专利名称：一种陈香茶菌种的提取及培养方法
技术领域：
本发明涉及茶叶微生物领域，具体涉及一种陈香茶菌种的提取与培养方法。
背景技术：
陈香茶是广东的特色茶之一，陈香茶通常采用岭头单纵茶为原料，经前处 理、发酵、循环渥堆、渥堆后处理、压饼成型、干燥等工序加工而成，其中循 环渥堆是陈香茶加工中一道最关键的工序，对陈香茶品质的形成起着重要的作 用。渥堆就是将经前处理后的茶叶堆放在一起，用布密封好，在一定湿度的条 件堆放一段时间，让茶叶通过温度的物理作用产生生物、化学作用，从而使陈 香茶的特征成分发生变化，达到滋味醇和、香气纯正、汤色黄红明亮的陈香茶 品质特征。目前陈香茶加工， 一是采取在自然条件下自然陈放几年或几十年，茶叶通 过慢发酵氧化而形成陈香茶，发酵速度非常慢，茶叶品质需要漫长的时间才会 提高，而且还会受存放条件的温度、湿度和通风程度的影响，造成有些茶叶经 长时间存放而变质。二是采取渥堆发酵，通过增加其渥堆时的温度、湿度来发 酵，使茶叶快速转化为陈香茶，这种方法的发酵虽然较快，但这种只靠温度和 湿度来控制茶叶氧化的方法，所得的陈香茶通常存在香味不够浓郁、滋味不够 甘醇，品质不够高等缺点。陈香茶的加工过程中，循环渥堆的作用主要是酶、微生物和湿与热等三大 作用，贯穿于整个加工过程，其中微生物的作用对陈香茶的品质的影响最大，
它通过生化动力(胞外酶)、物化动力(微生物热)以及微生物自身代谢的综合 作用，形成了陈香茶色、香、味的品质风味，故而可利用微生物菌种加快渥堆 的时序，同时又能使得制备过程中有效控制陈香茶的独特品性。渥堆自身可以 产生由多种菌种组成微生物，但渥堆过程中产生的微生物的数量不多，不能起 到渥堆应有的作用，甚至由于渥堆条件的变化，微生物数量变化不定，其菌种 的组成比例也变化不定，造成陈香茶加工过程的品质不稳定，甚至严重影响陈 香茶成品的品质、风味等。发明内容本发明的目的是针对现有陈香茶加工过程中存在的问题，提供一种从陈香 茶渥堆过程提取和培养陈香茶菌种的方法。以备有效制备陈香茶所用。 为了实现上述发明目的，采用的技术方案如下一种陈香茶菌种的提取及培养方法，包括提取及培养两道工序，所述提取 工序为提取茶叶原料在自然发酵过程中生长的微生物，所述培养工序采用培养 基对所提取的微生物进行培养，并制作成菌种。所述茶叶原料为以一梢驻芽中大开面二、三叶的岭头单枞茶鲜叶按绿茶制造工艺制备得绿茶，再于85 90。C加热40 50分钟，杀死残留在茶叶上的微生物。本发明所述提取工序具体细化如下将经茶叶原料放入一个密封的容器中，加无菌水，使茶叶含水量为25~30%， 在36 3纩C下，发酵6 8天，直至茶叶表面长满微生物；将表面长满微生物的茶叶取出，放入生理盐水中，振荡150 180分钟，让 茶叶上的微生物转移到溶液中，得到陈香茶菌溶液。
所述提取工序还同时将表面长满微生物的部分茶叶取出，于90~95"干燥60~70分钟，以供制备茶汤溶液所用。本发明所述培养工序具体细化如下培养基的制备按牛肉膏0.75 0.80g，蛋白胨1.5 2.0g，氯化钠0.75~0.80g， 琼脂3.0 3.5g,茶汤溶液150~160ml， pH=7.5~7.6组成的培养基配方配制；陈香茶菌的培养将适量陈香茶菌溶液缓缓注入盛有培养基的平板中，摇 匀，密封置于36~38"条件下暗培养，4~5天后菌落长满整个平板，得到用于 陈香茶制备的菌种。在制备培养基时还添加重量比0.2%的磷酸二氢钾，以对培养基pH值的变 化能起缓冲作用，防止菌种在保存过程中积累过多的酸。培养工序所需的茶汤溶液的制备过程为将干燥过的茶叶30~40g,放入 1000ml的沸水中，在95X:中浸泡40 50分钟，每隔10分钟振荡摇动一次，冷 却后过滤，得到的滤液作为制备培养基所用。采用上述方案制得陈香茶菌种后，为了得到纯正的菌种，还包括菌种纯化 工序，所述菌种纯化工序挑取已制得的陈香茶菌种各菌落的少量菌丝体，接种 在培养基平板上，菌丝体在36 38'C条件下生长7-8天后，根据长出的各菌落 特点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致 时视为单一菌种的菌落。在菌种纯化工序后，还进行接种工序，所述接种工序选择单一菌落接入培 养基平板中，在36 38'C条件下培养7 8天，按此种方法进行多次纯化培养得 到大量的纯化菌株。在接种工序后，还进行菌种保存工序，所述菌种保存工序将菌种接种在适
宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移入4。C 5'C的低温下保藏，每隔2 3个月转一次。本发明的陈香茶菌种的提取与培养的技术参数均采用计算机数码解析技术 和正交试验进行优化所得，工序清晰，制作容易。该方法制得的陈香茶菌种， 可用于由岭头单枞茶为原料加工成陈香茶的生产中，可使陈香茶渥堆过程中微 生物数量基本恒定，其菌种的组成比例保持稳定，从而保持陈香茶品质稳定， 提高陈香茶的品质和风味。
图1为本发明的制备工序流程图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明。本发明的制备工序流程图如附图l所示，具体包括如下步骤(1) 选取原料以一梢驻芽中大开面二、三叶的岭头单极茶鲜叶为原料。(2) 原料处理将岭头单枞茶鲜叶按绿茶制造工艺制备得绿茶，于85~90 。C加热40~50分钟，杀死残留在茶叶上的微生物。(3) 陈香茶菌的提取将经步骤(2)处理过的原料放入一个密封的容器中，加无菌水，使茶叶含水量为25~30%，在36 38。C下，发酵6 8天，直至茶 叶表面长满微生物。将表面长满微生物的茶叶取出，放入生理盐水中，振荡 150~180分钟，让茶叶上的微生物转移到溶液中，得到陈香茶菌溶液，备用。 同时将表面长满微生物的茶叶取出，于90~95°(:干燥60~70分钟，备用。(4) 陈香茶菌的培养包括茶汤溶液的制备，将经步骤(3)干燥过的茶叶30~40g，放入1000ml
的沸水中，在95。C中浸泡40 50分钟，每隔10分钟振荡摇动一次，冷却后过 滤，得到的滤液为茶汤溶液；培养基的制备按牛肉膏0. 75 0.80g，蛋白胨1. 5 2.0g，氯化钠0. 75~0.80g， 琼脂3.0 3.5g，茶汤溶液150 160ml， pH = 7. 5~7.6组成的培养基配方配制；菌的培养将由步骤(3)得到的陈香茶菌溶液用无菌移液管吸取lml缓 缓注入盛有上述培养基平板中，摇匀，密封置于36-38。C条件下暗培养，4~5 天后菌落长满整个平板，得到用于陈香茶制备的菌种。(5) 菌种纯化根据步骤(4)得到的陈香茶菌种的初分菌落的形态特征， 用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的培养基上(每平板内接 种3个菌落)，菌丝体在36 38'C条件下生长7 8天后，根据长出的各菌落特点 进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时视 为单一菌种的菌落。陈香茶菌有三种主要的单一菌落，包括丝状菌，其呈长条丝状形态；网状 菌，呈条状网状形态，与丝状菌较相似；圆球菌，类似于葡萄串的圆球形状。 陈香茶菌种中丝状菌、网状菌和圆球菌所占的比例为2.5~3.0: 3.0~3.5: 4.0-4.5。(6) 接种选择单一菌落用划线法接入已备好培养平板中，在36 38。C条 件下培养7 8天，按此种方法进行多次纯化培养得到大量的纯化菌株。三种菌 落分开接种培养，使用时再根据其比例混合。(7) 菌种的保存采用斜面低温保藏法来保存菌种。将菌种接种在适宜的 固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移入4。C 5。C 的低温下保藏，以后每隔2 3个月转一次。下面分别列举三个实施例对本发明做出进一步的说明。
实施例1的具体步骤如下(11) 原料选取以一梢驻芽中大开面二、三叶的岭头单揪茶鲜叶为原料。(12) 原料处理将岭头单秋茶鲜叶按绿茶制造工艺制备得绿茶，于85。C 加热40分钟，杀死残留在茶叶上的微生物。(13) 陈香茶菌的提取将经步骤(12)处理过的原料放入一个密封的容器中，加无菌水，使茶叶含水量为25%，在37'C下，发酵6天，直至茶叶表面 长满微生物。将表面长满微生物的茶叶取出，放入生理盐水中，振荡150分钟，让茶叶 上的微生物转移到溶液中，得到陈香茶菌溶液，备用。将表面长满微生物的茶叶取出，于9(TC千燥60分钟，备用。(14) 陈香茶菌的培养-包括茶汤溶液的制备将经步骤(13)处理，干燥过的茶叶30g，放入1000ml 的沸水中，在95"C中浸泡40分钟，每隔IO分钟振荡摇动一次，冷却后过滤， 得到的滤液作为培养基用。培养基的制备按牛肉膏0.75g，蛋白胨1.5g，氯化钠0.75g，琼脂3.0g， 茶汤溶液150ml， pH = 7. 5~7.6组成的培养基配方配制。菌的培养将由步骤(13)得到的陈香茶菌溶液用无菌移液管吸取1 ml缓 缓注入盛有上述培养基平板中，摇匀，密封置于37。C条件下暗培养，4天后菌 落长满整个平板，得到用于陈香茶制备的菌种。(15) 菌种纯化根据步骤(14)得到的陈香茶菌种的初分菌落的形态特 征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的培养基上(每平 板内接种3个菌落)，菌丝体在37。C条件下生长7天后，根据长出的各菌落特
点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时 视为单一菌种的菌落。陈香茶菌有三种主要的单一菌落。(16) 接种在上述培养皿中选择单一菌落用划线法接入已备好培养平板 中，在37X:条件下培养7天，按此种方法进行多次纯化培养得到大量的纯化菌 株。三种菌落分开接种培养，使用时按陈香茶菌种中丝状菌、网状菌和圆球菌所占的比例为2.5: 3.5: 4.0。(17) 菌种的保存采用斜面低温保藏法来保存菌种。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移入5"的 低温下保藏，以后每隔2 3个月转一次。为防止菌种在保存过程中积累过多的 酸，在配制保存母种培养基时添加0.2%磷酸二氢钾，对培养基pH值的变化能起缓冲作用。实施例2的具体歩骤如下(21) 原料选取以一梢驻芽中大开面二、三叶的岭头单揪茶鲜叶为原料。(22) 原料处理将岭头单枞茶鲜叶按绿茶制造工艺制备得绿茶，于9(TC 加热50分钟，杀死残留在茶叶上的微生物。(23) 陈香茶菌的提取将经步骤(22)处理过的原料放入一个密封的容 器中，加无菌水，使茶叶含水量为30%，在38。C下，发酵8天，直至茶叶表面 长满微生物。将表面长满微生物的茶叶取出，放入生理盐水中，振荡180分钟，让茶叶 上的微生物转移到溶液中，得到陈香茶菌溶液，备用。将表面长满微生物的茶叶取出，于95。C干燥70分钟，备用。(24) 陈香茶菌的培养
包括茶汤溶液的制备将经步骤(23)处理，干燥过的茶叶40g，放入1000ml 的沸水中，在95。C中浸泡50分钟，每隔10分钟振荡摇动一次，冷却后过滤， 得到的滤液作为培养基用。培养基的制备按牛肉膏0.80g，蛋白胨2,0g，氯化钠0.80g，琼脂3.5g， 茶汤溶液160ml， pH二7.6组成的培养基配方配制。菌的培养将由步骤(23)得到的陈香茶菌溶液用无菌移液管吸取1 ml缓 缓注入盛有上述培养基平板中，摇匀，密封置于38。C条件下暗培养，5天后菌 落长满整个平板，得到用于陈香茶制备的菌种。(25) 菌种纯化根据歩骤(24)得到的陈香茶菌种的初分菌落的形态特 征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的培养基上(每平 板内接种3个菌落)，菌丝体在38。C条件下生长8天后，根据长出的各菌落特 点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时 视为单一菌种的菌落。陈香茶菌有三种主要的单一菌落。(26) 接种在上述培养皿中选择单一菌落用划线法接入已备好培养平板 中，在38"C条件下培养8天，按此种方法进行多次纯化培养得到大量的纯化菌 株。三种菌落分开接种培养，使用时按陈香茶菌种中丝状菌、网状菌和圆球菌 所占的比例为3.0: 3.0: 4.0。(27) 菌种的保存采用斜面低温保藏法来保存菌种。将菌种接种在适宜 的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移入4"的 低温下保藏，以后每隔2 3个月转一次。为防止菌种在保存过程中积累过多的 酸，在配制保存母种培养基时添加0.2%磷酸二氢钾，对培养基pH值的变化能 起缓冲作用。
实施例3的具体步骤如下(31) 原料选取以一梢驻芽中大开面二、三叶的岭头单枞茶鲜叶为原料。(32) 原料处理将岭头单揪茶鲜叶按绿茶制造工艺制备得绿茶，于9(TC加热45分钟，杀死残留在茶叶上的微生物。(33) 陈香茶菌的提取将经步骤(32)处理过的原料放入一个密封的容 器中，加无菌水，使茶叶含水量为30%，在36"下，发酵7天，直至茶叶表面 长满微生物。将表面长满微生物的茶叶取出，放入生理盐水中，振荡170分钟，让茶叶 上的微生物转移到溶液中，得到陈香茶菌溶液，备用。将表面长满微生物的茶叶取出，于9(TC干燥70分钟，备用。(34) 陈香茶菌的培养-包括茶汤溶液的制备将经步骤(33)处理，干燥过的茶叶40g，放入1000ml 的沸水中，在95t:中浸泡40分钟，每隔IO分钟振荡摇动一次，冷却后过滤， 得到的滤液作为培养基用。培养基的制备按牛肉膏0.75g，蛋白胨2.0g，氯化钠0.80g，琼脂3.0g， 茶汤溶液150ml， pH=7.6组成的培养基配方配制。菌的培养将由步骤(33)得到的陈香茶菌溶液用无菌移液管吸取1 ml缓 缓注入盛有上述培养基平板中，摇匀，密封置于36。C条件下暗培养，5天后菌 落长满整个平板，得到用于陈香茶制备的菌种。(35) 菌种纯化根据步骤(34)得到的陈香茶菌种的初分菌落的形态特 征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的培养基上(每平板 内接种3个菌落)，菌丝体在36。C条件下生长8天后，根据长出的各菌落特点
进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时视 为单一菌种的菌落。陈香茶菌有三种主要的单一菌落。(36) 接种在上述培养皿中选择单一菌落用划线法接入已备好培养平板中，在7i:条件下培养7天，按此种方法进行多次纯化培养得到大量的纯化菌 株。三种菌落分开接种培养，使用时按陈香茶菌种中丝状菌、网状菌和圆球菌 所占的比例为2.5: 3.0: 4.5。(37) 菌种的保存采用斜面低温保藏法来保存菌种。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上， 待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移入4°C的低温下保藏，以后每隔2 3个月转一次。为防止菌种在保存过程中积累过多的酸，在配制保存母种培养 基时添加0.2%磷酸二氢钾，对培养基pH值的变化能起缓冲作用。
权利要求
1、 一种陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于包括提取及培养两道工 序，所述提取工序为提取茶叶原料在自然发酵过程中生长的微生物，所述培养 工序采用培养基对所提取的微生物进行培养，并制作成菌种。
2、 根据权利要求1所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于所述茶叶原料为以一梢驻芽中大开面二、三叶的岭头单枞茶鲜叶按绿茶制造工艺制备得绿茶，再于85 9CrC加热40 50分钟，杀死残留在茶叶上的微生物。
3、 根据权利要求1或2所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于 所述提取工序具体细化如下将茶叶原料放入一个密封的容器中，加无菌水，使茶叶含水量为25~30%， 在36 38。C下，发酵6~8天，直至茶叶表面长满微生物；将表面长满微生物的茶叶取出，放入生理盐水中，振荡150-180分钟，让 茶叶上的微生物转移到溶液中，得到陈香茶菌溶液。
4、 根据权利要求3所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于所述 提取工序还同时将表面长满微生物的部分茶叶取出，于90~95"干燥60~70分 钟，以供制备茶汤溶液所用。
5、 根据权利要求4所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于所述 培养工序具体细化如下培养基的制备按牛肉膏0.75 0.80g，蛋白胨1.5 2.0g，氯化钠0.75~0.80g， 琼月旨3.0 3.5g,茶汤溶液150~160ml， pH=7.5~7.6组成的培养基配方配制；陈香茶菌的培养将适量陈香茶菌溶液缓缓注入盛有培养基的平板中，摇 匀，密封置于36~38匸条件下暗培养，4~5天后菌落长满整个平板，得到用于陈香茶制备的菌种。
6、 根据权利要求5所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于在制 备培养基时还添加重量比0.2%的磷酸二氢钾，以对培养基pH值的变化能起缓 冲作用，防止菌种在保存过程中积累过多的酸。
7、 根据权利要求6所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于所述 茶汤溶液的制备过程为将干燥过的茶叶30 40g，放入1000ml的沸水中，在95℃中浸泡40~50分钟，每隔10分钟振荡摇动一次，冷却后过滤，得到的滤液 作为制备培养基所用。
8、 根据权利要求7所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于还包 括菌种纯化工序，所述菌种纯化工序挑取已制得的陈香茶菌种各菌落的少量菌 丝体，接种在培养基平板上，菌丝体在36~38匸条件下生长7~8天后，根据长 出的各菌落特点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征 均表现一致时视为单一菌种的菌落。
9、 根据权利要求8所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于在菌 种纯化工序后，还进行接种工序，所述接种工序选择单一菌落接入培养基平板 中，在36 38℃条件下培养7~8天，按此种方法进行多次纯化培养得到大量的 纯化菌株。
10、 根据权利要求9所述的陈香茶菌种的提取及培养方法，其特征在于在 接种工序后，还进行菌种保存工序，所述菌种保存工序将菌种接种在适宜的固 体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移入4℃ 5℃的 低温下保藏，每隔2 3个月转一次。
全文摘要
本发明提供一种陈香茶菌种的提取及培养方法，包括提取及培养两道工序，所述提取工序为提取茶叶原料在自然发酵过程中生长的微生物，所述培养工序采用培养基对所提取的微生物进行培养，并制作成菌种。本发明的陈香茶菌种的提取与培养的技术参数均采用计算机数码解析技术和正交试验进行优化所得，工序清晰，制作容易。该方法制得的陈香茶菌种，可用于由岭头单枞茶为原料加工成陈香茶的生产中，可使陈香茶渥堆过程中微生物数量基本恒定，其菌种的组成比例保持稳定，从而保持陈香茶品质稳定，提高陈香茶的品质和风味。
文档编号A23F3/10GK101121921SQ20071002946
公开日2008年2月13日 申请日期2007年7月30日 优先权日2007年7月30日
发明者罗一帆, 旋 许 申请人:华南师范大学