专利名称：蔗糖酶诊断/测定试剂盒及蔗糖酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种蔗糖酶诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖 酶活性浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景蔗糖酶(sucrase)的功能为将蔗糖水解成D-果糖和D-葡萄糖，又称为 转化酶(invertase)或蔗糖酶(sacchamse)。蔗糖酶-异麦芽糖酶缺乏，已 知人类一旦缺少其中一种酶，就会产生对二糖无耐性的遗传病，有可能它 们是同在一个蛋白质上，属单基因控制。蔗糖酶在高等植物蔗糖代谢中起 着关键的作用。蔗糖酶的检测方法有(1) Nelson法，其原理是蔗糖酶可将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖在碱性溶液中能将CU 2还原；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物(砷钼蓝)，在510nm波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的浓度。(2)水杨酸法蔗糖酶能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的 氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度 成一定比例。(3)用邻甲苯胺试剂比色测定。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测4还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变^:，得以测 定蔗糖酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的蔗糖 酶诊断/测定试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行蔗糖酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本发明蔗糖酶活性浓度测定方法原理如下 蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+ D-果糖 D-果糖+辅酶果糖脱氢酶脱氢果糖+还原型辅酶这种方法应用蔗糖酶(sucrase; EC3.2丄48)偶联果糖脱氢酶(Fructose dehydrogenase; EC 1.1.1.124; EC 1.1.99.11)酶促反应连续监测法。蔗糖酶 酶解蔗糖反应产生果糖，再通过偶联果糖脱氢酶的作用，最终将辅酶(在 340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从 而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处 吸光度上升的速度，可以测算蔗糖酶酶的活性浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明蔗糖酶诊断/测定试剂 较为理想缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500 mmol/L3 mmol/L 30 mmol/L果糖脱氢酶 卯00 U/L本发明的蔗糖酶诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖。 试剂2缓冲液、稳定剂、果糖脱氢酶。 辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2缓冲液、蔗糖。 试剂3缓冲液、稳定剂、果糖脱氢酶。辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定蔗糖酶活性浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一、本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L庶糖 30 mmol/L果糖脱氢酶 9000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖酶样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1 分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出蔗糖酶的活性浓 度大小。 实施例二本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为双试剂，包括三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 30 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L果糖脱氢酶 9000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖酶样品与试 剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟 时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出蔗糖酶的活性浓 度大小。 实施例三本实施例的蔗糖酶诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂50 mmol/L试剂2mmol/L(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L30 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 500 mmol/L9000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定蔗糖酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反 应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm,测试副波长405nm， 被测蔗糖酶样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右， 理论K值2170。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出蔗糖酶的活性浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖酶活性浓度测定方法，其方法原理如下蔗糖 蔗糖酶 D-葡萄糖+D-果糖D-果糖+辅酶 果糖脱氢酶 脱氢果糖+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出蔗糖酶的活性浓度大小测定结果。
2. —种蔗糖酶诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmol/L辅酶 1- 6 mmol/L蔗糖 1- 50mmol/L果糖脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖组成双剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、果 糖脱氢酶组成。辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖在试剂1或试剂2中的位置可
5. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、果糖脱氢酶、蔗糖组成多剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、蔗糖组 成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、果糖脱氢酶组成。辅酶、果糖脱氢酶、 蔗糖在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述蔗糖酶诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖酶诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、蔗糖、果糖脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出蔗糖酶的活性浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101329264SQ20071002473
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司