专利名称：一种真菌制备草酸脱羧酶的方法
技术领域：
本发明属生物酶制备技术领域，特别是涉及一种真菌制备草酸脱羧酶的方法。
背景技术：
草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase，EC 4.1.1.2)是一种含锰的酶，该酶能催化草酸分解产生甲酸和二氧化碳(见式1)。该酶有广泛的潜在应用，譬如在制浆和造纸工业中去除草酸盐沉淀，在临床医学上能用于分析生物样品的草酸成分以诊断高草酸尿症和尿结石/肾结石病等，在食品工业中用于分析、控制以及降低食品(如菠菜、巧克力等)中的草酸以生产低草酸健康食品；啤酒工业中可以用于控制和降解富含草酸盐的啤酒石；氧化铝冶炼工业中也可以用来处理生产过程中产生的草酸盐废弃物。这些应用都需要大量价廉物美的草酸降解酶。根据文献检索情况，国外对草酸脱羧酶的研究始于1955年。目前，在这方面研究较多的有英国、美国、瑞典、印度等一些国家。然而到目前为止，有关草酸脱羧酶的文献报道在国内还没有被发现，因此，国内在这方面的研究尚处于空白。
式1草酸的酶脱羧反应草酸脱羧酶主要存在于木材腐朽真菌中，尤其是白腐菌，有关这方面的研究已有大量报道。在褐腐菌Postia placenta以及软腐菌Aspergillus niger和Aspergillus phoenicis中也曾有过报道。在其它真菌中，迄今为止报道相对较少。后来又有人在豚鼠(天竺鼠)的肝脏中发现该酶，其它动物的肝脏中则未见报道。最近，有研究发现枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在低pH值环境下可以诱导合成草酸脱羧酶，但尚未发现低pH值也能诱导真菌合成该酶。表1给出了已报道的能产草酸脱羧酶的主要菌种。
表1产草酸脱羧酶的主要菌种
这些酶蛋白的表观分子量有很大的差异，一般在55kDa～264kDa范围内；皆为单体酶，酶分子中一般都含有两个锰原子；适宜的反应温度较低，一般在室温左右；对底物具有很好的专一性，涉及的底物主要为草酸。但是，不同来源的酶在反应最适pH值和辅助因子方面有一定差异。来源于白腐菌的酶，最适pH值在2.5～3.0范围内；来源于褐腐菌的酶，最适pH值在2.0～2.2之间；来源于软腐菌的酶，最适pH值在1.1左右；但它们催化底物的反应都不需要其它辅助因素，仅对氧有少量需求。来源于细菌的酶，最适pH值在6.9左右，催化反应需要ATP、CoA、Mg++、硫胺焦磷酸(ThPP)、醋酸作为辅助条件。由于草酸脱羧酶具有巨大的潜在应用前景，因而该酶的生产研究也越来越受到人们的关注。当前，该酶所面临的最大问题是产率和产量均偏低，导致成本和价格偏高，难以推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，该方法简便易行，成本低，明显提高了草酸脱羧酶的产率和产量，草酸脱羧酶可广泛应用于医药、食品、饮料、造纸、农业、分析等方面。
本发明的具体工艺路线如下以葡萄糖为碳源，蛋白胨、硫酸铵和尿素等为氮源，添加一定量的无机盐组成液体培养基，以彩绒革盖菌(Trametes versicolor)或黑曲霉(Aspergillus niger)等真菌为产酶菌，在通气式生物反应器中培养制备草酸脱羧酶。产酶过程中要严格控制反应条件。具体要求为在液体培养基中，葡萄糖的初始浓度为7～60g/L，初始pH值为4.5～5.5，控制培养温度25～28℃，通空气量为20～30L/L·h，使菌体细胞快速繁殖，菌体浓度迅速提高。在菌体生长快要进入对数生长期时开始添加无机酸或有机酸，添加的量控制在使培养基pH值下降到3.0以下。培养过程中定期取样测酶活，至酶活最大时终止反应。在培养基中添加20mmol/L草酸的产酶反应历程见附图1。
本发明的一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，包括下列步骤(1)配制酸溶液浓度1mol/L～5mol/L的有机酸或无机酸溶液经过120～121℃高温湿热灭菌10～30min，或过滤除菌；(2)制备草酸脱羧酶彩绒革盖菌(Trametes versicolor)或黑曲霉(Aspergillus niger)、或Aspergillusphoenicis、Aspergillus oryzae、Agaricus bisporus、Collybia velutipes(现名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrotheciumverrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postiaplacenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametes ochracea的液体培养基初始pH值约为4.5～5.5，反应温度20～28℃，通空气量为20～30L/L·h，在菌体生长的第三或第四天，快要进入对数生长期时开始添加上述的酸溶液作为诱导剂，使培养基pH值0～3。如果添加草酸盐或草酸，则添加量是使培养基中草酸根离子浓度达到3～40mmol/L。在培养过程中定期取样测酶活，至酶活最大时终止反应；用离心机于转速9000～12000rpm条件下离心20～30min收集菌体细胞，或通过过滤得到新鲜的菌体细胞，用0.05～0.2mol/L，pH值为3～3.7的醋酸缓冲溶液淋洗后再次收集，将得到的新鲜菌丝体用液氮迅速冷冻，研磨菌丝体成粉末状，加入0.05～0.2mol/LpH值为3～3.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，继续研磨成糊状，离心机在12000rpm，离心20～30min，得到草酸脱羧酶液。
所述的彩绒革盖菌(又名云芝、杂色云芝、彩绒菌、瓦菌，Trametes versicolor，Coriolus versicolor)PRL 572、黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 46890、Aspergillusoryzae CCUG 33812、Aspergillus phoenicis、Agaricus bisporus、Collybia velutipes(现名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrothecium verrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postia placenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametes ochracea等菌种均是可以买到的市售真菌。
步骤1中所述的诱导剂为盐酸、硫酸、磷酸、草酸(或草酸盐)、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、反丁烯二酸等。
步骤1中所述的最好的有机酸诱导剂是草酸，10～30mmol/L的浓度诱导效果最好。
步骤1中所述的有机酸溶液为草酸溶液时，配制离子浓度为0.5mol/L。
步骤2中所述的酸溶液为草酸或草酸盐时，添加量使得培养基中最终草酸离子浓度为3～40mmol/L。
本发明首次提出采用在真菌培养阶段通过添加无机酸或有机酸来促进酶的合成，探索最适宜的培养方式以及最佳生理培养条件优化，提高草酸脱羧酶的产量和产率。本发明的目的是针对真菌，诸如彩绒革盖菌(又名云芝、杂色云芝、彩绒菌、瓦菌，Trametesversicolor，Coriolus versicolor)、黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillusphoenicis、Aspergillus oryzae、Agaricus bisporus、Collybia velutipes(现名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrotheciumverrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postia placenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametes ochracea在制备草酸脱羧酶的低产率和低产量上的问题，寻求一种能大幅度促进真菌合成草酸脱羧酶的方法。
本发明在真菌生长期间通过在培养基中添加有机酸或无机酸诱导剂(例如盐酸、硫酸、磷酸、草酸、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、反丁烯二酸等)，降低培养液pH值至低pH范围(＜3.5)，并控制其离子强度来提高酶活力，缩短产酶时间及提高酶产量，利用该方法制备得到的草酸脱羧酶活力是未加酸普通方法的8倍以上。
图1为采用本发明提供的方法，以葡萄糖为碳源，以彩绒革盖菌(Trametesversicolor)PRL 572为产酶菌，在通气式生化反应器中间歇式培养制备草酸脱羧酶的过程中，培养液pH值、总酶活力(U)、比酶活(U/mg蛋白质)随培养时间(d)变化的典型规律。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例11.酸溶液的配制液体酸可以用移液管移取相应的量配成浓溶液，固体酸则称取一定量的粉末，用去离子水配成相应的浓溶液，浓度一般在1mol/L至2mol/L左右，草酸溶液配制离子浓度为0.5M。配好的酸溶液经过121℃高温湿热灭菌20min或过滤除菌后待用。
2.酸的添加量及添加时机在菌体生长的第三或第四天，即生长快要进入对数生长期阶段时，开始添加诱导剂。草酸或草酸盐的添加量是使得培养基中最终草酸离子浓度为3～40mmol/L。其它酸的添加量是使培养基的pH值下降到3.0以下。
3.彩绒革盖菌(Trametes versicolor)PRL 572产草酸脱羧酶以彩绒革盖菌(Trametes versicolor)PRL 572为产酶菌，在通气式生化反应器中以间歇式、分批添料或连续培养制备草酸脱羧酶。液体培养基中碳源和营养盐浓度(g/L)如下葡萄糖 20蛋白胨 3.0KH2PO41.0Na2HPO4·12H2O0.2MgSO4·7H2O0.5FeSO4·7H2O0.01MnSO4·H2O 0.001ZnSO4·7H2O0.001CuSO4·5H2O0.002CaCl2·2H2O0.013液体培养基初始pH值约为5.2。反应控制培养温度25℃，通空气量为20～30L/L·h，使菌体细胞快速繁殖，菌体浓度迅速提高。在菌体生长快要进入对数生长期时开始添加无机酸或有机酸，添加的量控制在使培养基pH值下降到3.0以下。培养过程中定期取样测酶活，至酶活最大时终止反应。
用离心机于转速9000rpm条件下离心20min将菌体细胞收集，或通过过滤得到新鲜的菌体细胞，获得的菌丝体用0.2mol/L，pH值为3.7的醋酸缓冲溶液淋洗之后再次收集。将得到的新鲜菌丝体利用液氮迅速冷冻，研磨菌丝体，使其成粉末状。在菌丝体被研磨破碎完全之后加入0.2mol/L pH值为3.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，继续研磨片刻，使其成为糊状，然后利用离心机在12000rpm条件下离心30min。最后，保存离心得到的上清液，即为该草酸脱羧酶液。表2显示了未加酸时以及添加各种酸后的产酶结果。
表2未加酸时以及添加各种酸后的产酶结果
实施例21.酸溶液的配制液体酸可以用移液管移取相应的量配成浓溶液，固体酸则称取一定量的粉末，用去离子水配成相应的浓溶液，浓度一般在1mol/L至2mol/L左右，草酸溶液配制离子浓度为0.5M。配好的酸溶液经过121℃高温湿热灭菌20min或过滤除菌后待用。
2.酸的添加量及添加时机在菌体生长的第三或第四天，即生长快要进入对数生长期阶段时，开始添加诱导剂。草酸的添加量是使得培养基中最终草酸离子浓度为5～40mmol/L。其它酸的添加量是使培养基的pH值下降到3.0以下。
3.黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 46890产草酸脱羧酶以黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 46890为产酶菌，在通气式生化反应器中以间歇式、分批添料或连续培养制备草酸脱羧酶。液体培养基中碳源和营养盐浓度(g/L)如下葡萄糖 10～20蛋白胨 1～10柠檬酸三纳·2H2O2.5磷酸二氢钾(无水) 5硝酸氨(无水) 2柠檬酸 0.5005MgSO4·7H2O 0.20.01％Biotin 0.05CaCl2·2H2O0.1ZnSO4·7H2O0.005Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.001CuSO4·5H2O0.00025MnSO4·H2O 0.00005
H3BO3(无水) 0.00005Na2MoO4·2H2O 0.00005Tween 80 0.15pH5.0～5.5液体培养基初始pH值约为5.0～5.5。反应控制培养温度25℃，通空气量为20～30L/L·h，使菌体细胞快速繁殖，菌体浓度迅速提高。在菌体生长快要进入对数生长期时开始添加无机酸或有机酸，添加的量控制在使培养基pH值下降到2.0以下。培养过程中定期取样测酶活，至酶活最大时终止反应。
用离心机于转速9000rpm条件下离心20min将菌体细胞收集，或通过过滤得到新鲜的菌体细胞，获得的菌丝体用0.2mol/L，pH值为3.7的醋酸缓冲溶液淋洗之后再次收集。将得到的新鲜菌丝体利用液氮迅速冷冻，研磨菌丝体，使其成粉末状。在菌丝体被研磨破碎完全之后加入0.2mol/L pH值为3.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，继续研磨片刻，使其成为糊状，然后利用离心机在12000rpm条件下离心30min。最后，保存离心得到的上清液，即为该草酸脱羧酶液。
权利要求
1.一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，包括下列步骤(1)配制酸溶液浓度1mol/L～5mol/L的有机酸或无机酸溶液经过120～121℃高温湿热灭菌10～30min，或过滤除菌；(2)制备草酸脱羧酶彩绒革盖菌或黑曲霉液体培养基初始pH值约为4.5～5.5，反应温度20～28℃，通空气量为20～30L/L·h，在菌体生长的第三或第四天，快要进入对数生长期时开始添加上述的酸溶液作为诱导剂，使培养基pH值0～3，在培养过程中定期取样测酶活，至酶活最大时终止反应；用离心机于转速9000～12000rpm条件下离心20～30min收集菌体细胞，或通过过滤得到新鲜的菌体细胞，用0.05～0.2mol/L，pH值为3～3.7的醋酸缓冲溶液淋洗后再次收集，将得到的新鲜菌丝体用液氮迅速冷冻，研磨菌丝体成粉末状，加入0.05～0.2mol/LpH值为3～3.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，继续研磨成糊状，离心机在12000rpm，离心20～30min，得到草酸脱羧酶液。
2.根据权利要求1所述的一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述的彩绒革盖菌又名云芝、杂色云芝、彩绒菌、瓦菌，Trametes versicolor，Coriolus versicolor。
3.根据权利要求1所述的一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述的真菌是黑曲霉(Aspergillus niger)、或Aspergillus oryzae、Aspergillus phoenicis、Agaricusbisporus、Collybia velutipes (现名Flammulina velutipes)、Dichomitus squalens、Heterobasidion annosum、Myrothecium verrucaria、Phanerochaete chrysosporium、Phanerochaete sanguinea、Postia placenta、Sclerotinia sclerotiorum、Trametesochracea。
4.根据权利要求1所述的一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，其特征在于步骤1中所述的诱导剂为盐酸、硫酸、磷酸、草酸/草酸盐、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸或反丁烯二酸。
5.根据权利要求1所述的一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，其特征在于步骤1中所述的有机酸溶液为草酸溶液时，配制离子浓度为0.5mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，其特征在于步骤2中所述的酸溶液为草酸或草酸盐时，添加量使培养基中草酸根离子浓度为3～40mmol/L。
全文摘要
本发明涉及一种真菌制备草酸脱羧酶的方法，包括(1)有机酸或无机酸溶液经过121℃高温湿热灭菌；(2)彩绒革盖菌(Trametes versicolor)或黑曲霉(Aspergillus niger)等真菌的液体培养基初始pH值约为5.0～5.5，反应温度20～25℃，通空气量为20～30L/L·h，在菌体生长的第三或第四天，快要进入对数生长期时开始添加上述的酸溶液，pH值0～3，用离心收集菌体细胞或过滤得到菌体细胞，用0.05～0.2M pH值为3～3.7的醋酸缓冲溶液淋洗后再次收集，冷冻，研磨菌丝，加入0.05～0.2M pH值为3～3.7的醋酸－醋酸钠缓冲液，继续研磨成糊状，离心得到草酸脱羧酶液。本发明简便易行，成本低，草酸脱羧酶活力是未加酸的8倍以上。草酸脱羧酶可广泛应用于医药、食品、饮料、造纸、农业、分析等方面。
文档编号C12N9/88GK101063119SQ20071004031
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者洪枫, 朱翠侠 申请人:东华大学