专利名称：蔗糖酶诊断/测定试剂盒及蔗糖酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种蔗糖酶诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定 蔗糖酶活性浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景蔗糖酶(sucrase)的功能为将蔗糖水解成D-果糖和D-葡萄糖，又 称为转化酶(invertase)或蔗糖酶(saccharase)。蔗糖酶-异麦芽糖酶 缺乏，已知人类一旦缺少其中一种酶，就会产生对二糖无耐性的遗传 病，有可能它们是同在一个蛋白质上，属单基因控制。蔗糖酶在高等 植物蔗糖代谢中起着关键的作用。蔗糖酶的检测方法有(i) Nelson法，其原理是蔗糖酶可将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖在碱性溶液中能将CU2还原；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物(砷钼蓝)，在510nm波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的浓度。(2)水杨酸法蔗糖酶能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸共热 后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和 棕红色物质颜色深浅程度成一定比例。(3)用邻甲苯胺试剂比色测定。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定蔗糖酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该 方法的蔗糖酶诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分 析仪或半、全自动生化分析仪上进行蔗糖酶活性浓度测定，而且测定 速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明蔗糖酶活性浓度测定方法原理如下-蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+ D-果糖 D-果糖+还原型辅酶甘露醇脱氢酶甘露醇+辅酶这种方法应用蔗糖酶(sucrase; EC 3.2丄48)偶联甘露醇脱氢酶 (Mannitol dehydrogenase; EC U丄138; EC 1.1.1.67)酶促反应连续 监测法。蔗糖酶酶解蔗糖反应产生果糖，再通过偶联甘露醇脱氢酶的 作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在 340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度 下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算蔗糖酶 的活性浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明蔗糖酶诊断/测定试剂较为理想缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L蔗糖 30 mmol/L甘露醇脱氢酶 10000 U/L本发明的蔗糖酶诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖。 试剂2缓冲液、稳定剂、甘露醇脱氢酶。 还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖在试剂1或试剂2中的位置可以 不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、蔗糖。 试剂3缓冲液、稳定剂、甘露醇脱氢酶。 还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖在试剂l、试剂2或试剂3中的 位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定蔗糖酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L蔗糖 30 mmol/L甘露醇脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖 酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延 迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出蔗糖酶 的活性浓度大小。 实施例二本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为双试剂，包括:试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液—稳定剂还原型辅酶画mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 30 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L甘露醇脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖 酶样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下 降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K 值—2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出蔗糖酶 的活性浓度大小。 实施例三本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1 -三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 还原型辅酶 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 蔗糖50 mmol/L 0.25 mmol/L100 mmol/L30 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L500 mmol/L 10000 U/L稳定剂甘露醇脱氢酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定蔗糖酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值—2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出蔗糖酶的活性浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖酶活性浓度测定方法，其方法原理如下蔗糖 蔗糖酶 D-葡萄糖+D-果糖D-果糖+还原型辅酶 甘露醇脱氢酶 甘露醇+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出蔗糖酶的活性浓度大小结果。
2. —种蔗糖酶诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L蔗糖 1- 50mmol/L甘露醇脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖组成单剂试 剂。
4. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖组成双剂试 齐0;试剂l,由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘露醇脱氢酶组成。还原型辅酶、甘露醇脱氢 酶、蔗糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖组成多剂试 剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓 冲液、稳定剂、蔗糖组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、甘露醇脱 氢酶组成。还原型辅酶、甘露醇脱氢酶、蔗糖在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1一4000 mmol/L或0.1%-100°/。体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖酶诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、蔗糖、甘露醇脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出蔗糖酶的活性浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101329263SQ20071002473
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司