专利名称：全封闭式无菌细胞培养方法
技术领域：
本发明属于细胞培养领域，特别涉及大规模，不添加抗生素的细胞培 养方法。
技术背景人体细胞治疗技术是一门连结基础研究和商业应用的综合性桥梁学 科。尤其是在人们对干细胞的认识不断加深的情况下，通过干细胞的分离 和体外培养，定向诱导分化成胰岛细胞、神经元细胞、心肌细胞等，将这 些细胞移植在发病部位，修复病人的组织或器官，从而使患者免受病魔的 煎熬。由于移植的细胞与患者的决定簇基因完全相同，不会产生通常器官 移植中的免疫排斥反应，修复的组织或器官将良好的履行职责，无需使用 免疫抑制剂。生物体细胞治疗技术是建立在细胞生物学、分子生物学、有 机化学、遗传学等学科基础之上，使上述情况成为现实和可能，给我们人 类带来一场新的医学革命，将利用生物组织工程学的方法衍生出一项完全 崭新的再生医疗产业。细胞生物治疗做为一种新型的治疗手段，可以在癌症、自身免疫疾病 等疾病中起到治疗作用，而且比传统化疗手段更为有效。生物治疗中的重 要环节是细胞培养，而细胞培养技术中面临的主要问题是污染，为了防止 污染，目前最常用的是在培养基中添加抗生素，但是随着社会的发展，由 于抗生素使用产生耐药性的影响已经越来越受到关注。事实上，在抗生素投入使用至今的仅仅60年间，很多细菌就对抗生素产生了严重的耐药，有 的甚至产生了多重耐药。耐药菌的出现是人类不合理使用抗生素的直接后果，并且细菌产生耐药性的速度远远快于人类新药开发的速度，如不遏止， 人类将进入"后抗生素时代"，也即回到抗生素发现之前的人们面对细菌 性感染束手无策的黑暗时代。而且中国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，WHO在国际范围内的多中心调査显示，住院患者抗菌药物使用 约30%，而我国住院患者中使用抗生素的占80% 90%，其中使用广谱抗生 素或联合使用两种以上抗生素的占58%，就连门诊感冒患者都有75%应用抗 生素，大大超过了已经很不正常的国际平均水平。目前，细胞培养为了防 止污染多采用抗生素，这就导致细胞耐药性的产生，而抗生素的滥用在我 国已经非常严重。为了使注入体内的细胞更为安全可靠，我们迫切需要建立高级净化层 流无菌生产车间及生产工艺，在每一个环节上都严格要求，确保没有细菌 污染，以彻底解决细胞体外培养使用抗生素的历史。这一瓶颈问题的解决， 将确保我国人体细胞能大规模地进入体外培养阶段，从而推动生物治疗尤 其是肿瘤生物治疗产业化的进程，造福于广大患者。因此本领域迫切需要开发出高级净化层流无菌生产工艺，在该工艺中 不添加抗生素，以此培养出的细胞更为安全可靠。 发明内容发明人致力于在人体细胞体外工业化培养中去除抗生素，同时保证人 体细胞在培养过程中不被污染，人体细胞培养质量不受影响。本发明的目的就是提供一种全封闭式无菌细胞培养方法。本发明提供了一种全封闭式无菌细胞培养方法，即对进入细胞培养区 域的人员、物体、空气分别进行无菌化处理，本发明所述的细胞培养区域 为全封闭式。本发明方法可以用于培养各种细胞，包括人体细胞，如淋巴 细胞。在一实施例中，本发明细胞培养方法还包括独立的细胞预处理步骤， 使进入细胞培养区域的细胞无污染。即在大规模细胞培养之前，先检测细 胞是否被污染，检测为阴性的细胞才送入细胞培养区域进行扩增培养。较佳的，上述人员无菌化处理步骤为操作人员进入细胞培养区域之 前依次进行体检、沐浴、泡手灭菌，然后穿戴无菌工作服。较佳的，上述物体无菌化处理步骤为对物体进行消毒或灭菌。本领域 技术人员可以根据物体的不同性能，选择合适的方式进行消毒或灭菌。如 对能承受高温湿热消毒灭菌的物体进行高温湿热消毒；对于不能承受高温 湿热灭菌的物体，采用化学灭菌或辐照灭菌。较佳的，上述空气无菌化处理步骤为空气新风补充量控制在30%±5%; 对于新风口防尘无纺布、中效空气过滤器和高效空气过滤器定期更换。较佳的，上述中效空气过滤器每半年更换一次。较佳的，上述高效空气过滤器每年更换一次。较佳的，上述新风口防尘无纺布每两周更换一次。更佳的，上述空气无菌化还包括细胞培养结束后，开启负离子发生器，运行30—90分钟。在实施例中，负离子发生器的运行时间设定为45分钟。在实施例中，为了降低层流净化区域的负离子浓度，避免造成对人员的伤害，在操作人员进入细胞培养区域之前，补充新风30分钟。本领域技 术人员可以根据实际需要补充新风20 — 50分钟。更佳的，上述空气无菌化还包括对细胞培养区域进行沉降菌检测。 该项检测每天进行一次，从而保证细胞培养区域的无菌状态。当然，也可 以根据需要，每天检测二次。较佳的，C02培养箱连续使用超过30天后，进行24小时的清洗、换水、 消毒。在实施例中，上述细胞预处理区域的空气压强相对于周边环境处于负 压状态。优选的，上述细胞预处理区域具有独立的人流退出通道，物流退 出通道和空气外排系统。较佳的，在本发明上述细胞预处理步骤中，对于检测结果为阳性的细 胞进行原位消毒灭菌。检测结果为阳性或细胞有污染是指细胞悬液混浊， 细胞碎片增多，检测出外源因子，或细胞样品的细菌培养为阳性。
图1、细胞预处理步骤示意图。检测为阳性是指细胞悬液混浊，细胞碎片增多，检测出外源因子，细 胞样品的细菌培养为阳性。
具体实施方式
发明人经过长期细致的研究和大量试验，发明了高级净化层流无菌生 产工艺，即全封闭式无菌细胞培养方法。该生产工艺的优点在于通过各种 手段和标准流程保证细胞培养区域无菌，因此在细胞培养过程中不需添加 抗生素，使培养的细胞更加安全可靠。具体涉及以下优点1、 通过预处理工艺，阻断原料(细胞)中外源因子进入细胞培养区域。2、 通过质控手段，将外源因子阻隔在细胞培养生产区之外。3、 通过功能区域的划分，采用区域气流单送外排的方法，将细胞培养 区域内的空气进行灭活外排。4、 通过原位消毒灭菌法，将污染源控制在零距离内，进行灭活消毒处理。5、 进行动态分时段、分周期检测灭菌效果，了解细胞培养区域内全部 空间和设备内外的染菌情况，寻找及消灭遗漏点。细胞培养区域内凡与流 动空气接触的任何物体的表面(含设备内腔体表面)均应清洗消毒，并进 行动态分时段，分周期检测灭菌效果。本发明中人流是指人流通道工作人员必须按指定要求进行淋浴，泡手和无菌服的更换处理，按指定路径，沿着一个方向进入无菌工作区域； 工作完毕后，按指定路径从另一条人流通道退出无菌工作区域。此路径每 天经负离子发生器45分钟灭菌处理，为无菌环境。物流是指物流通道经灭菌处理过的无菌物品必须按指定的无菌要求， 从专用的无菌通道(此为物流专用通道，与人流分开)向各无菌工作区域 分流，物品使用完毕后，从专用的物流退出通道退出。此路径每天经负离 子发生器45分钟灭菌处理，为无菌环境。操作人员包括细胞培养的操作人员、质控人员等所有需要进入细胞培 养区域的工作人员和其他人员。原位消毒灭菌法是指被污染的细胞或物品一经发现，就应将被污染的细胞或物品迅速放入早己备好的相应的灭菌设备内进行灭活处理，不得 移至其它工作区域或者室外再处理。细胞培养区域是指培养细胞的工作区域，通常是无污染的。细胞培养生产区包括细胞预处理室，细胞培养区域，人流通道，物流 通道，消毒灭菌室，细胞质检室，试剂配制室，物料暂存室等区域。本发明培养的细胞可以来自自体、也可以是异体的淋巴细胞。淋巴细 胞采集方法通过无菌操作规程抽取定量的静脉外周血或胎儿脐带血液， 立即放入含有定量肝素抗凝剂的无菌瓶中，按照常规方法分离，获得所需 要的淋巴细胞，然后按照本发明方法进行大规模的细胞培养。大规模细胞培养中无添加抗生素工艺研究，采用最先进的全封闭式无 菌操作模式进行细胞培养。在不添加抗生素的情况下，以实现细胞培养过 程的无菌化。全封闭式无菌操作包括1. 人员无菌界面式进入细胞培养区域。所谓人流无菌操作界面是指暴露在细胞培养区域空间的工作人员的人 体表面必须处于无菌化状态。2. 物体无菌化进入细胞培养区域的任何物体都必须经过无菌化处理。3. 空气无菌化细胞培养区域的空气必须经过空气初效过滤器，中效过滤器，高效过 滤器以及负离子发生器处理，保证空气气流始终处于无菌状态。4. 细胞预处理系统尽管人体细胞在提供培养前，供体无任何异常或症状，但不能排除该 细胞是否带菌或携带病毒。因此建立细胞预处理系统，将经检测确认为带 菌式携带病毒者的细胞留在预处理系统内，进行高温湿热或化学灭活处理。 同时，细胞预处理系统在人流，物流，气流都与细胞培养区不发生交叉。 建立独立的人流，物流退出通道和空气外排系统，只保证带菌式或携带病 毒的细胞无法进入细胞培养区域。检测结果为阳性是指细胞悬液混浊，细胞碎片增多，检测出外源因子，及细胞样品的细菌培养为阳性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员 所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发明中。实施例l人员无菌界面操作步骤及参考1. 工作人员进入细胞培养室之前(1) 体检口腔扁桃体无红肿化脓；手及手臂皮肤完好无破损； 全身无化脓感染创口，无呼吸道感染症状。严禁佩戴首饰和使用化妆品。(2) 淋浴采用常水(医药行业的专业术语，指自来水)冲淋全身， 使用清洁剂进行皮肤清洗，冲淋时间不得少于7分钟。2. 工作人员进入细胞培养室准备阶段(1) 泡手灭菌进入第一更衣室，将手及手臂至肘部浸入1%)新洁而 灭溶液(也可以使用75%酒精)，不得短于5分钟，浸泡完毕用无菌毛巾擦 干。(2) 进入第二更衣室，穿戴无菌工作服，穿戴过程中手不能触摸自体 任何体表部位。佩戴无菌口罩时，手不能接触鼻，口腔，面颊等部位。3. 工作人员进入细胞培养室，手不能触碰与细胞培养材料无关的任何物体。4. 工作人员从人流退出通道退出细胞培养室后，如再次进入细胞培养区域必须从上述第二条的要求重新做一遍。5. 工作人员在细胞培养区域，不准在万级层流净化室区域和十万级 层流净化区域之间来回走动。工作人员一旦进入十万级层流净化区域后， 如需再进入万级层流净化区域，则必须按上述第二条要求重新泡手，更衣 后进入。实施例2物体无菌操作步骤及参数1. 物理灭菌。能承受高温湿热(12rC/30分钟)消毒灭菌的物体。 如玻璃器皿、无菌工作服、金属器械、细胞洗液、生理盐水等。(1) 上述物体在消毒之前必须清洗干净，玻璃器件瓶壁内必须做到无 水珠挂壁现象；(2) 无菌工作服每用一次，必须用专用洗衣机清洗，清洗后按无菌操 作更衣办法的要求进行折叠；(3) 所有经高温湿热灭菌的物品都必须加外包裹处理，以避免搬运过 程中暴露在空气中。2. 化学灭菌。不能承受高温湿热灭菌的物体，均采用化学灭菌或辐 照灭菌，主要用于塑料制品。(1) 将塑料制品浸泡于1%。新洁而灭溶液，浸泡时必须将有腔体的容 器内空气全部派出，浸泡时间不得少于30分钟。本领域技术人员也可以将 塑料制品浸泡于75%的酒精内，其余操作同上。(2) 微波辐照灭菌3分钟。 实施例3空气无菌化操作步骤及参考1. 空气新风补充量控制在30%±5%;2. 新风口防尘无纺布每两周更换一次；3. 中效空气过滤器每半年更换一次；4. 高效空气过滤器每年更换一次；5. 每天下班时，人员全部退出层流净化生产区域后，开启负离子发生器，运行时间设定为45分钟；6. 每天上班前，开启空调机组，补充新风30分钟，以降低层流净 化区域的负离子浓度，避免造成对人员的伤害。7. 每天新风补充完毕后，质控人员进入层流净化区域，在每张净化 工作台面放置l一2只(根据净化工作台面积大小不同)培养皿，打开盖板， 空气中暴露30分钟。合盖后送入培养箱培养，设阳性对照，进行沉降菌检沉降菌检测标准为0。沉降菌检测结果存在24小时滞后性，如果发现阳性菌出现，则根 据培养皿编号及净化工作台放置位置，复査前一天在此工作台进行换液 的细胞悬液，并取样送检，细胞悬液推迟一天出厂，等待检测结果合格 后放行。实施例4细胞预处理操作步骤及参数1. 淋巴细胞(购自上海市血液中心)，在进入细胞预处理区域后，用以下方法进行处理(1) 细胞容器外壁采用75%酒精棉球进行擦洗两遍。(2) 每瓶细胞悬液所直接接触的耗材，如移液尖，吸管，离心管等均 设为一次性使用，用完后随即放入1%。新洁而灭溶液中。(3) 为每位患者准备治疗用的细胞放入C02培养箱时必须分层分格集 中存放。(4) 每瓶(107l0ml)细胞悬液中取出5Xl()e(0.5ml)细胞送菌检培养。2. 外源性阳性因子细胞悬液处理程序及参数(1) 发现外源因子细胞悬液时，首先仔细核对细胞培养瓶编号，以免 发生错误。(2) 细胞悬液倒入不锈钢容器内，放入手提式高压灭菌锅，121°C/30分钟灭活。(3)塑料细胞培养瓶放入1%。新洁而灭溶液中浸泡。 3. 预处理系统内人员，物体，空气等特殊要求及操作规程。(1) 人员进入预处理系统的工作人员严禁从原人流通道退出，必须 从专用人流退出通道退出。严禁进入其它区域。(2) 物体进入预处理系统的物品，必须从专用退出通道退出。a. 与外源性阳性因子接触过的物品，经灭活后，方能移出预处理区域。b. 预处理系统内人员工作服应与其它工作岗位的工作服有显著的颜 色或花纹区别。c. 预处理系统的工作服必须由专用的洗衣机进行第一程序的清洗，并添加复合有机络合氯一片，洗涤时间大于30分钟。(3) 预处理系统空气全部外排，空气压强相对于周边环境处于负压状态。实施例5细胞换液操作标准1. 当细胞培养瓶口处于开放状态时，手，移液尖，吸管均不要触碰 瓶口。2. 任何物体进出细胞培养瓶瓶口时，均应将细胞培养瓶瓶口在酒精 灯火焰上方2. 5cm-3cm处往复移动灼烧，时间控制在0. 7-1. 5秒之间。3. 操作过程中，因操作不当，某无菌物体脱落后，应弃之不用，待 细胞换液工作全部结束后，进入卫生清洁阶段时再拣拾。C02培养箱连续使用超过30天后，进行24小时的清洗、换水、消毒，消 毒温度9(TC，消毒时间23.5小时。
权利要求
1.一种全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于，对进入细胞培养区域的人员、物体、空气分别进行无菌化处理，所述的细胞培养区域为全封闭式。
2. 根据权利要求1所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于， 所述细胞培养方法还包括独立的细胞预处理步骤，使进入细胞培养区域的细 胞无污染。
3. 根据权利要求1所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于，所述的人员无菌化处理步骤为操作人员进入细胞培养区域之前依次进行体 检、沐浴、泡手灭菌，然后穿戴无菌工作服。
4. 根据权利要求1所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于，所述的物体无菌化处理步骤为对物体进行消毒或灭菌。
5. 根据权利要求1所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于， 所述的空气无菌化处理步骤为空气新风补充量控制在30%±5%;对于新风口 防尘无纺布、中效空气过滤器和高效空气过滤器定期更换。
6. 根据权利要求5所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于，所述的中效空气过滤器每半年更换一次。
7. 根据权利要求5所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于，所述的高效空气过滤器每年更换一次。
8. 根据权利要求5所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于，所述的新风口防尘无纺布每两周更换一次。
9. 根据权利要求5所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于， 所述的空气无菌化还包括细胞培养结束后，开启负离子发生器，运行30— 90分钟。
10. 根据权利要求5或9所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征 在于，所述的空气无菌化还包括对细胞培养区域进行沉降菌检测。
11. 根据权利要求2所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征在于， 所述的细胞预处理区域的空气压强相对于周边环境处于负压状态。
12. 根据权利要求2或11所述的全封闭式无菌细胞培养方法，其特征 在于，在所述的细胞预处理步骤中，对于有污染的细胞进行原位消毒灭菌。
全文摘要
本发明提供了一种全封闭式无菌细胞培养方法，即对进入细胞培养区域的人员、物体、空气分别进行无菌化处理，所述的细胞培养区域为全封闭式。所述的人员无菌化步骤为操作人员进入细胞培养区域之前依次进行体检、沐浴、泡手灭菌，然后穿戴无菌工作服；所述的物体无菌化步骤为对物体进行高温湿热消毒、化学灭菌或辐照灭菌；所述的空气无菌化步骤为空气新风补充量控制在30％±5％；对于新风口防尘无纺布、中效空气过滤器和高效空气过滤器定期更换。本发明优点在于通过各种手段和标准流程保证细胞培养区域无菌，不需添加抗生素，使培养的细胞更加安全可靠。
文档编号C12N1/20GK101323839SQ20071004187
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月12日 优先权日2007年6月12日
发明者张露亿, 朱学东 申请人:上海果喜生物技术发展有限公司