专利名称：非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法
技术领域：
本发明涉及植物快速繁殖领域，具体的说，涉及一种非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法。
背景技术：
小油桐(Jatropha curcas L.)，又名麻疯树、小桐子、绿玉树、芙蓉树、膏桐、黑皂、亮桐、臭油桐、青桐木、黄肿树、水漆、桐油树、假花生树、麻烘罕等，为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)落叶灌木或小乔木，原产于美洲，现广泛分布于热带、亚热带及干热河谷地区，在我国主要分布于广东、海南、福建、台湾、广西、云南、贵州、四川等地(中国植物志编委会.中国植物志[M].北京科学出版社，147-148.)。小油桐具有很高的经济价值。其全株可入药，性味涩、微寒、有毒(孔令义，闵知大，史剑侠等.麻疯树根的化学成分研究[J].植物学报，1996，38(2)161-166.)，在民间常被用于消肿、镇痛、止血、消毒、杀虫、止痒、消除疣体、催吐泄泻、麻醉、利尿、促进伤口愈合和终止妊娠等(刘永红.小桐子的利用价值与栽培技术[J].经济林研究，2006，24(4)74-76.)，小油桐茎叶提取物还被用于防治病虫害(李静，吴芬宏，陈延燕等.麻疯树种子提取物对几种害虫的杀虫活性[J].农药，2006，45(1)57-58，65.)。与此同时，小油桐种子含油率高达40～60％(Openshaw K.A review of Jatropha curcasAnoil plant of unfulfilled promise[J].Biomass and Bioenergy，2000，19(1)1-15.)，且种子油稍作加工就可作为柴油的替代品，是理想的生产生物柴油的能源植物，在原油日益匮乏的今天备受关注，联合国已经将小油桐广泛用于亚热带、干热河谷贫困地区的生态建设，作为扶贫的重大项目加以扶持并获得成功(何文淑，肖荣贵，杨晓琼等.麻疯树在贫困地区农村发展和生态建设中的开发前景[J].中国中医药信息杂志，2002，9(10)33-36.)。我国2006年发布的“关于发展生物能源和生物化工财税扶持政策的实施意见”(财建 702号)中，明确提出鼓励利用小油桐、黄连木等木本油料树种为原料加工生产生物能源。随后国家发改委公布的批复实施2006年24项生物质工程高技术产业化专项中有2项专门支持建立小油桐大规模种植基地。
目前，小油桐的繁殖栽培主要采用传统的种子繁殖播种方法和扦插繁殖育苗方法(林娟，周选围，唐克轩等.麻疯树植物资源研究概况[J].热带亚热带植物学报，2004，12(3)285-290.；施宗明，李云，罗玉兴等.能源植物小桐子的开发利用和栽培研究.云南师范大学学报，1992，12(2)31-38.)。这两种方法存在如下问题(1)靠自然生长、种子繁殖小油桐的速度慢、效率低。小油桐自播种到成熟结果一般需要1-3年，第5年才进入盛产期，国内目前种植的少量小油桐难以在短期内提供足够的种子用于大规模种植基地建设。(2)种子繁殖播种方法不利于优良性状的保持。(3)扦插繁殖育苗方法需要20～40cm长、直径2cm左右的小油桐枝条作繁殖单位材料(袁理春，徐中志，武逵等.麻疯树种植技术[J].云南农业科技，2006，(1)58.)，小油桐属于灌木或小乔木，国内目前种植的少量小油桐同样难以提供足够的种质材料来满足建设大规模种植基地和荒山造林的需要。(4)种子播种和扦插育苗方法受季节、地域等自然因素的影响大，其操作有严格的时空要求。
为了解决传统繁殖栽培方法存在的问题，有研究者进行了试管苗快速繁殖方法的研究，分别用茎段、胚芽、上胚轴、下胚轴、子叶、胚乳、叶片、叶柄等作外植体，成功地诱导再生了小油桐完整植株(陆伟达，魏琴，唐琳等.麻疯树愈伤组织的诱导及快速繁殖[J].应用与环境生物学报，2003，9(2)127-130.；魏琴，陆伟达，廖毅等.从麻疯树上胚轴外植体再生植株(英文)[J].植物生理与分子生物学学报，2004，30(4)475-478.；陈金洪，高敏，黄记生.麻疯树茎段离体培养及快速繁殖研究[J].广西农业科学，2006，37(3)221-223.；侯佩，张淑文，杨琳等.麻疯树胚乳愈伤组织诱导及其污染消除[J].应用与环境生物学报，2006，12(2)264-268.；李化，曾妮，贾勇炯等.麻疯树的促腋芽分枝快繁及生根诱导[J].四川大学学报(自然科学版)，2006，43(5)1116-1120.；秦虹，宋松泉，龙春林等.小桐子的组织培养和植株再生[J].云南植物研究，2006，28(6)649-652.)。虽然试管苗快繁方法较之传统繁殖栽培方法，提高了个体繁殖速度，避免了个体繁殖受季节、地域等自然因素的影响和限制，但操作复杂繁琐，植物需要严格无菌的生长环境，生产成本高，并且将试管苗移栽至土壤时成活率较低。此外，组织培养过程中，试管苗长时间接触高浓度细胞分裂素、细胞生长素等植物生长调节剂，易发生变异，导致部分优良性状的丧失。因此试管苗快速繁殖方法也难以满足大规模造林工程对小油桐树苗数量和质量的需求。
植物非试管快繁技术(The technique of efficient and rapid non-tubeplant cloning；TERNPC)(闫志刚，蒙爱东，刘园.植物非试管快繁技术在药用植物上的运用[J].广西医学，2006，28(6)944-946.)是在传统扦插育苗技术与组织培养技术基础上发展起来的一项新技术，是在人工控制的光照、温度、湿度条件下，结合植物生长激素，让植物的根原基快速形成、根系充分发育的技术，它可使植株数量在较短时期内实现几何级倍增，该技术对于具有经济价值植物的快速推广和产业化生产具有重要意义。
如能将植物非试管快繁技术应用于小油桐幼苗的繁殖，那将具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术存在的问题，提供一种繁殖速度快，不受季节、地域等自然因素影响，变异率低，步骤简单，成本低的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法。
为了实现上述目的，本发明的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法采用如下步骤以灭菌后的长2～3cm、携带腋芽的小油桐微茎段作外植体；密封其形态学上端切口，将其形态学下端切口浸泡于吲哚丁酸(IBA)溶液后，扦插于沙盘中，施以营养液保持沙盘湿润，在温度25～28℃，相对湿度70～80％，光照强度2000～3000lx，光周期12h光照/12h黑暗的条件下培养16.2～20.2天，即可生根、再生成完整植株。
在上述方法中，所述携带腋芽的微茎段优选1-2年生小油桐枝条。
在上述方法中，所述营养液优选1/2MS基本培养基(桂耀林，马诚.植物组织培养[M].北京科学出版社，1985，p23-24)，pH 5.8～6.0，其含有浓度减半的Murashige&Skoog培养基大量元素、微量元素和铁盐成分。
在上述方法中，所述吲哚丁酸溶液的浓度优选0.2～2.0mg/L。
在上述方法中，所述密封优选用熔化的固体石蜡密封。
在上述方法中，所述吲哚丁酸溶液浸泡外植体的时间优选1小时。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明所用的外植体是2～3cm、携带腋芽的小油桐微茎段，与传统长20～40cm的扦插枝条相比，所用外植体数量减少约7～20倍，极大节约了种质材料、提高了快繁效率。
2.本发明所用的外植体截取自小油桐1-2年生枝条，该种枝条虽然已经木质化，但木质化程度不深、仍然保持旺盛生长状态，因而扦插穗易生根，且不易腐烂。
3.本发明所用的外植体截取自小油桐1～2年生枝条，栽培小油桐是灌木，需要不断及时修剪枝条，促进侧枝发育，保持合适的株高和树冠形状，以增加产量和便于果实采摘，因而外植体材料量大，且易于获得。
4.本发明采用1mg/L IBA溶液浸泡扦插穗1h，18.2±2.0天就可获得完整再生植株，不仅比传统繁殖栽培方法获得个体的速度快，而且比现有报道中试管苗快速繁殖方法获得完整再生植株的速度快。
5.本发明是在室内操作，因而不受季节、地域等自然因素的影响和限制，随时随地可进行繁殖。
6.本发明属于扦插繁殖技术范畴，由腋芽生长产生的枝条保持原无性系的基因型和表型，避免了自然种子繁殖不利于优良性状的保持和试管苗快繁方法获得的个体变异率高、在组织培养过程中可能会丧失部分优良性状的缺陷。
7.本发明采用了将微茎段扦插在沙盘中直接生根、一步成苗，因而避免了试管苗在培养瓶中根叶发育不完全和将试管苗从培养基中移栽至土壤过程中成活率低的缺陷。
8.本发明仅对微茎段进行灭菌处理，因而相比试管苗快速繁殖方法，无需严格的无菌组织培养操作，对快繁设备要求不高，不仅生产再生小苗成本低，而且操作方法简单，易于掌握，适用于小油桐的工厂化育苗，从而为荒山造林和建设大规模小油桐种植基地提供优良树苗。
图1为微茎段扦插于沙盘；图2为微茎段长出新叶；图3为小苗移栽入苗床。
具体实施例方式
实施例和比较例均采用1年生小油桐枝条截取微茎段快速繁殖。
灭菌处理将采来的枝条去叶，浸泡于消毒液[5％次氯酸钠(NaClO)，0.1％Tween-20]中20min，然后用自来水冲洗5遍；将枝条截成15～20cm左右较短茎段，于70％乙醇中浸泡10min，继而于消毒液中浸泡15min，用无菌水冲洗5次，以彻底洗去残余次氯酸钠。
配制细胞生长素吲哚丁酸(IBA)溶液；浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0(mg/L)。
配置营养液配制1/2MS基本培养基，pH 5.8～6.0，具体配方见表1。
表1
非试管快速繁殖将消毒后的茎段于无菌条件下切成2～3cm长的微茎段，每个微茎段上带一个腋芽，在无菌超净台上晾干；将微茎段的形态学上端切口浸蘸熔化的固体石蜡，迅速取出冷却凝固；将微茎段的形态学下端切口浸泡于含有不同浓度细胞生长素IBA的溶液中1h，然后扦插于沙盘中，施以营养液保持沙盘湿润(见图1)。保持光照强度约2000～3000lx，光照周期12h光照/12h黑暗，温度25～28℃，相对湿度70～80％。自第8天起，每天目测生根状况；第28天统计结果，计算生根率，测量新生根长度，采用新复极差法进行差异显著性分析。其中，总根长为一个微茎段上所有新生根长度的累加之和。统计结果见表2。
待微茎段新根长至0.5～1.0cm、生出1-2片新叶后(见图2)，将沙盘置于室外阴凉通风处炼苗2天，然后将再生小苗移栽入覆盖有营养土、透水性良好的苗床中(见图3)，待株高50～100cm时可定植大田。
表2
结果显示IBA浸泡有利于非试管快繁小苗的获得，相比实施例1～4和比较例1，实施例1-4在IBA浸泡条件下，小油桐微茎段的生根率比较高，生根比较快，根系比较发达，移栽后生长迅速。其中，实施例3的效果最显著，实施例3采用1mg/L IBA浸泡小油桐微茎段1h，生根率达96.7％，生根时间为18.2±2.0天，新生根的数量为6.3±1.8条，总根长达6.8±3.5cm。
权利要求
1.一种非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，其特征在于包括如下步骤以灭菌后的长2～3cm、携带腋芽的小油桐微茎段作外植体；密封其形态学上端切口，将其形态学下端切口浸泡于吲哚丁酸溶液中；浸泡完毕后扦插于沙盘中，施以营养液保持沙盘湿润，在温度25～28℃，相对湿度70～80％，光照强度2000～3000lx，每天光照半天和黑暗半天的条件下培养16.2～20.2天，即可生根、再生成完整植株。
2.根据权利要求1所述的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，其特征在于所述微茎段截取自小油桐1～2年生枝条。
3.根据权利要求1所述的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，其特征在于所述吲哚丁酸溶液的浓度为0.2～2.0mg/L。
4.根据权利要求1所述的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，其特征在于所述营养液是1/2MS基本培养基，pH 5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，其特征在于所述密封是用熔化的固体石蜡密封。
6.根据权利要求1所述的非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，其特征在于所述吲哚丁酸溶液浸泡外植体的时间为1小时。
全文摘要
本发明公开了一种非试管快速繁殖小油桐幼苗的方法，它包括以灭菌后的长2～3cm、携带腋芽的小油桐微茎段作外植体；密封其形态学上端切口，将其形态学下端切口浸泡于吲哚丁酸溶液后，扦插于沙盘中，施以营养液保持沙盘湿润，在温度25～28℃，相对湿度70～80％，光照强度2000～3000lx，光周期12h光照/12h黑暗的条件下培养16.2～20.2天，即可生根、再生成完整植株。本发明的繁殖速度快，不受季节、地域等自然因素影响，变异率低，步骤简单且成本低。
文档编号C12N5/04GK101057557SQ20071002838
公开日2007年10月24日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者王兆玉, 徐增富, 廖文波, 罗莉 申请人:中山大学