亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品的制作方法

专利名称：：亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品的制作方法亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品本发明涉及血液及血液成分病毒灭活效果的质量评价方法，及相应质控品的建立，具体涉及亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品。
背景技术：
：随着医学科学的发展，血液及血液制品的安全性越来越受到重视，血液安全性不仅依赖于合理的献血员筛选，严格的病毒筛检，还有赖于安全有效的病毒灭活技术，它是安全输血的重要保障。亚甲蓝(Methyleneblue,MB)光化学法被认为是非常有发雇前景的临床用单人份血浆病毒灭活方法。由于病毒灭活技术受多种条件因素影响，如MB的浓度、光照强度、时间及光源波长等，因此建立病毒灭活有效性验证手段，直接而客观地评价病原体灭活的有效性是病毒灭活工作的重要组成部分，是确保灭活效果达到预期的要求，保障血液制品安全性、有效性的重要环节。目前多采用体外培养的细胞病变法或动物模型方法来判断病毒灭活效果。细胞病变法就是通过病毒接种于细胞悬液中，观察宿主细胞变化来判定病毒感染的情^。目前除HIV巳建立起成熟的实验室细胞病变方法加以检测外，HBV、HCV等都不能直接体外繁殖，必须尽可能选择理化性质相似的模型病毒作为指示病毒进行体外培养加以检测，如以辛德毕斯病毒(SindbisVirus,SV)作为HCV模型病毒、鸭乙肝病毒(DuckHepatitisBVirus,D冊V)作为冊V的模型病毒、水疱性口炎病毒(VesivularStomatitisVirus,VSV)作为RNA脂质包膜病毒的模型病毒。但是体外培养方法对实验条件有严格的要求，细胞培养、病毒保存有规范的控制，操作繁琐，实验周期长，不利于在基层单位开展此项工作。此外，虽然动物模型方法在从生物体整体水平评价病毒感染性方面具有优势，但价格昂贵，实验周期长，只适合于研究开发阶段使用，也不适合在常规工作中开展。因此，建立更简单易行、更经济、更有效的评价指标己成为病毒灭活工作中急需解决问题。核酸检测技术是以检测感染者体内病毒核酸的有无或含量多少来进行病原学诊断的一种方法，是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断检测技术。它具有灵敏度高，特异性强，能采用定量检测的方法进行质量控制，准确性髙，检测费用少，检测耗时少，适合于常规工作中推广应用。PCR是众多核酸检测技术中的经典方法，因其简便快速的特点，目前基层检验单位及血站均己具备PCR工作条件。因此发明人想到了可能可以利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果。本发明要解决的技术问题是提供一种新的利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果的方法。要给出利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活对血浆病毒的灭活效果的方法，有几个关键首先，因为PCR检测的是病毒特异性靶基因片段，所以必须证明亚甲蓝对病毒灭活作用位点为病毒核酸，并且病毒这种特异性扩增产物的减少或消失与病毒感染的致病性存在一定的相关性。其次，由于常规采供血工作对环境的严格要求，引入的质控品材料必须保证对操作人员和受血者无感染性，因此，必须选择对人体不致病，但又能模拟对人体致病的朋V、HCV和HIV在处理过程中动态变化的模型病毒或相关病毒的核酸材料作为质控品的备选对象。最后，必须筛选出与亚甲蓝光化学病毒灭活相关的，能敏感反映病毒感染性的耙基因扩增片段及其引物，以达到该方法有效推广的目的。在证实了亚甲蓝对病毒灭活作用位点为病毒核酸，并且病毒这种特异性扩增产物的减少或消失与病毒感染的致病性存在一定的相关性后，本发明提出了以下技术方案一方面，本发明公开了一种亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价的检测方法在对血液或血液制品进行亚甲蓝光化学灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含有HCV病毒基因的重组质粒或HCV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中HCV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。HCV病毒基因的重组质粒是指HCV病毒基因组DNA片段与现有载体重组获得的重组质粒。现有载体指的是本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:pUC系列、pBluescript、pGEM和它们的衍生载体等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建HCV病毒基因的重组质粒。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,etal-MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)等。HCV病毒基因体外转录的RNA片段是指经体外转录获得的HCV病毒基因组RNA片段。体外转录可以在获得HCV病毒基因组DNA片段后，用本领域熟知的技术或者试剂盒完成，例如将HCV病毒基因组DNA片段与常用载体重组,获得HCV病毒基因的重组质粒，进而在RNA聚合酶的作用下转录获得HCV病毒基因组RNA片段。较佳的，上述特异性引物序列选自下组中的一组1)CGGAATTCCGACCATAGATACTCCCCT(SEQIDNO:3)及CGGGATCCCGGAAGATAGAGAAAGAGCAACCG(SEQIDNO:4);2)GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG(SEQIDNO:5)及CTGGCAATTCCGGTGTACTCA(SEQIDNO:6);较佳的，上述HCV病毒基因的重组质粒含有序列SEQIDNO:l。重组质粒可由序列SEQIDN0:1与现有载体重组获得。较佳的，上述重组质粒的载体可以是选自pUC系列、pBluescript、pGEM和它们的衍生载体。优选的，上述重组质粒的载体为pBluescriptIISK(+)。较佳的，上述HCV病毒基因体外转录的RNA片段含有序列SEQIDN0:2。较佳的，上述PCR技术为普通PCR或实时荧光定量PCR。另一方面，本发明公开了前述亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价检测方法中使用的质控品，质控昂含有包含序列SEQIDN0:1的重组质粒或包含序列SEQIDN0:2的RNA，上述质粒或RNA的含量一般控制在103copies/ml-108copies/ml。质控品是包含序列SEQIDNO:l的重组质粒或包含序列SEQIDNO:2的RNA经常用稀释液或缓冲液稀释获得的溶液，本领域熟知的常用稀释液或缓冲液包括但不限于DEPC处理水、用DEPC处理过的PBS缓冲液或代血浆(羟乙基淀粉20(HES20)氯化钠注射液，HES20)、无菌双蒸水、无菌水等。较佳的，上述重组质粒为序列SEQIDN0:1与pBluescriptIISK(+)重组获得的质粒。较佳的，上述RNA片段的序列为SEQIDN0:2。有益效果本发明在大量研究的基础上将普通PCR(conventionalPCR)和实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)技术应用于血液及血液成份病毒灭活的有效性检测中，即通过对模型病毒HCV核酸特异性靶序列的扩增，作定性或定量分析，从病毒灭活前后核酸量的变化判断病毒灭活对病毒的杀伤作用。相比现有的判断病毒灭活效果的方法，本发明操作简单，准确度好，实验周期短，需要的实验条件容易达到，更为经济有效。实时荧光定量PCR的使用还可以更进一步动态的反映MB-P处理效果。图l.MB-P处理过程中血浆标本HCVRNA随光照时间动态变化的定量研究时间单位分钟图2.病人血浆中的HCV与代血浆或PBS缓冲液中体外转录的RNA在MB-P处理下的降解速率比较图3.利用引物I与引物II检测SV在灭活前后PCR结果M:MarkerDL2000，MarkerDL2000自上而下条带分别为2000,1000,750,500,250，lOObpl::Sindbis病毒加MB未作光照处理标本(引物II，扩增片段大小1025bp)2:MB1.0rtnol/L30分钟(引物I1)3:MBl.OMmol/L60分钟(引物n)4:Sindbis病毒加MB未作光照处理标本(引物I，扩增片段大小323bp)5:MB1.0Wnol/L30分钟(引物I)6:朋1.0Mmol/L60分钟(引物I)图4.利用引物VSV1与引物VSV2检测VSV在灭活前后PCR结果M:MarkerDL2000l::Sindbis病毒未加MB未作光照处理标本(引物VSV1，扩增片段大小213bp)2:MB1.0Wnol/L30分钟(引物VSV1)3:MB1.0Wnol/L60分钟(引物VSV1)4:Sindbis病毒加MB未作光照处理标本(引物VSV2，扩增片段大小237bp)5:MB1.0Wnol/L30分钟(引物VSV2)6:朋1.0Mmol/L60分钟(引物VSV2)图5.利用引物HCV1检测HCV质控品在灭活前后PCR结果M:MarkerDL20001:原始标本(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)2:加MB未作光照处理(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)3:MB1.0Mmol/L20分钟(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)4:MB1.0陶ol/L30分钟(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)5:MB1.0Wnol/L40分钟(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)6:腿1.0Wnol/L50分钟(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)7:加鹏未作光照处理(含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品)8:MB1.0Mraol/L30分钟(含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品)9:MB1.0Mmol/L60分钟(含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品)图6.利用引物HCV2检测HCV质控品在灭活前后PCR结果M:MaimerDL20001:加腿未作光照处理(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)2:朋1.0陶ol/L30分钟(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)3:MB1.0陶ol/L60分钟(含HCV病毒基因的重组质粒的质控品)4:加細未作光照处理(含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品)5:鹏1.0Mmol/L30分钟(含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品)6:MB1.0rtnol/L60分钟(含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品)图7.利用引物HCV2测含HCV病毒基因的重组质粒(103copies/ml)的质控品(在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、10Vopies/ml的标准品，加MB未作光照处理，MB1.0陶ol/L照射30分钟质控品，鹏l.Ottnol/L照射60分钟质控品。图8.用引物HCV2测含HCV病毒基因体外转录的RNA片段(10scopies/ml)的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度.107、106、10s、10、opies/ml的标准品，加鹏未作光照处理，鹏1.0照射30分钟质控品，鹏1.0rtnol/L照射60分钟质控品。图9.利用引物HCV2测含HCV病毒基因的重组质粒(107copies/ml)的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度10'、108、106、10、叩ies/ml的标准品，加細未作光照处理，MB1.0mol/L照射30分钟质控品，MB1.0Wnol/L照射60分钟质控品。图10.利用引物HCV2测含HCV病毒基因体外转录的RNA片段(l(ycopies/ml)的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、10e、10B、1(^copies/ml的标准品，加MB未作光照处理，鹏l.0Wnol/L照射30分钟质控品，MB1.0Mraol/L照射60分钟质控品。图11.利用引物HCV2测含HCV病毒基因的重组质粒(l()4copies/inl)的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、10Vopies/ml的标准品，加MB未作光照处理，MB1.0陶ol/L照射30分钟质控品，MB1.0Mmol/L照射60分钟质控品。具体实施方式本发明是为了将PCR技术运用于亚甲蓝光化学病毒灭活效果评价领域，首先必须证明病毒核酸是亚甲蓝光化学病毒灭活作用靶位点，即要证实亚申蓝光化学灭活对病毒核酸有破坏作用，验证过程如下1)本发明设置不同的朋-P灭活条件，将含病毒阳性血浆及体外转录获得的病毒RNA溶液同时进行灭活；灭活后，分别取样，对样品进行RNA抽提及逆转录；利用针对病毒核心片段基因序列的引物，对样品进行实时荧光定量PCR检测来测定样品中病毒RNA的浓度；结果证实，MB-P处理后，病毒RNA均发生了降解，且降解程度随着光照时间的增加而增加。2)同时，通过对比实验，本发明还揭示了血浆中病毒降解速度大于体外转录获得的病毒RNA降解速度。由于本发明将PCR技术运用于亚甲蓝光化学病毒灭活效果评价，即通过特异性扩增产物的减少或消失来判断灭活作用，因此还必领证明病毒核酸的降解与病毒的感染性消失存在一定的相关性，证明方法如下1)将病毒血浆进行不同条件的MB-P处理。2)对不同灭活条件的血浆取样，通过RT-PCR检测病毒核酸，与MB-P处理前进行比较，结果证实灭活后，PCR产物减少，即病毒核酸被降解。3)同时，对不同灭活条件的血浆取样，用实时荧光定量PCR检测，进一步证明随着灭活过程的进行，PCR产物逐步递减，即病毒核酸逐步被降解。4)对不同灭活条件的血浆取样，进行细胞病变检测，测定感染性滴度，结果证实灭活后，病毒感染性消失了。本发明的方法是通过对质控品的检测来评价細-P的效果，为了证实本发明的质控品可以起到评价MB-P的效果的作用，本发明将制备的质控品及含病毒血浆同时进行鹏-P处理，结果证实，随着MB-P过程的进行，质控品中的PCR产物逐步递减，血浆中病毒感染性也消失了，结果证实质控品真实地反映了MB-P的效果。下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例l亚甲蓝光化学灭活对HCV病毒核酸有破坏作用实验歩骤.-1、克隆的建立根据GenBank中HCVlb型序列(AY460204),采用Generunner软件设计覆盖HCV5，-NCR及核心区片段的PCR引物，上游引物序列为5'-CGGAATTCCGACCATAGATACTCCCCT-3'(SEQIDN0:3)，下游引物序列为5'-CGGGATCCCGGAAGATAGAGAAAGAGCMCCG"3'(SEQIDN0:4)，扩增片段长度为844bp，引物交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用Trizol(GibcoBRL)试剂抽取抗HCV及HCVRNA均为阳性的献血员血浆(上海血液中心)中的HCVRNA后，使用RNAPCRKIT(Takara公司)进行逆转录和PCR反应。反应参数为42"逆转录30分钟，941C预变性2分钟，94"变性30秒，55X:退火30秒，72TC延伸1分钟，其中变性、退火和延伸循环30次。将PCR产物纯化后以EcoRI、BamHI双酶切位点克隆到pBluescriptIISK(+)载体(Stratagene公司)中，再转化大肠杆菌E.coliTOP10(Promege公司)，抽提质粒进行EcoRI、BaraHI双酶切鉴定和测序鉴定(由上海生工生物工程技术服务有限公司采用ABIPRISM3730分析仪完成)。酵切产物电泳，在844bp处有电泳条带，测序结果包括SEQIDN0:1片段，结果符合预期。片段序列(SEQIDN0:1)5,-ACCATAGATACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTTAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGTGGAAGGCGACMCCTATCCCCAAGGCTCGCCGGCCCGAGGGTAGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAACGAGGGTATGGGGTGGGCAGGATGGCTCCTGTCACCCCGTGGCTCTCGGCCTAGTTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGTAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACATGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATTCCGCTTGTCGGCGCCCCCCTAGGGGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCACATGGTGTCCGGGTTCTGGAGGACGGCGTGMCTATGCAACAGGGAATCTGCCGCGGTTGCTCTTTCTCTATCTTC-3，2、体外转录用上述阳性质粒作为模板，NotI酶切线性化后在T7聚合酶的作用下体外转录出含目的片段的RNA，凝胶电泳检测，在844bp处有目的条带。纯化后定量，分别用DEPC处理过的PBS缓冲液和代血浆(羟乙基涂粉20氯化钠注射液，HES20)稀释为10-copies/ml(与正常阳性血浆中HCV浓度相近)，一80。C保存备用。体外转录获得产物的序列为SEQIDN0:2片段序列(SEQIDN0:2)5，-GAAGAUAGAGAAAGAGCAACCGCGGCAGAUUCCCUGUUGCAUAGUUCACGCCGUCCUCCAGAACCCGGACACCAUGUGCCAGGGCCCUGGCAGCGCCCCCUAGGGGGGCGCCGACAAGCGGAAUGUACCCCAUGAGGUCGGCGAAGCCGCAUGUAAGGGUAUCGAUGACCUUACCCAAAUUACGCGACCUACGCCGGGGGUCUGUGGGGCCCCAACUAGGCCGAGAGCCACGGGGUGACAGGAGCCAUCCUGCCCACCCCAUACCCUCGUUGCCAUAGAGGGGCCAAGGGUACCCGGGCUGAGCCCAGGUCCUACCCUCGGGCCGGCGAGCCUUGGGGAUAGGUUGUCGCCUUCCACGAGGUUGCGACCGCUCGGMGUCUUCCUAGUCGCGCGCACACCCAACCUGGGGCCCCUGCGCGGCAACAGGUAAACUCCACCMCGAUCUGACCACCGCCCGGGMCUUMCGACCUCCCGGGGCACUCGCAAGCACCCUAUCAGGCAGUACCACAAGGCCUUUCGCGACCCMCACUACUCGGCUAGCAGUCUCGCGGGGGCACGCCCAAAUCUCCAGGCAUUGAGCGGGUUGAUCCAAGAAAGGACCCGGUCGUCCUGGCAAUUCCGGUGUACUCACCGGUUCCGCAGACCACUAUGGCUCUCCCGGGAGGGGGGGUCCUGGAGGCUGCACAACACUCAUACUAACGCCAUGGCUAGACGCUUUCUGCGUGAAGACAGUAGUUCCUCACAGGGGAGUAUCUAUGGU-3，3、病毒灭活取含HCVRNA108copies/ml抗HCV及HCVRNA均为阳性的献血员血浆标本(上海市血液中心)、体外转录RNA的PBS溶液和代血浆溶液各99ml，分别加入100umol/L的注射用MBlral(MB终浓度为1iimol/L),混匀后在4C用30000Lux可见光照射处理。在照射前.(Omin)，照射后2min、5min、10min、20rain、30min、40min和60min分别取样作进一步检测，同时用未加MB的这三种溶液在同样条件下处理作为对照组，也分别在不同照射时间留样。4、RNA抽提及逆转录-灭活后，体外转录RNA溶液100u1用75%乙醇沉淀，而血浆则取100u1加入300u1Trizol中以提取病毒RNA，在沉淀干燥的RNA中加入含随机引物(200nmol/L)，AMV逆转录酶(0.1U/nL)，dNTP(300n迈ol/L)的逆转录混合物30w1，在421C条件下进行逆转录反应。5、实时荧光定量PCR检测及实验结果针对HCV5'-NCR区基因序列,设计荧光定量PCR引物及Taqman探针，上游引物为5，-GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG"3，(SEQIDN0:5)，下游引物为5'-CTGGCAATTCCGGTGTACTCA-3'(SEQIDN0:6)，探针序列为5，-(FAM)CCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG(Eclipse)-3'(SEQIDN0:7)。引物及探针由大连宝生物(Takara)公司合成。使用上述引物,在ABI7500型实时荧光定量扩增仪上进行检测。循环参数为94TC变性30秒，53"退火30秒，721C延伸34秒，72"时收集荧光信号，共进行45个循环，用前述构建的质粒，以107cOpies/nil浓度起，以10倍梯度稀释作为标准品同时反应，绘制标准曲线，确定不同灭活条件处理后样品的HCVRNA浓度，结果如图1及图2所示。结果说明，MB-P处理后，HCV病毒RNA发生了降解，且降解程度随着光照时间的增加而增加。6、体外转录HCVRNA在代血浆或PBS缓冲液中MB-P处理后的动态变化为进一歩确定HCVRNA在MB-P处理下的降解过程，同时也为了验证病毒包膜蛋白以及血浆中的蛋白成分在MB-P病毒灭活过程中所起的作用，本研究将体外转录的HCVRNA调整到106copies/ml，使之与病人血浆中HCVRNA的浓度相同，分别加入到代血浆(HES20)和PBS缓冲液中，并以病人HCV阳性血浆作为对照，按前述方法进行朋-P处理后，用步骤5中的探针及引物进行荧光定量PCR检测HCVRNA残留量。将检测到的不同处理时段HCVRNA残留量取对数，计算其所占处理前原有量的对数的百分比，并以此为纵坐标，以光照时间为横坐标，作直线回归图，直线的斜率即为MB-P处理时HCVRNA的降解速率(图2)。图中结果为三次实验的平均值。结果表明未加MB时，病人血浆中的HCV以及体外转录的HCVRNA均未发生降解；而在MB作用下，病人血浆中的HCV以及体外转录的HCVRNA均迅速降解。通过回归直线的斜率(K)比较，发现，体外转录的HCVRNA在代血浆(HES20)中和PBS缓冲液中的降解速率相似，但二者均低于病人血浆中的HCV降解的速率。实施例2亚甲蓝光化学灭活对SV病毒核酸有破坏作用实验步骤1、实验用SV的制备及含病毒血浆的制备(1)实验用SV的制备SV由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，以BHK细胞为宿主传3代。收集上清液，测得病毒滴度>8.51gTCIDw/m1,分装，置-801C保存，备用。(2)含病毒血浆的制备在含100ml抗凝血浆的PVC塑料袋内，按血浆病毒液=9:1的容量比接种病毒，混匀。2、病毒灭活实验在上述含病毒血衆/溶液中，加入亚甲蓝(MB)，使终浓度分别为0.5Mmol/L，1.OWnol/L，1.5Mfflol/L，随即用30000Lux可见光照射，照射时间分别为0'(不照射)，30'，60'。3、病毒核酸检测(定性)及结果(1)病毒RNA提取用Trizol试剂抽提血浆中的病毒RNA，方法如下①Trizo1300ul加血清lOOul,强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止15分钟；②加入80ul氯仿，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止5分钟；③在4"C下离心，12000rpmX15分钟；④离心结束后溶液分层，小心吸取上层水相200ul，加入等体积异丙醇；⑤颠倒混匀10次后，-20"数小时；⑥在4"下离心，14000卬mX15分钟；⑦弃上清，75%预冷酒精400ul洗涤，颠倒数次⑧41C离心，14000rpmX5分钟，弃上清，自然挥发干燥。(2)引物设计根据Sindbis病毒XJ-160序列设计引物，本研究设计了2套引物，共3条，2套引物的负链相同，扩增片段产物I是323bp，1I是1025bp(见下表)。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物名称序列(5'—3')III(+)TGACCGCTATGTCCCAA(SEQIDNO:8)(-)GAAATGTTAAAAACAAAAT(SEQIDNO:9)(+)ACCTCCTTGACCAGTAGAG(SEQIDNO:10)(-)GAAATGTTAAAAACAAAAT(SEQIDNO:9)(3)病毒核酸RT-PCR:用TaKaRaRNAPCRkit,购自宝生物工程有限公司。具体操作参照试剂说明书进行。热循环参数如下421C逆转录30分钟，941C预变性2分钟,94"C变性30秒，551C退火30秒，72X:延伸1分钟，共计30个循环，最后72"C延伸5分钟。(4)PCR产物的检测用1.5%琼脂糖凝胶电泳法进行检测，经照射后的样品均未扩增出片段，其中MB终浓度为1.0Wnol/L的电泳结果见图3。(5)结果表明MB-P处理后，SV病毒RNA发生了降解。实施例3亚甲蓝光化学灭活对VSV病毒核酸有破坏作用实验歩骤1、实验用VSV的制备及含病毒血浆的制备(1)实验用VSV的制备VSV由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，以Vero细胞为宿主传3代。收集上清液，测得病毒滴度>8.51gTCIDM/ml，分装，置-80"C保存，备用。(2)含病毒血浆的制备在含100ml抗凝血浆的PVC塑料袋内，按血浆病毒液=9:1的容量比接种病毒，混匀。2、病毒灭活实验在上述含病毒血浆/溶液中，加入亚甲蓝(MB)，使络浓度分别为0.5Mfflol/L，1.0Wnol/L,1.5Mmol/L,随即用30000Lux可见光照射，照射时间分别为0'(不照射)，30'，60'。3、病毒核酸检测(定性)及结果(1)病毒RNA提取用Trizol试剂抽提血浆中的病毒RNA，方法如下①Trizo1300ul加血清100ul，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止15分钟；②加入80ul氯仿，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止5分钟；③在4"C下离心，12000rpmX15分钟④离心结束后溶液分层，小心吸取上层水相200ul，加入等体积异丙醉⑤颠倒混匀10.次后，-20TC数小时⑥在41C下离心，14000rpmX15分钟；⑦弃上清，75%预冷酒精400ul洗涤，颠倒数次；⑧4"C离心，14000rpmX5分钟，弃上清，自然挥发干燥。(2)引物设计根据VSV病毒序列设计引物，本文设计了2套引物(见下表)。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物名称序列(5'—3')VSV1VSV2(+)CGGAATTCCGAAAGGCTCAGGAGAAACT(SEQIDNO:11)(-)CCAAGCTTGGTTTGAGGCCTTGGTAGAC(SEQIDNO:12)(+)CGGAATTCCGCTACCAAGGCCTCAAATC(SEQIDNO:13)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(3)病毒核酸RT-PCR:用TaKaRaRNAPCRkit，购自宝生物工程有限公司。具体操作参照试剂说明书进行。热循环参数如下421C逆转录30分钟，94"预变性2分钟，94TC变性30秒，551C退火30秒，72"C延伸1分钟，共计30个循环，最后72"C延伸5分钟。(4)PCR产物的检测用1.5%琼脂糖凝胶电泳法进行检测，经照射后的样品均未扩增出片段。其中MB终浓度为1.0Wnol/L的电泳检验结果如图4。结果说明MB-P处理后，VSV病毒RNA发生了降解。实施例4病毒核酸的降解与病毒的感染性消失存在一定的相关性实验步骤1.将实施例2中经步骤2灭活的产物分别取样，接种B服细胞，用细胞病变法(《医用实验病毒学》，人民军医出版社(第l版)P102-109杜平)，测定感染性滴度(TCID5o/ml),结果如下表不同浓度、不同接触时间SV感染性灭活结果MB浓度(Wnol/L)光照不同时间(分钟)的SV滴度(lg，TCID幼)0(无光照)30分钟60分钟0.501.01.58.508.508.502.50<0.50*<0.502.50<0.50<0.50*表示所用方法已测不到病毒滴度结果证实灭活后，病毒感染性消失了。2.将实施例3中经步骤2灭活的产物分别取样，接种Vero细胞，用细胞病变法测定感染性滴度(TCIDso/ml)，结果如下表不同浓度、不同接触时间VSV感染性灭活结果光照不同时间(分钟)的VSV滴度(lg,TCIDjMB浓度(Mmol/L)0(无光照)30分钟60分钟8.502.502.508.50<0.5*<0.58.50<0.5<0.5*表示所用方法已测不到病毒滴度结果证实灭活后，病毒感染性消失了。3.结果分析由实施例2及实施例3可知，在鹏-P处理下，SV病毒及VSV病毒RNA发生了降解，而本实验又证明了MB-P处理后，SV病毒及VSV病毒感染性消失了，由此证实了病毒核酸的降解与病毒的感染性消失存在一定的相关性。实施例5质控品的制备1.含HCV病毒基因的重组质粒的质控品的制备(1)取实施例1歩骤1获得的HCV病毒基因克隆。(2)质控品的配制抽提质粒，-20X:保存备用。临用前以灭菌双蒸水稀释，将质粒浓度分另il调至103copies/ml，104copies/ml,105copies/ml，108copies/ml，10'copies/ml及108COpieS/ml，配制成质控品。上述浓度的样品既可单独作为一个质控品使用，也可作为质控品系列联合使用。2.含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品的制备含HCV病毒基因体外转录的RNA片段由实施例1步骤2获得。用RNA纯化试剂盒(QIAGEN，RNeasyMiniHandbook)纯化RNA，分别用DEPC处理水或用DEPC处理过的PBS缓冲液或代血浆(羟乙基淀粉20(HES20)氯化钠注射液，HES20)稀释为103copies/ml，104copies/ml，105copies/ml，108copies/ml，10'copies/ml及108copies/ml，一80°C保存备用。实施例6对MB-P病毒灭活效果的质量评价在实施例2步骤1获得的含病毒血浆/溶液中，加入亚甲蓝(MB),使终浓度分别为0.5rtnol/L,1.0Wnol/L，1.5Mmol/L，随即用30000Lux可见光照射，照射时间分别为0，(不照射)，30，，60*。0.501.01.5在对上述血浆进行MB-P处理的同时，采用相同的条件，对实施例5获得的质控品进行灭活，灭活结束后，质控品取样61.普通PCR检测(结果表明经照射后的样品均未扩增出片段。其中MB终浓度为1.0Wnol/L的电泳结果如图5—6)1)对实施例5中含HCV病毒基因的重组质粒的质控品，抽提质粒，EcoRI、BamHI双酶切后作为PCR模板，以下表中的引物分别对重组质粒质控品进行PCR进行病毒核酸检测。引物序列(5'-3')序列编号片段大小HCV1(+)CGGAAiTCCGACCATAGATACTCCCCT(一)CGGGATCCCGGAAGATAGAGAAAGAGCAACCGSEQIDN0:3SEQIDNO:4844bpHCV2(+)GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG(一)CTGGCAATTCCGGTGTACTCASEQIDNO:5SEQIDNO:6129bp扩增系统模板5ul，lOmMdNTP0.5ul，T叫酶0.25"1,5XBuffer5ul,Mg"250mM)终浓度2.5mM,引物及模板终浓度200mM，灭菌双蒸水补充体积至25nl。实时荧光定量PCR反应程序951C预变性5分钟，941C变性30秒，53匸退火30秒，72匸延伸34秒，其中变性、退火和延伸循环35次。照射时间为0分钟(即不光照)的质控品可以扩增出产物，其余未扩增出产物。说明MB-P处理后达到了病毒灭活的效桌。2)对实施例5中含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品用TaKaRaRNAPCRkit(购自宝生物工程有限公司)进行病毒核酸检测。具体操作参照试剂说明书进行。热循环参数如下421C逆转录30分钟，941C预变性2分钟，941C变性30秒，55"退火30秒，721C延伸l分钟，共计30个循环，最后721C延伸5分钟(以步骤l)表中引物对体外转录的RNA片段的质控品进行PCR进行病毒核酸检测)。照射时间为0'的质控品可以扩增出产物，其余未扩增出产物。说明MB-P处理后达到了病毒灭活的效果。2.实时荧光定量PCR检测及结果1)对实施例5中含HCV病毒基因的重组质粒的质控品，抽提质粒，EcoRI、BamHI双酶切后作为PCR模板。2)对实施例5中含HCV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品，用实施例l的方法提取病毒RNA，用实施例1步骤4的方法反转录成DNA,作为PCR模板。针对HCV基因序列，设计荧光定量PCR引物及T叫man探针，引物为HCV2，对应的探针序列为5，-CCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG"3'(SEQIDNO:7)，引物及探针由大连宝生物(Takara)公司合成。使用上述引物，模板5ul，10mMdNTP0.5u1，T叫酶0.25"1,5XBuffer5nl，Mg"(250mM)终浓度2.5mM,引物及模板终浓度200mM，灭菌双蒸水补充体积至25u1。在ABI7500型实时荧光定量扩增仪上进行检测。循环参数为941C变性30秒，53"C退火30秒，721C延伸34秒，721C时收集荧光信号，共进行45个循环，用实施例5中2(1)构建的质粒，以1(Tcopies/ml浓度起，以10倍梯度稀释作为标准品同时反应，绘制标准曲线，确定不同灭活条件处理后样品的HCV浓度。其中MB终浓度为l.0Mmol/L的实时荧光定量PCR电泳结果如图7—11。结果发现随着灭活过程的进行，PCR产物逐步递减，即病毒核酸逐步被降解。结果动态反映了MB-P灭活的效果。3.MB-P处理后HCV细胞病变检测用实施例4的方法对本例中经MB-P处理的血浆取样进行细胞病变检测，结果如下不同浓度、不同接触时间SV感染性灭活结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*表示所用方法已测不到病毒滴度本步骤的目的是以现有技术来评价MB-P的效果，结果可见，与前述质控品检测结果一样，MB-P处理后达到了病毒灭活的效果。本步骤进一步验证了可以采用本发明的方法来评价朋-P灭活效果。序列表<110>上海市血液中心<120>亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品<130>PCNXY070108<160>14<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>844<212>DNA<213>HepatitisCvirus<400>1acc3tagat8ctcccctgtgaggaactactgtcttcacgcagaaagcgtctagcc3tggc60gttagtatgagtgttgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtct120gcggaaccggtgElgt3C3CCggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggatcaaccc180gctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcgagactgctagccgagtagtgttgggt240cgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgt300agaccgtgcatcatgagcacaaatcctaaacctcaaagaaaaaccaaacgtaacaccaac360cgccgcccac'aggacgttaagttcccgggcggtggtcagatcgttggtggagt'ttacctg420ttgccgcgcaggggccccaggttgggtgtgcgcgcgactaggaagacttccgagcggtcg480caacctcgtggaaggcgacaacctatccccaaggctcgccggcccgagggtaggacctgg540gctcagcccgggtacccttggcccctctatggcaacgagggtatggggtg.ggcaggatgg600ctcctgtcaccccgtggctctcggcctagttggggccccacagacccccggcgtaggtcg660cgtaatttgggtaaggtcatcgatacccttacatgcggcttcgccgacctcatggggtac720attccgcttgtcggcgcccccctagggggcgctgccagggccctggcacatggtgtccgg780gttctggaggacggcgtg幼ctatgcaacagggaatctgccgcggttgctctttctctat840cttc844<210〉2<211>844<212>RNA<213>HepatitisCvirus<400>2gaagsu卿g幼3g3gcaacCgCggC3g3UucccuguugcauaguucBcgccguccucca60gaacccggacaccaugugccagggcccuggcagcgcccccuaggggggcgccgacaagcg120gaauguEiccccaug鄉ucggcg幼gccgc3Uguaaggguaucgaugaccuuacccaaau180uacgcgaccuELCgCCgggggucuguggggccccaacuaggCCg3g￡LgCC3cggggugsca240ggagccauccugcccaccccauacccucguugccauagEiggggccaaggguacccgggcu300gagccc鄉uccuacccucgggccggcgagccuuggggau鄉uugucgccuucc加gag360guugcgaccgcucgg肪gucuuccuagucgcgcgcacacccaaccuggggccccugcgcg420gcaacagguEiaacuccaccsacgaucugaccaccgcccgggaacuuaacguccugugggc480ggcgguugguguuacguuugguuuuucuuug鄉uuuaggauuugugcucaugaugcacg540gucuacgagaccucccggggcacucgcaagcacccuauc3ggcagu￡tcc8caaggccuuu600cgcgaccc幼cacuacucggcuagcagucucgcgggggcacgccc幼aucuccaggcauu660g观cggguugaucc肪gaaaggacccggucguccuggcaaUUCCggUgU8cucaccgguu720ccgcagaccacuauggcucucccggg鄉ggggguccuggaggCUgC3CEL3C3CUCaU3C780uaacgccauggCU3g3CgCUuucugcgugs3geicaguaguuccucacaggggaguaucua840uggu844<210><211>〈212〉<213><220><223><400>327DNAartificialsequence引物3cggaattccgaccatagatactcccct27<210>4<211>32<212>DNA<213>artificialsequence<220><223>引物<400>4cgggatcccggaagatagagaaagagcaaccg32<210>5<211>24<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>引物<400>5gaactactgtcttcacgcagaaag24<210>6<211>21<212>DM<213>artificialsequence<220〉<223>引物<400>6ctggcaattccggtgtactca21<210>7<211>24<212>DNA<213>artificialsequence<220><223>探针<400>7ccgcagaccactatggctctcccg24<210>8<211>17<212>DNA<213>artificialsequence<220><223〉引物<400>8tgaccgctatgtcccaa17<210>9<211>19<212>DNA<213>artificialsequence<220><223〉引物<400>9gaaatgttaaaaacaaaat19<210〉10<211>19<212>DNA<213>artificialsequence<220><223>引物<400>10acctccttgaccagtagag19<210>11<211〉28<212>DM<213〉artificialsequence<220><223>引物<400>11cggaattccgaaaggctcaggagaaact28<210〉12<211>28<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>引物<400>12ccaagcttggtttgaggccttggtagac28<210>13<211〉28<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>引物<400>13cggaattccgctaccaaggcctcaaatc28<210>14<211>28<212〉DNA<213>artificialsequence<220〉<223>引物<400>14ccaagcttggaaccatttgtcatctgcg28权利要求1.一种亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价的检测方法，包括以下步骤在对血液或血液制品进行亚甲蓝光化学灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含有HCV病毒基因的重组质粒或HCV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中HCV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述特异性引物序列选自下组中的一组1)CGGAATTCCGACCATAGATACTCCCCT及CGGGATCCCGGAAGATAGAGAAAGAGCAACCG;2)GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG及CTGGCAATTCCGGTGTACTCA:3.如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述HCV病毒基因的重组质粒含有序列SEQIDNO:l。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述HCV病毒基因体外转录的RNA片段含有序列SEQIDNO:2。5.如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述PCR技术为普通PCR或实时荧光定量PCR。6.—种如权利要求l所述的检测方法中使用的质控品，其特征在于，质控品含有包含序列SEQIDN0:1的重组质粒或包含序列SEQIDNO:2的RNA。7.如权利要求6所述的质控品，其特征在于，所述重组质粒为序列SEQIDN0:1与pBluescriptIISK(+)重组获得的质粒。8.如权利要求6所述的质控品，其特征在于，所述RNA片段的序列为SEQIDNO:2。全文摘要本发明涉及血液病毒灭活效果质量评价领域。本发明解决了现有技术中MB-P灭活效果质量评价方法价格贵，周期长，不适合在常规工作中开展的问题，公开了一种新的亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价检测方法，包括以下步骤在对血液或血液制品进行灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含HCV病毒基因的重组质粒或含HCV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中HCV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。同时还公开了其质控品。本发明操作简单，准确度好，实验周期短，需要的实验条件容易达到，更为经济有效。文档编号C12N15/11GK101285092SQ200710039359公开日2008年10月15日申请日期2007年4月11日优先权日2007年4月11日发明者刘晓颖,迅王,琴莫,岚郑,钱开诚,黄宇闻申请人:上海市血液中心