专利名称：水稻OsCS编码序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、生理学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的柠檬酸合酶(水稻柠檬酸合酶，citrate synthase，OsCS)的克隆，拷贝数分析，基因表达模式分析，转基因载体的构建，植物转化，转基因植株的获得以及相应的生理生化特性的鉴定。
背景技术：
世界上有近40％的耕作土壤受到酸雨的侵蚀。其中铝(Al)毒是酸性土壤限制作物产量的关键因素。采用遗传工程手段培育优良品种适应不良土壤具有一定应用潜力。根系分泌的有机酸对植物吸收矿质营养具有一定的重要性。尤为重要的是，分泌有机酸提高了植物对铝毒的抗性，主要是有机酸可螯合根区铝离子，减少了铝进入细胞的量，因此使植物免遭铝毒伤害。有机酸与抗铝毒具有密切关系，在拟南芥、燕麦和小麦等物种中都有相关的报道。进行铝毒处理，不同植物以及同一植物的不同品种间，分泌有机酸的种类与能力均有所不同，主要包括柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和草酸等。
由于柠檬酸在抗铝毒上的有效性，柠檬酸合酶已成为目前研究的热点。柠檬酸合酶是线粒体内三羧酸循环和质体内乙醛酸循环起始反应中的酶，催化CoA和草酰乙酸生成柠檬酸。生成的柠檬酸不仅作为代谢的中间产物，同时其分泌植物体外具有螯合毒素离子的作用。因此，柠檬酸合成的关键酶-柠檬酸合酶的基因克隆与转基因工作也显得尤为重要。目前已在拟南芥和胡萝卜等植物品种中分离到柠檬酸合酶编码基因，并多为线粒体特异表达。柠檬酸合酶基因的遗传转化功能证明此基因的表达可提高转基因植株的柠檬酸的分泌量和植物的铝毒抗性。
本发明研究了一种从水稻中克隆催化生成柠檬酸的柠檬酸合酶(OsCS)，转入烟草后提高柠檬酸分泌量的技术。应用该技术不仅可提高铝毒处理下植物中柠檬酸分泌量，预期可以使植物在铝含量较高的土壤环境下正常生长，同时可能提高磷的有效利用率，可扩大植物(如水稻)等的栽培范围。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsCS序列及其核酸序列。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新的水稻基因OsCS，该基因是一个线粒体的柠檬酸合酶基因。
本发明的第二目的是提供这种水稻蛋白OsCS编码序列在利用转基因技术提高植物柠檬酸分泌量，以及铝毒抗性的应用。
本发明一方面提供一种分离出的DNA分子，其编码水稻柠檬酸合酶的开放阅读框，具体见SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
本发明的另一方面还提供，上述序列编码的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供了一种检测OsCS mRNA时空表达模式的方法，其步骤如下(1)取水稻幼苗(两叶一心期)叶片和根，固定，石蜡切片。
(2)利用OsCS的开放读框的RNA为探针，杂交显色。
本发明还提供了一种利用转基因技术将编码具有水稻OsCS酶活性的核苷酸序列转化入烟草以提高柠檬酸分泌量的方法，其步骤如下(1)将水稻OsCS基因的开放读框连于植物表达载体，形成含有水稻OsCS基因(SEQID NO.1的核苷酸序列)的植物表达载体；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同烟草叶片共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天；(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得水稻OsCS基因的转化细胞并再生转基因植株。含有水稻OsCS基因的转基因植株的柠檬酸分泌量有较大程度的提高。
本发明还提供了一种检测样品中水稻柠檬酸合酶拷贝数的方法，它包括用SEQ IDNO.1所示序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是水稻和转基因烟草基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。
这里所述探针为下述核酸分子，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中第893-910个连续的核苷酸和第1405-1425个连续核苷酸的反向互补序列。
本发明还提供了一种检测样品中水稻柠檬酸合酶表达模式的方法，它包括用用SEQ IDNO.1所示序列制备探针，并与样品进行杂交，然后检测是否发生了结合。该样品是水稻幼苗叶片和根的石蜡切片。
本发明还提供了一种鉴定转基因烟草的核酸分子，它包括用前述核苷酸序列与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段；样品为转基因烟草基因组DNA。
本发明的另一方面，还提供了一种测定转基因烟草柠檬酸分泌量的方法，其步骤如下(1)取胞外部分(培养液)依次通过阴阳离子交换树脂后，用盐酸将保留于阴离子交换树脂上的有机酸洗脱收集，用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，溶于700μl水，进行高效液相色谱仪测定。
(2)高效液相色谱仪测定程序流动相为50mM HClO4，柱温为50℃，流速为1.0ml/min，测定20min。
本发明的水稻OsCS蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后将各次扩增出的片断按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，在转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离到有关序列。
表1为本发明的水稻OsCS基因编码的蛋白质序列与胡萝卜(Daucus carota)，烟草(Nicotiana tabacum)，甜菜(Beta vulgaris subsp.)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，柑桔(Citrusjunos)氨基酸序列同源性比较表(相同氨基酸序列以“*”表示；相对保守序列以“”表示；线粒体靶信号以“黑体和下划线”表示)。
图1水稻OsCS基因的Southern blot鉴定。其中1-3分别为5μg基因组DNA经DraI、HindIII和EcoR I酶切图片右侧为λ-EcoT14 I digest marker。
图2OsCS在正常与Al处理下根系与叶片的原位杂交结果其中A，B，C，D为根，E，F，G，H为叶，A，E为Al处理1天，B，F为Al处理3天，C，G为Al处理5天，D，H为对照。
图3转基因植株的PCR鉴定。其中EV30为转空载体的烟草；CS8，CS42，CS50为正向转入外源OsCS的烟草植株。A，特异引物检测；B，载体引物和特异引物检测。
图4转基因植株的Southern blot鉴定。其中EV30为转空载体的烟草；CS8，CS42，CS50为正向转入外源OsCS的烟草植株。
图5转基因植株的Western blot鉴定。其中EV30为转空载体的烟草；CS8，CS42，CS50为正向转入外源OsCS的烟草植株。
图6转基因植株的根长测定。其中EV30为转空载体的烟草；CS8，CS42，CS50为正向转入外源OsCS的烟草植株。Al为0.5mM CaCl2-50μM AlCl3(pH4.5)处理1d测定根长，0.5mM CaCl2(pH4.5)处理的作为对照CK。
图7转基因植株的高效液相色谱(HPLC)鉴定。其中EV30为转空载体的烟草；CS8，CS42，CS50为正向转入外源OsCS的烟草植株。0.5mM CaCl2-50μM AlCl3(pH4.5)处理1d。
图8转基因植株的铝处理生长情况检测。其中EV30为转空载体的烟草；CS42为正向转入外源OsCS的烟草T1植株。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验手册(New YorkCold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1水稻OsCS基因的克隆1.取温室(25℃)生长的水稻叶片(两叶一心期)立即置于液氮中冷冻保存，应该注意到本实验所选取的材料与选用的水稻品种没有必然的联系。
2.DNA的提取取部分组织，用研钵研碎，加入盛有预热的裂解液的50ml离心管，65℃保温40min，离心。上清中加入RNaseA(0.5μg/ml)，65℃消化RNA 1h；以等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽一次蛋白，以乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤两遍，最后用TE溶液溶解DNA。用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的质量。
3.全长基因的克隆根据其他植物CS同源序列设计简并引物，采用RT-PCR方法从水稻cDNA中扩增出一条1.4kb左右的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用SP6和T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的柠檬酸合酶序列高度保守。
实施例2水稻OsCS基因的序列信息与同源性分析本发明新的水稻OsCS基因的长度为1425bp，详细序列见SEQ ID NO.1。该基因编码的多肽由475个氨基酸残基组成，分子量52443.55道尔顿，等电点为8.268，详细序列见SEQ ID NO.2。
将水稻OsCS全长基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序再Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDS translations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与胡萝卜，烟草，甜菜，拟南芥，柑桔的CS存在一定的同源性。在氨基酸水平上，有大于70％的相似性(见表1)。由上可见，该OsCS基因与胡萝卜，烟草，甜菜，拟南芥，柑桔的CS基因存在较高的同源性，可以认为在功能上也有很高的相似性。
BLAST的结果表明从水稻中得到的基因可能为柠檬酸合酶基因。已知的柠檬酸合酶基因催化TCA循环中的柠檬酸合成，转入植物中能提高植物柠檬酸的分泌量，同时提高铝毒抗性，故推测此基因具有相同的功能。
实施例3水稻OsCS基因的拷贝数分析以CTAB方法大量抽提水稻基因组DNA，取10μg DNA分别用DraI、EcoRI和HindIII酶切，以0.8％琼脂糖凝胶进行片段分离，将DNA转到Hybond-N+尼龙膜上，固定；以水稻OsCS基因为探针进行Southern杂交，鉴定它在水稻中的拷贝数，结果表明，OsCS基因为多拷贝。
实施例4水稻OsCS表达模式分析用原位杂交的方法检测水稻OsCS时空表达模式。铝处理后，分别取水稻幼苗(二叶一心期)的叶片和根，经石蜡切片，杂交，显色。结果表明，在正常培养条件下，OsCS在水稻的叶和根中均有表达，叶中的表达强度比根中的高。Al处理对OsCS的表达影响，主要表现在根上，随着处理时间的延长，OsCS的表达量有微弱的提高。
实施例5水稻OsCS基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定含目的基因(水稻OsCS基因)表达载体的构建根据其它植物CS同源序列设计简并引物，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻OsCS基因正向克隆到双元表达载体pBI121中，在保证阅读框架的前提下，将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。
利用叶盘法转化烟草1.用灭菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性克隆，接种于2mlYEB液体(利福平40mg/L，链霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)，28℃200rpm振荡培养24-36h；2.室温下4000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到原体积的5-20倍，使OD600＝0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去其叶主脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.将侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48h；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天见愈伤组织形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)；9.待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。
对转基因植株进行分子鉴定以CTAB方法小量抽提经部分转基因植株的基因组DNA，以转pBI121空载体的烟草作为负对照，根据水稻OsCS基因的特异序列设计引物，进行PCR检测(部分结果)。
转基因植株进行表型鉴定得到多个转基因植株，其中有三棵转基因烟草的柠檬酸分泌量比转空载型分别提高了约100％，60％和200％。推测外源OsCS基因在宿主烟草中实现了超量表达，增加了烟草柠檬酸分泌量。试验结果表明，实施例1中得到的水稻OsCS基因为有功能的基因，可以用于利用转基因技术改良水稻铝毒抗性的研究和产业化中。
表1水稻OsCS基因编码的蛋白质序列与胡萝卜(Daucus carota)，烟草(Nicotiana tabacum)，甜菜(Beta vulgaris subsp.)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，柑桔(Citrus junos)氨基酸序列同源性比较Daucus carota MVFF V LL L AVQQSNLSNTVRWFQVQTSASDLDLRSQLKELIPEQQERIKKLK 60Nicotiana tabacum MVFY V LL L AVQQTNLSNSVRWLQVQTSSG-LDLRSELQELIPEQQDRLKKLK 59Beta vulgaris subsp.-------------------------------------SSNLDLRSELQELIPEQQERLKKIK 25Arabidopsis thalianaMVFF V AF L VGQQSSLSNSVRWIQMQ-SSTDLDLKSQLQELIPEOQDRLKKLK 59Citrus junosMAFF V AL L VGQQSNLSNSVRWLQMQ-SSSDLDLHSOLKEMIPE00ERLKKVK 59OsCSMAFF L AV L VAQEATTLGGVRWLQMQ-SASDLDLKSQLQELIPEQQDRLKKLK 59: ***:*:*:*:*****:*:**:*Daucus carota AEHGKVQLGNITVDMVLGGMRGMTGLLWETSLLDPEEGIRFRGLSIPECQKLLPGAKPGG 120Nicotiana tabacum SEHGKVQLGNITVDMVLGGMRGMTGLLWETSLLDPDEGIRFRGLSIYECQKVLPAAKPGG 119Beta vulgaris subsp.KEFGSFQLGNINVDMVLGGMRGMTGLLWETSLLDPEEGIRFRGFSIPECQKLLPAASAGA 85Arabidopsis thalianaSEHGKVQLGNITVDMVIGGMRGMTGLLWETSLLDPEEGIRFRGLSIPECQKVLPTAQSGA 119
Citrus junos SELGKAQLGNITVDMVIGGMRGMTGLLWETSLLDPDEGIRFRGLSIPECQKLLPAAKPDG 119OsCS SEHGKVQLGNITVDMVLGGMRGMTGMLWETSLLDPDEGIRFRGLSIPERQKVLPTAVKDG 119* *. *****.****:********:*********:*******:** * **:** * ..
Daucus carotaEPLPEGLLWLLLTGKVPTKEQVDALSAELRSRAAVPEHVYKTIDALPVTAHPMTQFATGV 180Nicotiana tabacumEPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDSLSQELRSRATVPDHVYKTIDALPVTAHPMTQFATGV 179Beta vulgaris subsp. EPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDALSADLRKRASIPDHVYKTIDALPITAHPMTQFCTGV 145Arabidopsis thaliana EPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVEALSKDLANRAAVPDYVYNAIDALPSTAHPMTQFASGV 179Citrus junos EPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDGLSKELRDRATVPDYVYKAIDALPVTAHPMTQFASGV 179OsCS EPLPEGLLWLLLTGKVPTKEQVDALSKELASRSSVPGHVYEAIDALPVTAHPMTQFTTGV 179*****************:****:.** :* .*:::* :**::***** ******** :**Daucus carotaMALQVQSEFQKA-YEKGIHKTKYWEPTYEDSITLIAQLP-VVAAYIYRRMYKNGQSISTD 238Nicotiana tabacumMALQVQSEFQKA-YEKGIHKSKLWEPTYEDSMSLIAQVP-LVAAYVYRRMYKNGNTIPKD 237Beta vulgaris subsp. MALQTQSEFQKA-YEKGIHKSKFWEPTYEDCLSLIAQVP-VVAAYVYRRMYKNGQVIPLD 203Arabidopsis thaliana MALQVQSEFQKA-YENGIHKSKFWEPTYEDCLNLIARVP-VVAAYVYRRMYKNGDSIPSD 237Citrus junos MALQVQSEFQEA-YEKGIHKSKYWEPTYEDSLNLIARVP-VVAAYVYQRIYKDGKIIPKD 237OsCS MALQVESEFQKSPMTKGMSKSKFWEPTYERLLKFDSSPSSSGLSYVYRRIFKGGKTIAAD 239****..****:: :*: *:* ****** :.: : .:*:*:*::*.*. *. *Daucus carotaDSLDYGANFAHMLGYDSPSMQELMRLYVTIHTDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAA 298Nicotiana tabacumDSLDYGANFAHMLGFSSSDMHELMKLYVTIHSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAA 297Beta vulgaris subsp. DSLDYGGNFAHMLGFDSPQMLELMRLYVTIHSDHEGGNVSAHTGHLVGSPLSDPYLSFAA 263Arabidopsis thaliana KSLDYGANFSHMLGFDDEKVKELMRLYITIHSDHEGGNVSAHTGHLVGSALSDPYLSFAA 297Citrus junos DSLDYGGNFSHMLGFDDPKMLELMRLYVTIHSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAA 297OsCS NALDYAANFSHMLGFDDPKMLELMRLYITIHTDHEGGNVSAHTGHLVGSALSDPYLSFAA 299.:***..**:****:.. .: ***:**:***:***************.*.**********Daucus carotaALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVSECGENVTKEQLKDYIWKTLNSGKVVPGYGHGVLR 358Nicotiana tabacumALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVEECGENISKEQLKDYAWKTLKSGKVVPGFGHGVLR 357Beta vulgaris subsp. ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVDECGENISTEQLKDYVWKTLNSGKVVPGFGLGVLR 323Arabidopsis thaliana ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVEECGEDISKEQLKEYVWKTLNSGKVIPGYGHGVLR 357Citrus junos ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVDECGENVTTEQLKDYVWKTLNSGKVVPGFGHGVLR 357OsCS ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVIGETGSDVTTDQLKEYVWKTLKGGKVVPGFGHGVLR 359************************: * *.:::.:***:* ****:.***:**:* ****Daucus carotaNTDPRYICQREFALKHLPDDPLFQLVSNLFEVVPPILTELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 418
Nicotiana tabacumKTDPRYTCQREFALKHLPEDPLFQLVAKLYEVFLQFLQNLAKLN-PWPNVDAHSGVLLNY 416Beta vulgaris subsp. KTDPRYTCQREFALKHLPDDPFFQLVSKLYEVVPPILLELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 383Arabidopsis thaliana NTDPRYVCQREFALKHLPDDPLFQLVSKLYEVVPPVLTELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 417Citrus junos KTDPRYTCQREFALKHLPDDPLFQLVSKLFEVVPPILTKLGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 417OsCS KTDPRYTCQREFALKYLPEDPLFQLVSKLYEVVPPILTELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 419:***** ********:**:**:****::*:**. .*:*.*:: **************:
Daucus carotaYGLTEARYYTVLFGVSRAIGICSQLVWDRALGLPLERPKSVTMEWLENHCKKSS--472Nicotiana tabacumYGLTEARYYTVLFGVSRALGICSQLIWDRALGLPLERPKSVTMEWLENHCKKA---469Beta vulgaris subsp. YGLTEARYYTVLFGVSRSLGICSQLIWDRALGLPLERPKSVTMEWLEKFCKRRA--437Arabidopsis thaliana YGLTEARYYTVLFGVSRSLGICSQLIWDRALGLALERPKSVTMDWLEAHCKKASSA 473Citrus junos FGLAEARYYTVLFGVSRSLGICSQLIWDRALGLPLERPKSVTLDWIE--------- 464OsCS FGLSEARYYTVLFGVSRSIGIGSQLIWDRALGLPLERPKSVTMEWLENHCKKVAA-474:**:*************::** ***:*******.********::*:*
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度1425bp(B)类型核苷酸(C)链型单链-(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11 ATGGCGTTCTTCAGGGgCCTGACCGCGGTGTCGAGGCTTCGATCCCGCGTGGCACAGGAG61 GCCACCACGCTTGGTGGTGTGCGATGGCTGCAGATGCAGAGCGCATCTGATCTTGATCTC121 AAGTCCCAGCTGCAGGAATTGATTCCTGAACAACAGGACCGCTTAAAGAAACTTAAATCG181 GAGCATGGAAAGGTCCAACTTGGAAATATAACAGTCGATATGGTCCTTGGTGGGATGAGA241 GGGATGACTGGAATGCTTTGGGAAACATCATTGCTTGACCCGGATGAGGGTATTCGTTTT301 AGGGGTCTCTCGATTCCAGAGCGCCAGAAAGTGCTGCCGACAGCAGTTAAAGATGGGGAG361 CCTTTGCCTGAGGGTCTACTTTGGCTTCTTTTGACCGGAAAGGTGCCAACCAAAGAGCAA421 GTTGATGCTCTATCAAAGGAATTGGCTAGTCGTTCGAGTGTTCCAGGTCATGTGTATGAG481 GCAATCGATGCTCTTCCTGTAACTGCTCATCCGATGACCCAGTTTACCACAGGAGTGATG541 GCACTTCAGGTGGAGAGTGAGTTTCAAAAAAGCCCTATGACAAAGGGAATGTCAAAATCA601 AAGTTCTGGGAGCCTACCTATGAAAGATTGCTTAAATTTGATAGCTCGCCTTCCAGCAGT661 GGCCTTTCATATGTTTACCGGAGGATATTCAAGGGAGGGAAAACTATAGCAGCTGATAAT721 GCACTGGATTATGCAGCAAATTTTTCACACATGCTTGGGTTTGATGATCCCAAAATGCTT781 GAGTTGATGCGACTATATATAACAATCCACACTGATCATGAAGGTGGAAACGTCAGTGCT841 CATACTGGACATCTGGTTGGAAGTGCTCTGTCAGACCCTTATCTTTCTTTTGCAGCTGCA901 CTGAATGGTTTAGCTGGACCGTTGCACGGCCTGGCTAATCAGGAAGTGTTGTTGTGGATC961 AAATCTGTAATAGGTGAGACTGGTAGTGACGTTACAACTGATCAACTCAAAGAGTATGTG1021 TGGAAGACACTAAAAGGTGGAAAGGTTGTTCCTGGCTTTGGTCATGGAGTTCTACGTAAG1081 ACCGATCCACGGTATACATGTCAGAGGGAGTTTGCTTTGAAGTACTTGCCTGAGGATCCA1141 CTTTTCCAACTGGTCTCCAAGTTGTATGAAGTTGTGCCTCCTATCCTCACTGAGCTTGGC1201 AAGGTCAAAAACCCATGGCCTAATGTTGATGCTCACAGCGGAGTTCTACTGAACCACTTT1261 GGATTATCTGAAGCTCGGTATTACACTGTTCTTTTCGGAGTTTCAAGGAGCATTGGAATA1321 GGATCTCAGCTCATTTGGGACCGTGCTCTTGGCCTGCCGCTCGAAAGACCGAAGAGTGTC1381 ACCATGGAGTGGCTGGAGAACCACTGCAAGAAGGTTGCTGCTTGA
(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度474氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.21 MAFFRGLTAV SRLRSRVAQE ATTLGGVRWL QMQSASDLDL KSQLQELIPE51 QQDRLKKLKS EHGKVQLGNI TVDMVLGGMR GMTGMLWETS LLDPDEGIRF101 RGLSIPERQK VLPTAVKDGE PLPEGLLWLL LTGKVPTKEQ VDALSKELAS151 RSSVPGHVYE AIDALPVTAH PMTQFTTGVM ALQVESEFQK SPMTKGMSKS201 KFWEPTYERL LKFDSSPSSS GLSYVYRRIF KGGKTIAADN ALDYAANFSH251 MLGFDDPKML ELMRLYITIH TDHEGGNVSA HTGHLVGSAL SDPYLSFAAA301 LNGLAGPLHG LANQEVLLWI KSVIGETGSD VTTDQLKEYV WKTLKGGKVV351 PGFGHGVLRK TDPRYTCQRE FALKYLPEDP LFQLVSKLYE VVPPILTELG401 KVKNPWPNVD AHSGVLLNHF GLSEARYYTV LFGVSRSIGI GSQLIWDRAL451 GLPLERPKSV TMEWLENHCK KVAA
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有水稻柠檬酸合酶活性的开放读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一种将如权利要求1所述的编码具有水稻柠檬酸合酶的核苷酸序列转入烟草以提高柠檬酸分泌量的方法，其特征在于具体步骤如下(1)将编码具有水稻柠檬酸合酶的核苷酸序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1的载体；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同烟草叶片共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天；(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并最终再生转基因植株，转基因植物的柠檬酸分泌量增加。
4.一种用于检测样品中水稻柠檬酸合酶拷贝数的方法，其特征在于它包括用权利要求1中所述序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合；该样品是水稻和转基因烟草基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。
5.用于鉴定转基因烟草的核酸分子，其特征在于，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中893-910个连续的核苷酸和1405-1425个连续核苷酸的反向互补序列。
6.一种用于检测样品中是否存在水稻柠檬酸合酶核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求5所述核苷酸序列与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段；样品为转基因烟草组DNA。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种在水稻中表达的柠檬酸合酶的编码序列及其在提高植物柠檬酸分泌的应用，进而预期能相应的提高植物的铝毒抗性。本发明涉及包含上述基因的重组表达载体，还涉及所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物柠檬酸分泌量显著增高，对铝毒的抗性也有相应的增强。
文档编号C12N9/00GK101058816SQ200710039409
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月12日 优先权日2007年4月12日
发明者明凤, 张珊珊, 沈大棱 申请人:复旦大学