专利名称：草酸诊断/测定试剂盒及草酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种草酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定草酸浓 度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
草酸作为一种最简单的二元羧酸，普遍存在于植物界中，植物草酸具有 重要的生理功能，并且在植物抗逆性中发挥积极作用。草酸多以钾盐或转 盐的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中却以游离酸的形式存在，草酸有毒， 能溶解于水。草酸是一种重要的化工原料，广泛用于医药、染料、涂料、 稀土金属的分离和提纯以及衣物的漂白。
测定草酸的方法有离子色谱法、电导离子色谱法、HPLC方法。临床
上大多数结石属草酸钙结石。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰 胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定草酸浓度 的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的草酸诊断/测定试剂盒， 采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行 草酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应 用。本发明草酸浓度测定方法原理如下
草酸+氧草酸氧化酶 二氧化碳+过氧化氢 二氧化碳+乙酰辅酶八+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶
丙酮酸+辅酶八+辅酶
这种方法应用草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4)偶联丙酮酸脱 氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反应连续监测法/终点比 色法。草酸氧化酶酶解草酸反应产生二氧化碳，再通过偶联丙酮酸脱氢酶 的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm 处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/ 速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算草酸的浓度大 小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明草酸诊断/测定试剂盒 较为理想-
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
乙酰辅酶A 20 mmol/L
本发明的草酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-
.缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体
试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙酰辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。
还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙酰辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶。
还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A在试剂1、试剂 2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定草酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的草酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
乙酰辅酶A 20 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测草酸样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度 大小。 实施例二
本实施例的草酸诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 还原型辅酶
乙酰辅酶A
50 mmol/L
0.25 mmol/L
20 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
草酸氧化酶
丙酮酸脱氢酶
500 mmol/L 10000U/L 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37t;，反应时间10分钟，起始吸光
度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测草酸样品与试 剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟 时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度 大小。 实施例三
本实施例的草酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100 mmol/L稳定剂
还原型辅酶
乙酰辅酶A
50 mmol/L
0.25 mmol/L
20 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
丙酮酸脱氢酶
500 mmol/L 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
10000U/L
:试剂，可以直接使用。
草酸氧化酶 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体
测定草酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应时间 IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测草酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向 为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度 大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的草酸浓度测定方法，其方法原理如下草酸+氧 草酸氧化酶 二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸+辅酶A+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出草酸的浓度大小测定结果。
2. —种草酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20--500 mmol/L稳定剂还原型辅酶草酸氧化酶丙酮酸脱氢酶乙酰辅酶A1-—4000 mmol/L0.1-0.35mmol/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L1-50 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅 酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅 酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙酰辅 酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组 成。还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅酶A在试剂1 或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰辅 酶A组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙酰辅 酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3， 由缓冲液、稳定剂、草酸氧化酶组成。还原型辅酶、草酸氧化酶、丙酮 酸脱氢酶、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述草酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 齐!J 1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的草酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定草酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、乙酰辅酶A、草酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出草酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101329328SQ200710024719
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司