专利名称：一种生产5’－呈味核苷酸的方法
技术领域：
本发明属于生化工程技术领域，具体涉及一种利用高活性基因工程菌生产5’-呈味核苷酸的方法。
背景技术：
5’-核苷酸常被用作食品添加剂和药物合成中间体，其中5’-肌苷酸(Inosine-5’-monophosphate，简称5’-IMP)和鸟苷酸(Guanosine-5’-monophosphate，简称5’-GMP)作为一种呈味剂可与味精(谷氨酸钠MSG)混合产生协同效应，使鲜度提高数倍至数十倍；此外它们对甜味、肉味有增效作用，对咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，因此在食品工业生产中越来越受到重视和欢迎。
工业化生产5’-核苷酸的方法主要有核糖核酸(RNA)酶解法，利用谷氨酸产生菌、产氨短杆菌、谷氨酸杆菌等微生物直接发酵法以及利用枯草杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌等发酵肌苷后以化学法或者微生物酶法转化为5’-肌苷酸。这些方法或者反应物对人体有毒性或者反应底物昂贵或者副产物多，所以不能用来高效而廉价的生产5’-核苷酸。
三原康博等报道了一种利用酸性磷酸酶(acid phosphatase，EC3.1.3.2)以焦磷酸钠盐为磷酸供体生产5’-核苷酸的方法，以突变后的基因工程菌为酶源，反应12小时IMP累积量达到120.5g/l，肌苷转化率约76.5％。然而此方法仍然存在生产周期长，转化率不高等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶，一个编码该酶的基因，含有该基因的重组DNA，可用于生产5’-呈味核苷酸的微生物；本发明的另一目的是提供一种高效廉价生产5’-呈味核苷酸的方法。
本发明所采用的技术方案如下1.利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌(Escherichia coli)，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌。
酸性磷酸酶的来源不做限制，只要能催化相应的核苷与磷酸基供体在酸性缓冲液中生成相应5’-核苷酸即可，例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)等，在特别推荐的方案中，本发明使用产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes W8401)的酸性磷酸酶。
构建重组质粒的载体也不做限制，只要能高效表达外源的酸性磷酸酶即可，在特别推荐的方案中，本发明使用温度诱导型的表达载体pBV220，此载体不需使用化学诱导剂，只须提高温度到42℃诱导4h即可诱导外源蛋白的大量表达，相对于通常所用的由化学诱导剂诱导表达的表达质粒(如携带由IPTG诱导的lac启动子的质粒)而言，可以节约大量成本。
培养微生物的培养基不受特别限制，为可以获得含有一般碳源，氮源，无机离子和可选的有机营养物质的普通培养基，在特别推荐的方案中，本发明使用的是LB培养基，配方如下蛋白胨10g、酵母抽提物5g和NaCl10g，使用10mol/L NaOH调节pH为7.2，定容至1L。固体培养基只需在液体培养基内加入2％琼脂即可。
培养微生物的条件也不特别限制，例如可以在需氧条件下培养12-48小时，同时将pH值控制在5-8，温度控制在25-40℃的范围。对于需要诱导表达外源蛋白质的微生物的培养，可以在上述的培养之后再根据相应表达载体选择相应的诱导表达条件，例如使用pBV220表达载体时，可在30℃培养16小时后，将温度提高到42℃的方法诱导表达外源蛋白质。
2.酸性磷酸酶基因的突变与筛选对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶。
酸性磷酸酶基因的突变的方法不受限制，只要能使酸性磷酸酶产生突变即可。比如可以用紫外光辐射或者用人工诱变剂处理含有该酶基因的微生物，也可以用定点突变的方法直接突变，或者DNA改组(DNA shuffling)的方法定向突变。
筛选对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的方法不做限制，只要能快速而高效的筛选到表达对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的微生物即可。
3.以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’-核苷酸。
使用的酸性磷酸酶的来源不做限制，只要能催化核苷与磷酸基团供体合成相应的5’-核苷酸即可。比如可以是经过初步抽提的粗酶，也可以是源自细菌的非增殖的完整细胞作为酶源。在特别推荐的方案中，本发明使用表达外源酸性磷酸酶的基因工程菌作为酶源。
使用的核苷不做限制，包括嘌呤核苷(比如肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、6-甲基嘌呤核苷、6-甲氧基嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、6-氟嘌呤核苷、6-硫代嘌呤核苷、巯基鸟苷、2-氨基6-硫代嘌呤核苷、阿拉伯糖腺苷等)，嘧啶核苷(比如尿苷、胞苷、5-氨基尿苷、5-羟基尿苷、5溴尿苷、6-氮杂尿苷、阿拉伯糖胞苷等)。
使用的磷酸基团供体也不做限制，包括多磷酸及其盐(如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、它们的混合物、其钠盐、钾盐及其混合物)，苯磷酸及其盐(如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐及其混合物)，氨甲酰磷酸及其盐(如氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂及其混合物)，乙酰磷酸及其盐(如乙酰磷酸锂钾等)。
反应的缓冲液的pH值为2.5-6之间。
反应的温度为20-50℃。
反应底物中核苷浓度为10-200mM，磷酸基团供体浓度为其1-10倍。
反应可以在静止的条件下进行，也可以在适当的搅拌下进行。
反应时间在1-20小时之间。
反应完成后，可以使用合成树脂吸附的方法，使用沉淀剂的方法或其他常规收集和分离方法，从混合物中收集和分离由此生成的5’-核苷酸。
利用本发明的方法催化合成5’-核苷酸，具有简单，高效，周期短，低成本，符合环保要求等特点，适合于工业化生产。
本发明的特点是1.引入突变S89N，A90F，G92D，I171T后的酸性磷酸酶其核苷磷酸转移酶活性大大提高，突变后的酸性磷酸酶在以50g/l的肌苷与300g/l的焦磷酸钠为底物时，反应2小时5’-IMP累积量达到90.6g/L，转化率达到92％；以100g/l的肌苷与300g/l的焦磷酸钠为底物时，反应7小时后5’-IMP累积量达到153.7g/L，转化率达到78％，与三原康博等的工艺相比，反应时间缩短了，5’-肌苷酸累积量也得到提高。
2.选用温度诱导型的表达载体表达外源蛋白，节约大量成本。
3.直接以基因工程菌菌体催化转核苷反应，无需破细胞提纯酶。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明不仅限于这些例子。
实施例11.基因工程菌的构建根据GeneBank中提供的Enterobacter aerogenes的phoc基因序列设计引物如下Primer15’-cgggatcccatgaaaaagcgcgttctcgccctctg-3’(BamHI)(记为SEQ.ID.NO.5)，Primer25’-ccgctcgagcgatgacgttacttctgcgttttggcg-3’(XholI)(记为SEQ.ID.NO.6)，以Enterobacter aerogenes的染色体DNA为模板做PCR95℃5min，30×(95℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。得到长度约760bp的PCR产物，与pBV220载体分别经限制性酶切后用T4DNA连接酶连接，转化E.coliDH5α感受态细胞。用pBV220载体通用引物PCR及限制性酶切鉴定转化子得到基因工程菌pBV220-phoc。DNA测序结果为SEQ.ID.NO.1atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctggccagtttcttctccgttaacgcctttgctctggttccccccgggaacgatgtcaccaccaagcccgatctctactatctgaccaatgcccaggccatcgacagcctggcgctgttgccaccaccgccggcggtgggcagtatcgcatttttaaacgatcaggcgatgtatgagcaaggacgtctgctgcgcaataccgagcgcgggaagctggcggcagaggatgctaacctcagcgcgggcggcgtggccaacgccttctccagcgcctttggttcgccgattaccgagaaagacgcgccgcagcttcacaaactgctgaccaatatgattgaagacgccggcgacctggcgacccgcagcgcgaaagagaaatacatgcgcattcgcccgtttgcgttctatggcgtctccacctgcaacaccaccgaacaggacaagctggcgaaaaacggctcttacccgtccgggcatacctctatcggctgggccaccgccctggtgctggcggagatcaacccgcagcggcaaaacgaaattttgaagcgcggctatgagctcggcgagagccgggtgatctgcggctatcactggcagagcgatgtcgatgcggcgcgcatcgtcggctccgcggtggtcgctacgctgcacaccaacccggccttccagcagcagttgcagaaagccaaagatgaattcgccaaaacgcagaagtaa其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2mkkrvlalclasffsvnafalvppgndvttkpdlyyltnaqaidslallppppavgsiaflndqamyeqgrllrntergklaaedanlsaggvanafssafgspitekdapqlhklltnmiedagdlatrsakekymrirpfafygvstcntteqdklakngsypsghtsigwatalvlaeinpqrqneilkrgyelgesrvicgyhwqsdvdaarivgsavvatlhtnpafqqqlqkakdefaktqk与GeneBank提供的氨基酸序列同源性为97.2％，存在以下改变L13F，A24P，A28V，K38T，E54A，K69Q，S159A。
2.湿菌体的制备。
重组菌活化后接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养到OD6000.6时立即升温至42℃培养4h，离心后的菌体用10mmol/L pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤，再离心得湿菌体。
3.酶催化合成5’-IMP。
反应体系如下缓冲液100mmol/L pH3.5的醋酸盐缓冲液底物10mg/ml肌苷和250mg/ml Na4P2O7·10H2O菌体量2％(湿重)于30℃水浴摇床上反应，摇速150r/min，反应结束后100℃煮沸5min，12000r/min离心5min得上清液。
取2.5μl样品TLC检测其5’-IMP浓度，方法如下以硅胶GF254铺板，TLC流动相为正丙醇/氨水/水(20/15/4)，层析后晾干，紫外下刮下5’-IMP所对应的点，加入2ml水溶解1小时，离心后紫外分光光度计测定其OD249，以不同浓度的5’-IMP OD249所做的标 准曲线来定量。根据以下公式计算转化率。
反应5小时5’-IMP浓度达到8.29g/L，转化率达到42.1％。
实施例21.phoc的突变设计如下引物Primer35’-ctaacctcagcttcggcgacgtggc-3’(记为SEQ.ID.NO.7)，Primer45’-gccacgtcgccgaagctgaggttag-3’(记为SEQ.ID.NO.8)，Primer55’-gcatacctctaccggctgggccac-3’(记为SEQ.ID.NO.9)，Primer65’-gtggcccagccggtagaggtatgc-3’(记为SEQ.ID.NO.10)，分别以primer1/primer4，primer3/primer6，primer5/primer2作为引物，以pBV220-phoc重组质粒为模板，PCR，条件如下95℃5min，30×(95℃30s，50℃30s，72℃60s)，72℃10min。分别得到长度约200bp，200bp，300bp的PCR产物，回收后以其为模板，以primer1/primer2为引物进行第二轮PCR，条件为95℃5min，30×(95℃30s，50℃30s，72℃60s)，72℃10min。得到长度约760bp的PCR产物，与pBV220载体分别经限制性酶切后用T4DNA连接酶连接，转化E.coli DH5α感受态细胞。用pBV220载体通用引物PCR筛选阳性克隆。
2.高酶活性菌的筛选反应体系如下缓冲液100mmol/L pH3.5的醋酸盐缓冲液底物10mg/mlIr和250mg/ml Na4P2O7·10H2O菌体量2％(湿重)于30℃水浴摇床上反应，摇速150r/min，反应30分钟后100℃煮沸5min，12000r/min离心5min得上清液，TLC检测5’-IMP浓度。最终得到一株高活性菌a8265，测序结果为SEQ.ID.NO.3atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctggccagtttcttctccgttaacgcctttgctctggttccccccgggaacgatgtcaccaccaagcccgatctctactatctgaccaatgcccaggccatcgatagcctggcgctgttgccaccaccgccggcggtgggcagtatcgcatttttaaacgatcaggcgatgtatgagcaaggacgtctgctgcgcaataccgagcgcgggaagctggcggcagaggatgctaacctcaacttcggcgacgtggccaacgccttctccagcgcctttggttcgccgattaccgagaaagacgcgccgcagcttcacaaactgctgaccaatatgattgaagacgccggcgacctggcgacccgcagcgcgaaagagaaatacatgcgcattcgcccgtttgcgttctatggcgtctccacctgcaacaccaccgaacaggacaagctggcgaaaaacggctcttacccgtccgggcatacctctaccggctgggccaccgccctggtgctggcggagatcaacccgcagcggcaaaacgaaattttgaagcgcggctatgagctcggcgagagccgggtgatctgcggctatcactggcagagcgatgtgatgcggcgcgcatcgtcggctccgcggtggtcgctacgctgcacaccaacccggccttccagcagcagttgcagaaagccaaagatgaattcgccaaaacgcagaagtaa其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4
mkkrvlalclasffsvnafalvppgndvttkpdlyyltnaqaidslallppppavgsiaflndqamyeqgrllrntergklaaedanlnfgdvanafssafgspitekdapqlhklltnmiedagdlatrsakekymrirpfafygvstcntteqdklakngsypsghtstgwatalvlaeinpqrqneilkrgyelgesrvicgyhwqsdvdaarivgsavvatlhtnpafqqqlqkakdefaktqk存在如下突变S89N，A90F，G92D，I171T。
3.酶催化合成5’-IMP。
3.1同实施例一步骤2，制备a8265湿菌体后以以下体系酶催化合成5’-IMP缓冲液100mmol/L pH3.5的醋酸盐缓冲液底物50mg/ml Ir和300mg/ml Na4P2O7·10H2O菌体量2％(湿重)反应2小时5’-IMP浓度达到90.6g/L，转化率达到92％。
3.2同实施例一步骤2，制备a8265湿菌体后以以下体系酶催化合成5’-IMP缓冲液100mmol/L pH3.5的醋酸盐缓冲液底物100mg/ml Ir和300mg/ml Na4P2O7·10H2O菌体量2％(湿重)反应7小时后5’-IMP浓度达到153.7g/L，转化率达到78％。
3.3同实施例一步骤2，制备a8265湿菌体后以以下体系酶催化合成5’-IMP缓冲液100mmol/LpH3.5的醋酸盐缓冲液底物100mg/ml Ir和300mg/ml Na4P2O7·10H2O菌体量1％(湿重)反应16小时后5’-IMP浓度达到151.7g/L，转化率达到77％。
序列表<110>复旦大学<120>一种高效生产5’-呈味核苷酸的方法<160>10<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>747<212>DNA<213>产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)<220>
<221>CDS<222>(1)...(747)<400>1atg aaa aag cgc gtt ctc gcc ctc tgc ctg gcc agt ttc ttc tcc gtt 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe Phe Ser Val1 5 10 15aac gcc ttt gct ctg gtt ccc ccc ggg aac gat gtc acc acc aag ccc 96Asn Ala Phc Ala Leu Val Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro20 25 30gat ctc tac tat ctg acc aat gcc cag gcc atc gac agc ctg gcg ctg 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Gln Ala Ile Asp Set Leu Ala Leu35 40 45ttg cca cca ccg ccg gcg gtg ggc agt atc gca ttt tta aac gat cag 192Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60gcg atg tat gag caa gga cgt ctg ctg cgc aat acc gag cgc ggg aag 240Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80
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<221>CDS<222>(1)...(747)<400>3atg aaa aag cgc gtt ctc gcc ctc tgc ctg gcc agt ttc ttc tcc gtt 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Phe Phe Ser Val1 5 10 15aac gcc ttt gct ctg gtt ccc ccc ggg aac gat gtc acc acc aag ccc 96
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<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>5cgggatccca tgaaaaagcg cgttctcgcc ctctg 35<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7ctaacctcag cttcggcgac gtggc 25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>8gccacgtcgc cgaagctgag gttag 25<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9gcatacctct accggctggg ccac 24<210>10
<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10gtggcccagc cggtagaggt atgc 2权利要求
1.一种生产5’-呈味核苷酸的方法，其特征在于包括如下步骤1.1利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌；1.2酸性磷酸酶基因的突变与筛选对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶；1.3以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’-核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.1中所述的酸性磷酸酶来源于产气肠杆菌，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2。
3.一种突变型的酸性磷酸酶，其特征在于其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.3，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3所述的核苷为嘌呤核苷或嘧啶核苷之一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3所述的磷酸基团供体为多磷酸或其盐，苯磷酸或其盐，氨甲酰磷酸或其盐，乙酰磷酸或其盐之一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3中反应温度为20-50℃，缓冲液的pH值为2.5-6，反应底物中核苷浓度为10-200mM，磷酸基团供体浓度为核苷浓度的1-10倍，反应时间为1-20小时。
全文摘要
本发明属于生化工程技术领域，具体涉及一种以DNA重组技术构建基因工程菌，对该基因工程菌进行突变筛选，并利用高活性基因工程菌生产5’－核苷酸的方法。包括如下步骤1.利用重组DNA技术，构建酸性磷酸酶表达载体，并转化大肠杆菌，得到高效表达酸性磷酸酶的基因工程菌。2.酸性磷酸酶基因的突变与对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶的筛选。3.以酸性磷酸酶催化核苷与磷酸基团供体合成5’－核苷酸。利用本发明的方法催化合成5’－核苷酸，具有简单，高效，周期短，低成本，符合环保要求等特点，适合于工业化生产。
文档编号C12P19/30GK101063126SQ20071003863
公开日2007年10月31日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者梁胜华 申请人:复旦大学