专利名称：：一种根瘤固氮菌株系bxbl9及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种根瘤固氮菌株系BXBL9及其应用。
背景技术：
：生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一，它在生产实际中发挥着重要作用。共生固氮是生物固氮中最重要的一种。豆科植物与根瘤菌的共生由于具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强等特点,成为生物固氮研究的焦点。国内外大量试验证明，接种根瘤菌在多数土壤中可以提高豆科作物的产量和品质。接种高效根瘤菌，作为大豆增产的主要措施，在我国北方已得到了大面积的应用。当前，大豆已成为华南广大酸性缺磷红壤很有价值的豆科作物之一。长期以来，虽然大豆在酸性缺磷红壤区具有一定的种植面积，但由于南方土壤偏酸性，普通根瘤菌在南方地区鲜有应用。其中一个原因是接种根瘤菌剂，遇到了根瘤菌能否耐酸和耐铝的问题。为了提髙根瘤菌的结瘤率和固氮效果，必须选育耐酸、耐铝的根瘤菌株以适应酸性土壤条件，这样才能获得高产。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种根瘤固氮菌株系BXBL9，该根瘤固氮菌株系是慢生根痫菌屑的新菌株系，具有耐酸铝、高效固氮的特点。本发明的另一个目的是提供上述根痫固氮菌株系BXBL9在豆科植物共生固氮中的应用。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案来实现的木发明公开的根瘤固氮菌株系BXBL9于2007年7月28号保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCNO:M207122。一、根瘤固氮菌株系BXBL9的分离1)取新鲜根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；2)放入95%的酒精中处理3分钟，再放入0.1免HgCl2中，灭菌35分钟，取出后用无菌水冲洗56次；3)在用火焰灭过菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向YMA培养基表面划线，YMA培养基的配方如表1所示，倒置后在28'C下培养；表lYMA(YeastMannitolAgar)培养基配方(L")试剂名__试剂名_用量甘露醇10gK2ffi>040.25gMgS04.7H200.2gKH^Oj0.25gNaClO.lgCaC033g(保存时加)酵母粉_^_^_15g4)待长出菌体后，先根据以下两个方面初步判断是否为根瘤菌O)菌落形态根痫菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养35天菌落直径达24rnrn为快生型根瘤菌，培养710天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。②菌休形态标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察。根瘤菌为(0.50.9)X(1.20.3)^m的小杆菌。内常含P-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-),无芽孢，菌体单个或成对。5)根据上述两个方面，从平板上挑选形态上像根瘤菌的菌落在平板上划线培养。3天之后观察菌落情况，一直观察到15天，因为慢生根瘤菌需715天出现菌落。二、根瘤固氮菌株系BXBL9的性质1、形态特征本菌株在菌落形态上，均为慢生型，圆形较小、乳白色、半透明，粘质较多。在YMA平板上生长57天后的直径为0.82.0mm。2、培养特性该菌的最适生长条件为pH=7.0，温度28'C，转速180r/min。能够利用广泛的炭源和氮源。3、生理特性经革兰氏染色反应镜检均为G-,呈小短杆状。4、功能特性根瘤固氮菌株系BXBL9具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强、耐酸铝等特点。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的群体，对豆科植物的结瘤固氮有促进的作用。三、根瘤固氮菌株系BXBL9的16SrDNA序列测序为了鉴定根瘤菌的系统发育地位，对所分离的菌株16SrDNA序列进行测序。首先提取菌株的总DNA，然后进行PCR特异性扩增，PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检验后，用于序列测定。测序结果如SEQIDNO:l所示。从GenBank数据库中获取了8个参比菌株，应用软件GeneDoc和TREECONW对分离菌株和参比菌株的16SrDNA部分序列进行了分析，构建了分离菌株与标准菌株的系统发育关系图，得到反映待测大豆根瘤菌株与参比菌株之间进化与发育关系的系统发育树，从而确定分离出来的根瘤固氮菌株系BXBL9为慢生根瘤菌属(5ra办/"Afeo办/M/n)的新菌株系，并命名为华固2号。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明的根瘤固氮菌株系BXBL9具有耐酸铝、髙效结瘤的特性，接种该根瘤菌至少能够提高大豆产量20-30%,可用于实际生产；2.通过接种本发明的根瘤固氮菌株系BXBL9,能达到改善大豆氮营养，从而达到大豆高产并且培肥土壤的目的；3.本发明的根瘤固氮菌株系BXBL9适用于华南酸性土壤地区，作为大豆常规栽培的措施之一。图1为根瘤固氮菌株系BXBL9在YMA培养基上的菌落形态；图2为根瘤固氮菌株系BXBL9经革兰氏染色后在显微镜下的观察图像；图3为根瘤固氮菌株系BXBL9的16SrDNA部分序列分析系统发育树状图4为大试管纸培装置；其中，图3中方框内为根瘤固氮菌株系BXBL9。具体实施例方式实施例1根瘤固氮菌株系BXBL9的分离和纯化取新鲜根瘤，用水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分。先放入95%的乙醇中处理3分钟，取出用无菌水冲洗56次，再放入0.2%HgCl2灭菌5分钟，取出用无菌水冲洗56次。然后在用火焰灭过菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向YMA(表1)培养基表面划线，倒置后在28'C下培养。待长出菌体后，从平板上挑选形态上像根瘤菌的菌落在平板上划线培养。3天之后观察菌落情况，一直观察到15天，因为慢生根瘤菌需715天出现菌落。根据以下两个方面可初步判断是否为根瘤菌①菌落形态根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质或多或少。培养35天菌落直径达24mm为快生型根瘤菌，培养710天菌落才lmm的为慢生型根瘤菌。②菌体形态标记初步确认为根瘤菌菌落，从屮挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察。根瘤菌为(0.50.9)X(1.20.3)iiim的小杆菌。内常含P-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G')，无芽孢，菌体单个或成对。如菌落菌体均像根瘤菌，则将标记好的那个菌落接入试管斜面培养保存。木实施例的菌株均为慢生型，在菌落形态上为圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多；在YMA平板上生长57天后的直径为0.82.0mm(图1);最适生长条件为pH=7.0，温度28'C，转速180r/min，能够利用广泛的炭源和氮源；经革兰氏染色反应镜检均为G-,呈小短杆状(图2)。利用这个分离纯化的方法，经过若干代反复纯化，在固体培养基YMA(表l)中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经过回接试验验证其结瘤固氮能力，本实施例分离纯化到耐酸铝髙效根瘤固氮菌株系BXBL9。实施例2根瘤固氮菌株系BXBL9的16SrDNA序列测序提取菌株的总DNA,进行PCR特异性扩增，PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检验后，送到英骏公司进行序列测定。测序结果如SEQIDNO:l所示。从GenBank数据库中获取了8个参比菌株，应用软件GeneDoc和TREECONW对分离菌株和参比菌株的16SrDNA部分序列进行分析，构建分离菌株与标准菌株的系统发育关系图，如图3所示，从而确定分离出来的根瘤固氮菌株系BXBL9为慢生根瘤菌属(fira办rWzoW"m)的新菌株系，并命名为华固2号。实施例3回接试验回接试验复证采用上述的大试管纸培装置(图4)，大豆种子处理也如前所述。菌液培养:用接种环在试管中挑一环根瘤菌到TY液体培养基中，TY液体培养基的配方如表2所示，用棉塞塞好后，用牛皮纸密封，放在震荡器上培养至对数生长期(约46天)，培养温度为28'C。表2TY液体培养基(/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>接种处理将催好芽的种子放到培养皿中用菌液浸泡15分钟，用镊子将种苗栽种在滤纸与管壁之间，每棵种苗加入菌液l-2mL，保证每棵种苗的接菌量达到1.0乂109个以上。另设不接种处理作为对照。培养条件及测定指标培养条件如前所述，放在光照培养箱中培养。定期观察及补加营养液。移苗后30天收获，观察大豆的结痫情况。以磷效率差异显著的2个大豆基因型作为供试材料，其中巴西10号(BX10)为磷高效基因型，本地2号(BD2)为磷低效基因型。根痫菌采用回接时固氮酶活性较髙的华固2号(根瘤固氮菌株系BXBL9)，另设不接种作为对照。本试验设两个P水平(LP:2nmol/L;HP:1000nmol/L)，统一进行低氮处理(LN:50nmol/L)。营养液的pH值模拟酸性红壤中的酸度，调节pH值至5.5。每个处理设4个重复。从表3(不同营养条件下接种不同根瘤菌对大豆地上部干重的影响)和表4(低氮条件下接种不同根痫菌对地上部干重的影响)中可以看出，在低氮处理下，接种根瘤菌能显著提高大豆的地上部干重，并且不同品种对接种根瘤菌的反应也具有基因型差异。总体而言，本地2号接种根瘤菌的效果好于巴西10号。在LNLP条件下，接种华固2号对本地2号品种有较好的效果，与对照(LNLP不接种处理)相比提髙了7.59%;而在LNHP处理下，接种华固2号能显著提髙地上部干物重，与对照(LNHP不接种处理)相比提髙了51.90%(表3)。说明高磷有利于木地2号的接种效果。表3不同营养条件下接种不同根瘤菌对大豆地上部干重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注LNLP表示低弒低磷、LNHP表示低氮髙磷;表4低氮条件下接种不同根瘤菌对地上部千重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注LNLP表示低氮低磷、LNHP表示低敏髙磷；表中百分数为接种根瘤菌后与对照(LNLP不接种处理)相比提高的百分数；计算公式为:(R-CK)/CK*100%。实施例4田间接种试验本试验在广东省湛江市遂溪大华农场进行。播种时期为2007年1月2728日。本试验设有2个处理接根瘤固氮菌株系BXBL9(华固2号)与不接根瘤菌剂处理，同时按50kgP/ha的施肥量施用磷肥，磷肥以底肥的方式按照统一的标准一次性施入。本试验设3次重复。试验采取随机区组设计，起垄栽培，播种密度为40cmxi0cm(行距x株距)。播种、施肥、灌溉、杂草及病虫害按大豆常规管理执行。第一次田间调査在大豆的开花结实期进行，调査了单株平均株高、单株瘤重、结瘤数(结果见表5)、平均单株地上部干重、根干重、结荚数(结果见表6)。表5根瘤固氮菌株系BXBL9对大豆根瘤生长的影响测定指标根瘤个数(个)根痫干重(mg)株髙(咖)品种处理ck接种.ck接种_^_接种粤舂03-35~12.7±6.1540.6土2624.5±0.5828.3±0.91粤春04^S08.7±2.9079.9±42,826.67±0.8830.53±4.邻华春2号018.3±8.30142.8±65.229土1.2630.83±0.44从表5可见，接种根瘤菌株系BXBL9能够促使大豆结瘤。接种处理与不接种处理的根瘤个数与根瘤干重均存在着显著性差异。从单株根瘤个数和根瘤干重的结果来看，接种处理达到较显著水平(根瘤个数F产13.88科；根瘤干重F产10,25財)。由于湛江大华农场前作是甘蔗，土著根瘤菌几乎不存在，所以做了不接种处理的大豆没有结瘤。接种处理的单株平均株高要比不接种处理的平均株髙要髙--些，这有利于提髙大豆的产量。从试验结果说明施用根瘤固氮菌株系BXBL9对于改良土壤，利用根瘤菌的固氮能力来提供作物的需氮量有很大的^^-^C。表6根瘤固氮菌株系BXBL9对大豆植物生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表6可见，施用大豆根瘤固氮菌株系BXBL9有明显的增产效果，接种处理的大豆地上部干重明显比不接种处理的高，增加的幅度大概是49.5~154.5%之间；同时，接种处理的根干重比不接种的高。是否接种对于结荚数有显著的影响。接种处理能够增加部分品种的结荚数，增加幅度是91.5116.6%之间。但对于粤春04-5的结荚数来说，接种效果不是很明显；同时粤舂04-5的地上部干重的增幅也不是很大。从单株地上部干重与根干重的结果来看，接种处理和品种之间的差异均达到极显著水平(地上部干重&=23.81***，FG=13.9***;根干重F产29.94科气Fo-8.67科)；从单株结荚数结果来看，接种处理和品种之间的差异均达到显著水平(&=7.8*，Fcj=6.88*)。本试验研究表明，在不施用氮肥的情况下，单纯使用根瘤固氮菌株系BXBL9有较明显的增产效果，可见由木研究室研制出来的根瘤固氮菌株系BXBL9可以川于大面积的推广施用。田间接种试验的研究发现，接种根瘤固氮菌株系BXBL9后，植株干重，根瘤重，结荚数和产量均髙于不接种对照。大豆接种根瘤固氮菌株系BXBL9有增产增效的效果。一种根瘤固氮菌株系BXBL9及其应用.txtSEQUENCELISTING<110>华南农业大学<120>—种根瘇固氮苗株系BXBL9及其应用<130><160>1<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>肪0<212>咖A<213>根癯菌(Bradyrhizobiuffl)<400>1ccgcgtgagtgatgaagggccct卿gttgtaaagctcttttgtgcgggaagat幼tgac60ggt8CCgC幼gaataagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggt助tacg助鹏g120gctagcgttgctcgg幼tcaCtgggCfft幼鄉Stgcgtaggcgggtctttaagtc鄉g180tgaaatcctggagctcaactccagaactgcctttgatactgaagatcttgagttcggga240gagfftgagtggaactgcgagtfftagaggtgaaattcgtagatattcgc幼gaacaccagt300肪cga鄉cggctcactggcccgatactgacgctgaggcacgaaagcgtggggagcaaac360鄉attagataccctggtagtccacgccgt助acgatgaatgccagccttagtgggttt420actcactagtggcgcagctaacgctttaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagat柳taaaactc祖鄉助ttgacgggggcccgcacaagcggtg卿catgtggttt幼ttcga540cgcaacgcgcag幼ccttaccagcccttgacatcccggtcgcggactccagagacggafft600tcttcagttc卿tggaccggagacagtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtga660gatgttgggtt幼gtcccgcaacgagcgcaacccccgtccttagttgctaccatttagtt720gagcactcta鄉agactgccggtgat幼gccg鄉aaggtgg卿tgacgtc幼gtcct780catggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacaatgggatgct幼840ggggcgaccc肪O权利要求1、一种根瘤固氮菌株系BXBL9，该菌株系属于慢生根瘤菌属，于2007年7月28号保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCNOM207122。2、权利要求1所述的根瘤固氮菌株系BXBL9在豆科植物共生固氮中的应用。全文摘要本发明公开了一种根瘤固氮菌株系BXBL9及其应用，该菌株系是通过不同大豆品种分别捕捉土壤中的根瘤菌，从新鲜根瘤中对根瘤菌进行分离和纯化，并对菌株的16SrDNA部分序列进行测定，通过系统发育分析，确定为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新菌株系，并命名为华固2号。本发明的根瘤固氮菌株系BXBL9通过实验室盆栽、田间回接试验证明其具有耐酸铝、高效结瘤的特性，接种该根瘤菌能够提高大豆产量20-30％以上，可适用于华南酸性土壤地区，作为大豆常规栽培的措施之一。文档编号C12N1/20GK101182477SQ200710032270公开日2008年5月21日申请日期2007年12月7日优先权日2007年12月7日发明者严小龙,红廖,曹桂芹申请人:华南农业大学