分子量范围在1000-10000Da的系列活性肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于本发明的核心技术是采用固定化酶生物传感器测定酶解物中的谷氨酸含量，然后依此推导出水解度和活性肽相对分子量大小，并通过生物传感装置，与微机联机，实现计算机辅助控制酶解过程，获取不同相对分子量的活性肽。3.根据权利要求1所述的方法，酶解鱼皮胶原蛋白制备活性肽的最佳水解酶类为碱性蛋白酶。4.根据权利要求1所述的方法，酶解鱼皮胶原蛋白制备活性肽的碱性蛋白酶的最佳水解条件为底物浓度为pH值至8.5，温度45°C，底物浓度3%(w/v)时，加入碱性蛋白酶的量为90ug/g。全文摘要一种计算机辅助控制定向酶解制备鱼皮胶原活性肽的方法。将鳕鱼皮胶原蛋白溶于0.02mol/L，pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为3％(w/v)的溶液，在45℃水浴下，加入90μg/g碱性蛋白酶恒温搅拌酶解，酶解过程中，采用谷氨酸氧化酶生物传感器检测酶解产物水解度及相对分子量，谷氨酸含量与水解度的之间的回归方程为y＝0.7811x+5.9172，相关系数检验r＝0.9658，F值为69.46。达到目标活性肽分子范围后，终止酶解过程，超滤，低温干燥，可得到相对分子量范围在1000-10000Da的系列活性肽。本发明能实现计算机辅助控制酶解过程，可为活性肽的规模化生产提供技术支持。本发明的核心技术是采用固定化酶生物传感器测定酶解物中的谷氨酸含量，然后依此推导出水解度和活性肽相对分子量大小，并通过生物传感装置，与微机联机，实现计算机辅助控制酶解过程，获取不同相对分子量的活性肽。文档编号A23J1/00GK101233895SQ20071001496公开日2008年8月6日申请日期2007年6月16日优先权日2007年6月16日发明者刘尊英,张朝辉,李八方,雪赵申请人:中国海洋大学