尼古丁处理后树突状细胞用于预防和治疗肿瘤的制作方法

专利名称：尼古丁处理后树突状细胞用于预防和治疗肿瘤的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及用尼古丁处理树 突状细胞的方法，还涉及通过该方法得到的可用于预防和治疗肿瘤的树突状细 胞及其组合物和用途。
背景技术：
肿瘤，是当前威胁人类健康的主要疾病之一。据WTO统计，2002年全世界 因恶性肿瘤死亡人数达710.6万。我国2000年癌症发病人数180-200万，死亡人 数140-150万。因此，肿瘤发生及其预防和治疗已成为生命科学领域研究的重点 和热点。
肿瘤发生是一个极为复杂的过程，它涉及机体外部多因素、机体内部多系 统，由外部因素通过内部因素发挥交互作用而进行的过程，即是一个系统性疾 病的过程。
免疫系统在机体内发挥着免疫防御、免疫调节、免疫监视的功能，该功能 的发挥主要依赖于机体固有免疫应答和适应性免疫应答。现在的研究表明，树 突状细胞(Dendritic ce仏DC)启动适应性免疫应答的启始阶段(即启动对抗原的 摄取和递呈)，并对固有性免疫应答的主要成分自然杀伤细胞(Nature Killer cell， NK)的功能具有调节作用。因此，树突状细胞已成为肿瘤免疫治疗的研究热点。
多个实验系统证实，经肿瘤抗原、肿瘤裂解物、肿瘤抗原肽负载的树突状 细胞能够在机体内诱导针对肿瘤的免疫应答，并导致肿瘤的消退。此方法在人 体临床实验中也已获得初步成功，并由此证实了在肿瘤发生前建立针对肿瘤的 特异性免疫可以预防肿瘤的形成，该理论成为肿瘤疫苗研制的理论基础。基于 肿瘤抗原诱导特异性免疫应答的肿瘤免疫治疗方法成为手术、化疗、放疗的有 益补充和替代治疗手段。
树突状细胞是介导机体产生抗肿瘤免疫的关键细胞。增强树突状细胞的诱 导免疫应答的能力成为肿瘤免疫治疗的关键，其方法包括肿瘤抗原负载、抗原基因转染、肿瘤总RNA负载、细胞因子刺激等。然而，细胞因子刺激或分子转
染中刺激物的稳定性相对较差，其还存在价格昂贵、及使用不便的缺点。
乙酰胆硷、胆碱酯酶和乙酰胆硷烟碱样受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAchR)在神经系统和非神经细胞(如免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞) 中有广泛的表达。nAchR配体一一尼古丁，是由芳族六元环(吡啶)和脂族五元环 (吡咯烷)通过单键连接而形成的天然化合物。提纯后的尼古丁是一种味苦、无色 透明的油质液体，挥发性强，在空气中极易氧化成暗灰色，能迅速溶于水及酒 精中，通过口鼻支气管粘膜很容易被机体吸收，粘在皮肤表面的尼古丁亦可被 吸收渗入体内。它具有性质稳定、易于获得和价廉的优点。
目前，尼古丁作为药物已广泛应用于神经退行性疾病和溃疡性结肠炎的治 疗，但尚未有关于用尼古丁处理树突状细胞，并将处理后的树突状细胞用于肿 瘤的预防和治疗的文献报道。
本领域迫切需要找到可简单、经济、安全、有效地增强树突状细胞诱导免 疫应答的能力的方法和试剂，并需要开发出可有效用于肿瘤免疫治疗的树突状 细胞及其组合物。
本发明的目的正是提供一种通过尼古丁刺激，可用于预防和治疗肿瘤的树 突状细胞及其组合物，以及该细胞或组合物在制备预防和治疗肿瘤的药物中的 用途。
在本发明的第一方面中，提供了一种制备树突状细胞方法，所述方法包括以 下步骤
(1) 在摩尔浓度为lX10力 lX10^摩尔/升的尼古丁或其盐存在的条件下，培
养未成熟的树突状细胞；
(2) 收集处理后的树突状细胞。
在本发明的一个优选例中，步骤(l)中的培养时间为6-72小时，更优选8-48
(-)-尼古丁
发明内容小时，更优选10-24小时，最优选12-14小时。
在本发明的一个优选实施方式中，所述方法还包括步骤在步骤(1)和(2)之
间，使步骤(l)中所得的尼古丁处理后的细胞与肿瘤抗原接触。
在本发明的一个优选例中，所述肿瘤抗原是肿瘤细胞的裂解物、溶解物或人 工合成的肿瘤抗原。
在本发明的另一优选例中，所述接触时间为l-24小时，更优选2-12小时，更 优选3-8小时，最优选4小时。
在本发明的另一优选例中，所述肿瘤抗原的浓度为0.1-10mg/ml，优选 0.5-5mg/ml，最优选l-2mg/ml。
在本发明的一个优选实施方式中，所述尼古丁或其盐的浓度为l X 10'8 1 X 10—4摩尔/升。
在本发明的一个优选例中，所述尼古丁或其盐的浓度为l X 10—7 1 X 10'5摩尔/ 升，最优选lX10々摩尔/升。
在本发明的另一优选例中，所述尼古丁的盐选自尼古丁的琥珀酸盐、硫酸 盐、盐酸盐。
在本发明的另一优选例中，所述尼古丁的来源为化学合成、提取自天然 植物。所述天然植物选自烟草、番茄、枸杞子等。
在本发明的另一优选例中，所用尼古丁或其盐为尼古丁或其盐在水、培养 基或醇中的溶液，所述醇优选乙醇。
在本发明的一个优选实施方式中，所述树突状细胞为获自哺乳动物的未成熟 树突状细胞。
在本发明的一个优选例中，所述树突状细胞是大鼠、小鼠或人的树突状细胞， 优选为人的树突状细胞。
在本发明的第二方面中，提供了一种树突状细胞，所述树突状细胞是用上文 所述方法中的任一种方法制备得到的。
在本发明的一个优选实施方式中，所述树突状细胞细胞表面a7尼古丁受体表 达量与未经处理的树突状细胞提高相比提高了 15-60%，且细胞表面共刺激分子 CD80、 CD86、 CD40、 CDllb和CD54的表达量与处理前的树突状细胞相比提高了 100-300%。
在本发明的一个优选例中，细胞表面a7尼古丁受体表达量提高了20-5()Q/。，最 优选提高了 23-28%。在本发明的另一优选例中，细胞表面共刺激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDllb 和CD54的表达量提高了 120-250%，最优选提高了 100-200%。 在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，其包含
i) 用本发明的方法制得的树突状细胞；和
ii) 药学上可接受的载体。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物中所述树突状细胞的量为 104-108个。
在本发明的一个优选实施例中，所述药物组合物中含有105-107个树突状细 胞，更优选含有106-107个树突状细胞。
在本发明的一个优选例中，所述药物组合物用于预防和/或治疗肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发
性肝癌、淋巴瘤。
在本发明的一个优选例中，所述组合物中还含有从脾脏、外周血诱导的T淋 巴细胞或自然杀伤细胞，或在给予本发明的树突状细胞之前、之时或之后给予 T淋巴细胞和自然杀伤细胞。
在本发明的另一优选实施例中，所述药物组合物中还包含选自下组的其它 治疗剂或活性成分如TNF-a、 TNF-b、 IFN-a、血管它丁、内皮它丁、甘磷酰 芥、血B卜啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙、脱水卫矛醇、阿霉素、三 苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、 冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、 氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林 诺特肯、来屈唑或替尼泊甙。
在本发明的第四方面中，提供了本发明的树突状细胞在制备用于预防和/或治 疗肿瘤的药物中的用途。
在本发明的第五方面中，提供了一种尼古丁的用途，其用于制备具有肿瘤 预防和/或治疗功能的树突状细胞或具有增强的诱导免疫应答能力的树突状细 胞。
在本发明的另一方面，还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含
i) 容器；
ii) 装于容器中的用本发明的方法制得的树突状细胞或本发明的组合物；和
iii) 任选的使用说明书。本发明用尼古丁刺激树突状细胞的方法简单、经济、安全、有效，其中尼 古丁作为化合物，具有细胞因子刺激或分子转染所无法比拟的经济、稳定、方 便的优点。
本发明树突状细胞诱导免疫应答的能力提高，具有良好的抑制和治疗肿瘤 的效果，其对表达肿瘤非特异性抗原和/或特异性抗原的肿瘤具有预防和治疗效 果，可用于各种肿瘤。


图l所示为ci7 nAchR受体组成性的表达于成熟和未成熟的树突状细胞。
imDC:未成熟树突状细胞；maDC;成熟的树突状细胞；d:培养天数；0t BTX-FITC:以FITC荧光素标记的银环蛇毒素。
图2所示为尼古丁对树突状细胞表达a7nAchR受体的促进作用。DC:树突状细胞；Ni:尼古丁； BTX:银环蛇毒素。
图3所示为尼古丁对未成熟树突状细胞表达表面共刺激分子和a7 nAchR的促进作用。
图4所示为尼古丁对未成熟和成熟树突状细胞的吞噬能力的增强作用。A: 未成熟DC和成熟DC的流式细胞分析；B:未成熟DC流式细胞分析；C:成熟 DC的流式细胞分析；D:柱状图，显示尼古丁和拮抗剂比较有明显的统计学差 异。
图5所示为尼古丁对抗原依赖性的杀伤性T细胞增殖的促进作用。A:尼古 丁促进鸡卵白蛋白依赖性的杀伤性T细胞增殖；B:尼古丁促进鸡卵白蛋白特异 性表位多肽依赖性的杀伤性T细胞增殖。imD。未成熟树突状细胞；maDC: 成熟树突状细胞；Ni:尼古丁； BTX/BGTX:银环蛇毒素；GF257:鸡卵白蛋 白特异性表位多肽；OVA:鸡卵白蛋白。
图6所示为尼古丁处理后DC体内转输对表达肿瘤特异性抗原的肿瘤的预防 效果。
图7所示为尼古丁处理后DC体内转输对表达肿瘤非特异性抗原的肿瘤的预 防效果。
图8所示为尼古丁处理后DC体内转输对肿瘤的治疗效果。
具体实施例方式
本发明人通过长期而深入的研究发现通过尼古丁刺激可以提高树突状细 胞诱导免疫应答的效率，转输经尼古丁处理后的树突状细胞可有效预防和治疗 肿瘤。经实验迸一步证实，尼古丁不但可促进骨髓来源树突状细胞上调表达
nAchR、共刺激分子CD80和CD86的表达，而且还可促进树突状细胞对抗原的 吞噬，可用于预防表达肿瘤特异性抗原的肿瘤的形成。此外，发明人还发现用 尼古丁和肿瘤抗原联合处理树突状细胞可提高对表达肿瘤特异性或非特异性 抗原的肿瘤的预防和治疗作用。发明人在此基础上完成了本发明。
尼古丁
本发明中所用的尼古丁为具有下式结构的化合物或其生物学上、药学上可 接受的盐
(-)-尼古丁
本发明的尼古丁可采用提取自天然植物，例如烟叶、多种茄科植物的果实 (如番茄、枸杞子等)，也可采用化学合成的尼古丁。
提纯后的尼古丁是一种味苦、无色透明的油质液体，挥发性强，在空气中 极易氧化成暗灰色，能迅速溶于水及酒精中。因此，可在施用前，将尼古丁溶 于水、培养基或醇(例如乙醇、丙醇)中配制成溶液。
本发明用于处理树突状细胞的尼古丁的浓度为1乂10-9~1乂10-3摩尔/升，优
选lX10-8 lX10-4摩尔/升，更优选1X 10—7-1 X10-5摩尔/升，最优选1X10'7摩尔/升。
树突状细胞
如本文所用，术语"本发明的树突状细胞(DC)"、"尼古丁处理的树突状 细胞"可互换使用，均指用尼古丁刺激后能起到预防和/或治疗肿瘤作用的树突 状细胞，其中还包括在尼古丁处理后用肿瘤抗原进一步处理的树突状细胞。
用于本发明的树突状细胞可获自哺乳动物，优选获自大鼠、小鼠或人。在 本发明的一个实施方式中，所述树突状细胞获自小鼠。在本发明的另一实施方式中，所述树突状细胞获自人。
用于本发明的树突状细胞可为未成熟的树突状细胞。可使用本领域已知的
方法(例如GM-CSF、 IL-4等)从骨髓细胞、脐带血细胞、外周血等单核细胞诱导 产生。
用尼古丁处理树突状细胞
在本发明中，用尼古丁处理所得的树突状细胞，以获得本发明的树突状细 胞，所述方法包括以下步骤
(1) 在摩尔浓度为lX10" lXl(^摩尔/升的尼古丁或其盐存在的条件下，培 养未成熟的树突状细胞；
(2) 收集处理后的树突状细胞。
在本发明的优选实施方式中，所用尼古丁的终浓度为ixlcr9 1 x 10—3摩尔/
升，优选为lX10-s lX10"摩尔/升，更优选lX10llX10's摩尔/升，最优选l
xio々摩尔/升。
在本发明的优选实施方式中，尼古丁处理时间为6-72小时，更优选8-48小 时，更优选10-24小时，最优选12-14小时。
收集本发明的树突状细胞后，可采用流式细胞术等方法对其表面的尼古丁 a7受体的表达量进行检测。在本发明的优选实施方式中，该受体在本发明树突状细 胞表面的表达量与处理前的树突状细胞相比提高了 15-60%，更优选提高了20-50%， 最优选提高了23-28%。
在本发明的优选实施方式中，还对本发明树突状细胞表面共刺激分子的表达进 行了检测。共剌激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDUb和CD54在本发明树突状细胞 表面的表达量与处理前的树突状细胞相比提高了 100-300%,更优选提高了 120-250%，最优选提高了 100-200%。
同时研究表明本发明的经尼古丁处理的树突状细胞能促进未成熟和成熟树突 状细胞的吞噬功能、增强树突状细胞的抗原递呈功能以及促进产生效用性CTL。从
而可用于预防和治疗肿瘤。
在本发明的优选实施方式中，所述方法还包括使肿瘤抗原与步骤(l)中的树 突状细胞接触的步骤。
在本发明的优选实施方式中，所用肿瘤抗原选自肿瘤细胞的裂解物、溶解 物或人工合成的肿瘤抗原，其浓度为0.1-10mg/ml，优选0.5-5mg/m，最优选1- 2mg/ml。在本发明的优选实施方式中，用肿瘤抗原处理的时间为l-24小时，更优选2-12小时，更优选3-8小时，最优选4小时。由上述方法所得的树突状细胞表面a7尼古丁受体表达量比未经处理的树突状细胞提高25%以上，且所述细胞对肿瘤发生和生长具有抑制作用。可将本发明的树突状细胞通过注射等方式，直接给予需要预防或治疗肿瘤的对象。也可将体外处理后的细胞回输到细胞供应者的体内。所述细胞的用量优选为104-108个树突状细胞/次，更优选为105-107个树突状细胞/次，最优选为106-107个树突状细胞/次。组合物如本文所用，术语"本发明的组合物"是指含有本发明的经尼古丁处理的树突状细胞作为活性成分的组合物，其中包括药物组合物。药物组合物可含有(a)有效量的本发明树突状细胞；以及(b)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"中。本发明中，"药学上可接受的"成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences, MackPub.Co.， N丄1991年)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。本文所用的术语"有效量"指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的 量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。用本发明方法制备的树突状细胞可以广泛应用于预防和治疗各种肿瘤，代表性的例子包括(但并不限于)乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性肝癌、淋巴瘤等。本发明的用于预防和治疗各种肿瘤的药物组合物含有安全有效量的本发明上述经尼古丁处理的树突状细胞的细胞群，优选含有104-108个树突状细胞/ 剂，更优选含有105-107个树突状细胞/剂，最优选含有106-107个树突状细胞/剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于) 肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。也可通过转输给予本发明 的组合物或用尼古丁处理的树突状细胞。如本文所用，术语"转输"是指将细 胞在体外处理后输入或回输入机体。本发明的组合物中还可含有从脾脏、外周血诱导的T淋巴细胞或自然杀伤 细胞。也可在给予本发明的树突状细胞之前、之时或之后给予T淋巴细胞和自然杀伤细胞。使用药物组合物时，是将安全有效量本发明的树突状细胞施用于哺乳动物。在本发明的另一个优选例中，每天施用1 6剂本发明的组合物，优选施用 1 3剂；最优选的，每天服用的剂量为l剂。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。在治疗和预防肿瘤时，本发明的树突状细胞可以单用，还可同时和其它治 疗剂或治疗方法联用。所述其它治疗剂包括(但不限于)如TNF-a、 TNF-b、 IFN-a、血管它丁、内 皮它丁、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙、脱水卫矛 醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、 三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉 醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、 洛波铂、依林诺特肯、来屈唑或替尼泊甙等。所述其它治疗方法包括(但不限于)放射疗法、化学疗法或手术疗法等。本发明的优点本发明的方法和树突状细胞具有如下的优点1) 首次利用尼古丁对树突状细胞进行了表达刺激，其中尼古丁作为化合物，具有细胞因子刺激或分子转染所无法比拟的经济、稳定、方便的优点；2) 本发明的方法简单、经济、安全、有效；3) 本发明树突状细胞诱导免疫应答的能力提高，具有良好的抑制和治疗肿 瘤的效果，其对表达肿瘤非特异性抗原和/或特异性抗原的肿瘤具有预防和治疗效果，可用于各种肿瘤。实施例以下将以实施例进一步说明本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明， 但不以任何方式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的常规方法及材料皆可应 用于本发明方法中。实施例l.树突状细胞的体外尼古丁处理顏腳鄉潘扁雌将小鼠(C57BL/6，中国科学院上海实验动物中心，雌性，《8周龄)处死后， 在无菌条件下分离骨髓细胞。低渗法破解红细胞后，以GM-CSF 10ng/mL和IL-4 lng/mL(购自R&D公司)诱导树突状细胞。培养4天后(37"， 5。/oC02)以无菌PBS 洗去悬浮细胞后，即得未成熟的树突状细胞。将该未成熟的树突状细胞，按106个细胞/6厘米细胞培养皿的密度，以1X 1(T、lXl(rS摩尔/升的尼古丁刺激12-14小时，即得尼古丁处理后的树突状细胞。舰犹雄表鹏才7一受歸澄層微通过流式细胞术检测树突状细胞表面表达的尼古丁a7的受体，以a BTX-FITC染色。在第四天时树突状表面表达尼古丁a7受体的平均荧光密度为2.03。而到第 六天和第八天时，该数值分别增加到2.23和4.04，当以LPS(内毒素)诱导树突状 细胞成熟时，该受体密度增加到35.13(见图1)。继用尼古丁处理树突状细胞可提高该细胞表面尼古丁a7受体的表达。实施例2.经尼古丁处理的树突状细胞表面a7受体表达的增加
实邀方兹
按照实施例l所述的方法获得尼古丁处理的树突状细胞，并用流式细胞术 检测该细胞在第4、 6、 8天及用LPS诱导的成熟树突状细胞(内毒素LPS从开始培 养起算，直接加入，10ng/mL，经过4天LPS的诱导刺激的aBTX-FITC荧光密度， 以反映树突状细胞表面a7受体的表达情况。
同时，分别以未用尼古丁诱导的未成熟树突状细胞和先以lX10-s摩尔/升尼 古丁拮抗剂银蛇环毒素作用l小时，再以尼古丁剌激的未成熟树突状细胞作为 对照，比较表达a7受体的阳性细胞的百分率。
实邀錄菜
在第4天时，受体的平均荧光密度为2.03;到第6天和第8天时，该数值分别 增加到2.23和4.04;当以LPS诱导树突状细胞成熟时，该受体密度增加到35.13(图1)。
培养4天的未成熟树突状细胞有36.87%的细胞表达该受体；以1乂10'7摩尔/ 升的尼古丁刺激12小时后，表达该受体的阳性细胞数增加到60.58%;而先以l X10-s摩尔/升尼古丁拮抗剂银蛇环毒素作用l小时，再以尼古丁刺激时，该阳性 细胞百分率降低到52.97。/。(见图2)。
继
树突状细胞表面oc7受体的表达受尼古丁分子的调控。
实施例3.尼古丁处理对树突状细胞表面共剌激分子表达的促进作用
实邀诚
实验方法同实施例l。
实麥，
树突状细胞表达共刺激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDllb和CD54。未成熟 树突状细胞经尼古丁刺激后，其表面的上述分子分别有130%-200%表达增加。裙论尼古丁处理能促进树突状细胞表面共刺激分子的表达。实施例4.尼古丁促进未成熟和成熟树突状细胞的吞噬功能实邀旅将如上所述获得的经GM-CSF、 IL-4诱导的未成熟和成熟树突状细胞以上 述的尼古丁及其拮抗剂银蛇环毒素作用后，加入终浓度为5mg/mL的 Dextran-FITC，在37。C下的常规细胞培养条件下培养30分钟，用PBS洗涤3次后， 以流式细胞仪检测树突状细胞吞噬的Dextran的荧光密度。实凝翁菜和成熟树突状细胞相比，未成熟树突状细胞具有更强的吞噬能力。当以尼 古丁刺激后，成熟或未成熟树突状细胞的吞噬能力与同工型的对照相比均有明 显增加。当以拮抗剂拮抗尼古丁的作用后，上述吞噬能力增加的趋势得到明显 扭转(PO.05)(见图4)。碧讼尼古丁能有效促进未成熟和成熟树突状细胞的吞噬功能。实施例5.尼古丁处理增加树突状细胞的抗原递虽功能并产生效应性的CTL实凝減以尼古丁联合抗原鸡卵白蛋白(OVA)或OVA特异性的杀伤性T细胞表位肽 剌激未成熟树突状细胞后，将上述树突状细胞和T淋巴细胞按照1: IO比例混合， 以进行混合淋巴细胞反应(MLR)。 MLR在常规细胞培养条件培养5天后，以酶联 免疫斑点分析技术检测抗原特异性的杀伤性T细胞的数量。魏分邀本实验中的GF257为OVA的杀伤性T细胞表位；OVA为鸡卵白蛋白。 ImDC/Ni+0VA为尼古丁处理后的树突状细胞+OVA组；imDC/OVA为OVA 刺激的树突状细胞组；imDC/Ni/OVA为尼古丁联合OVA处理组；imDC/GF257 为肿瘤抗原肽(SIINFEKL多肽)处理树突状细胞组；imDC/尼古丁为单纯尼古丁处理树突状细胞组；imDC/Ni/GF257为尼古丁联合SIINFEKL处理组； imDC/BGTX/Ni/GF257为银环蛇毒素、尼古丁、 SIINFEKL联合处理组。
频兹眉
以酶联免疫斑点实验ELISPOT检测增殖细胞中抗原特异性杀伤性T细胞 CTL的数量，尼古丁处理后树突状细胞再以鸡卵白蛋白OVA刺激后，其刺激T 细胞增殖的能力得到明显增强，并显示尼古丁作用后树突状细胞可诱导更多的 抗原特异性CTL(见图5)。当以拮抗剂拮抗尼古丁的作用后，上述能力增加的趋 势得到明显扭转(P〈0.05)(见图5)。
翁论
用尼古丁处理树突状细胞可极大提高该细胞的抗原递呈功能，并由此产生 更多的效应性CTL。
实施例6.转输尼古丁处理后树突状细胞在预防肿癍的作用
实毅方法
以尼古丁刺激树突状细胞(同实施例l)、或以尼古丁联合肿瘤抗原肽 (SIINFEKL)或EL4肿瘤细胞裂解物刺激树突状细胞，再以腹腔内注射法将5X 105个上述树突状细胞转输到小鼠体内，转输2天后再于小鼠颈部皮下接种2X 106个肿瘤细胞。10-14天后处死小鼠，取瘤称重。
实膽菜
当将5乂105个尼古丁处理树突状细胞转输小鼠体内，2天后再以2乂106个同 基因背景的表达OVA的小鼠肿瘤细胞系荷瘤时，尼古丁处理后的树突状细胞及
尼古丁刺激联合肿瘤抗原肽负载的树突状细胞可产生抗原特异性的抗肿瘤保 护作用，其抑瘤率分别达96.1°/。和98.7%(图6)。
当以不表达特异性抗原的肿瘤细胞EL4荷瘤转输树突状细胞小鼠时，尼古 丁刺激联合肿瘤抗原肽负载树突状细胞的细胞转输可产生40%的抑瘤率(图7)。
兹论
尼古丁处理后树突状细胞可用于有效预防肿瘤。实施例7.转输尼古丁处理后树突状细胞在肿癍治疗中的作用
实验方法
于小鼠颈部皮下接种2乂106个肿瘤细胞，2天后再以腹腔内注射方式转输5 X1()S个尼古丁处理、尼古丁联合肿瘤抗原肽(SIINFEKL)或肿瘤细胞裂解物刺激 的树突状细胞，转输10-14天后处死小鼠，取瘤称重。
实验兹菜
当先以2X1(^个同基因背景的表达0VA的小鼠肿瘤细胞系荷瘤，2天后再 以5乂105个尼古丁处理后树突状细胞转输小鼠体内，尼古丁处理后的树突状细 胞及尼古丁刺激联合肿瘤抗原肽负载的树突状细胞可产生抗原特异性的抗肿 瘤保护作用，其抑瘤率分别达53%和89.4%。
当以不表达肿瘤特异性抗原的小鼠淋巴瘤细胞系EL4荷瘤小鼠时，尼古丁 刺激联合肿瘤溶解物负载的树突状细胞时，其抑瘤率达62.6%(图8)。
潜讼
尼古丁处理后树突状细胞可用于有效治疗肿瘤。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种制备树突状细胞方法，所述方法包括以下步骤(1)在摩尔浓度为1×10-9～1×10-3摩尔/升的尼古丁或其盐存在的条件下，培养未成熟的树突状细胞；(2)收集处理后的树突状细胞。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤在步骤 (1)和(2)之间，使步骤(l)中所得的尼古丁处理后的细胞与肿瘤抗原接触。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述尼古丁或其盐的浓度为l X10'8~1X10—4摩尔/升。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述树突状细胞为获自哺乳动 物的未成熟树突状细胞。
5. —种树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞是用权利要求l-4中任一项 所述的方法制备得到的。
6. 如权利要求5所述的树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞细胞表面a7 尼古丁受体表达量与未经处理的树突状细胞提高相比提高了 15-60%，且细胞表面 共刺激分子CD80、 CD86、 CD40、 CDllb和CD54的表达量与处理前的树突状细胞 相比提高了 100-300%。
7. —种药物组合物，其包含.-i) 用权利要求l-4中任一项所述的方法制得的树突状细胞；和ii) 药学上可接受的载体。
8. 如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中所述树突 状细胞的量为104-108个。
9. 权利要求5所述的树突状细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
10. —种尼古丁的用途，其特征在于，用于制备具有肿瘤预防和/或治疗功 能的树突状细胞或具有增强的诱导免疫应答能力的树突状细胞。
全文摘要
本发明提供了一种制备树突状细胞方法，所述方法包括(1)在摩尔浓度为1×10^-9～1×10^-3摩尔/升的尼古丁或其盐存在的条件下，培养未成熟的树突状细胞；(2)收集处理后的树突状细胞。本发明的方法还可包括步骤在步骤(1)和(2)之间，使步骤(1)中所得的尼古丁处理后的细胞与肿瘤抗原接触。本发明还提供了用该方法制备的树突状细胞、及其组合物、试剂盒和用途。本发明的树突状细胞具有增强的诱导免疫应答能力的树突状细胞，可用于预防和治疗各种肿瘤。
文档编号C12N5/06GK101289653SQ200710039508
公开日2008年10月22日 申请日期2007年4月16日 优先权日2007年4月16日
发明者万大方, 顾健人, 高丰光 申请人:上海市肿瘤研究所