专利名称：一种建立高效花生转基因受体体系的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种建立高效花生转基因受体体系的方法及其受体体系的应用，属于农业生物技术领域或植物基因工程领域。
背景技术：
花生(Arachis hypogaea L.)是我国单产、总产和出口创汇最高的油料作物和重要的经济作物，我国的花生产量占油料作物总产的1/2，占世界花生总产的1/3以上，均居首位。尽管花生生产发展迅速，但长期以来花生生产中存在的病、虫、草害以及干旱等不利因素仍然影响着花生的产量和品质。为了很好的解决这一问题，作物界和生物界学者都做了很多方面的研究。实践证明，基因工程技术可以在较短的时间内实现优异种质或抗性基因在不同物种间的转移，这就为培育花生抗虫、抗病品种提出了新的研究思路和理论及技术基础。
由于花生染色体数目较多和染色体组间差异较大，遗传背景相对比较复杂，造成花生外源基因导入技术难度大。90年代以来，花生再生技术研究得到较大的发展，基本以不同花生器官、组织为外植体，通过体胚和器官发生途径获得再生植株。国内外学者已用多种遗传转化技术获得了花生的转基因植株，但主要工作集中在以花生胚状体、胚小叶、种子子叶、胚轴、胚根等为受体，运用基因枪轰击和农杆菌介导的遗传转化方面，部分技术已基本成熟。
1994年Eapen和George首次报道通过农杆菌转化获得抗卡那霉素和Gus(β-葡糖苷酸酶)活性的转基因花生，在温室中20株转基因花生均能开花，但仅3株能结实，所结种子皱缩、未充分成熟，经分子检测证实外源基因已整合到花生基因组。1997年Cheng M将GUS基因基因成功地转入花生中，但转化效率仅为0.20.3％；同年，同实验室的Li Z等将TSMV-CP(番茄斑萎病毒壳蛋白)基因成功地转入花生中，转化效率提高到1.5％，转基因植株具有一定的病毒抗性；1997年Singsit报道通过基因枪法将Bt基因导入花生，证实了转基因花生具有抗虫性；1999年国内方小平等以花生品种鄂花4号为受体，与AGL1菌株共培养，获得转基因花生株系，在转基因植株的T3代选择得到Gus基因纯合单株；2000年，印度的Rohini等报道，用LBA4404菌株转化花生，获得转基因花生，通过分子杂交证实外源基因已整合进花生基因组，转化效率为3.3％；2001年Deng X等利用基因枪法得到了转基因花生，通过酶联免疫实验证实CryIA(C)在花生植株内表达，CryIA(C)蛋白占整个可溶性蛋白的0.18％，饲养实验也证实花生具有一定的抗虫性。美国和印度等国家已经获得抗病虫的转基因花生材料。尽管花生转基因研究已有大量的报道，但多数试验结果仍存在植株再生率低，体细胞胚畸形，花生基因工程育种效率仍然很低等问题，转基因技术及其受体体系仍待改进。
发明内容
本发明的目的是提供一套建立花生转基因受体体系的方法及其受体体系的应用，可以克服花生基因型的制约，从绝大多数基因型的培养细胞再生出转基因植株，且转化率高，再生植株性状变异小，取材不受季节的限制。
本发明的目的是这样实现的一种建立花生转基因受体体系的方法，包括如下步骤①花生种子灭菌和萌发，②叶片胚性愈伤组织的诱导培养，③胚性愈伤组织的分化培养，④小苗生根培养，⑤瓶苗的炼苗和移栽；在以上相关培养中所采用的培养基包括基本培养基即改良MS培养基、A培养基、B培养基、C培养基。
所说的基本培养基是指NH4NO3(硝酸铵)1650 mg/l，KNO3(硝酸钾)1900 mg/l，KH2PO4(磷酸二氢钾)170mg/l，MgSO4·7H2O(硫酸镁)370mg/l，CaCl2·2H2O(氯化钙)440mg/l，FeSO4·7H2O(硫酸亚铁)27.8 mg/l，Na2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)37.3mg/l，MnSO4·4H2O(硫酸锰)22.3mg/l，ZnSO4·7H2O(硫酸锌)8.6mg/l，H3BO3(硼酸)6.2 mg/l，KI(碘化钾)0.83mg/l，NaMoO4·2H2O(钼酸钠)0.25mg/l，CuSO4·5H2O(硫酸铜)0.025mg/l，CoCl2·6H2O(氯化钴)0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸硫胺素0.4mg/l，盐酸吡哆素0.5mg/l，烟酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，琼脂粉8g/l，PH5.8-6.0；所说的A培养基是指基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg/L，用于诱导幼叶产生胚性愈伤组织；所说的B培养基是指基本培养基附加6-苄氨基嘌呤(6-BA)8mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L和AgNO31mg/L，用于诱导胚性愈伤组织分化出小苗；所说的C培养基是指基本培养基附加萘乙酸(NAA)2.0mg/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L、和活性炭200mg/L，用于无根小苗生根。
所说的种子灭菌和萌发是指选取颗粒饱满、个头较大、表面无裂痕、外壳颜色较黄的黑花生种子，先经自来水和洗涤剂清洗干净外壳表面的尘土和杂物，然后用自来水反复冲洗，清洗干净表面残留的洗涤剂，再用75％酒精浸泡5min，在浸泡过程中不停的摇动，再用无菌蒸馏水清洗2～3次，以清除表面的酒精，剥去外壳，切除大部分子叶后接种在种子萌发培养基MS上，每瓶中接3～5粒，接种完后，材料放在黑暗培养室里培养，培养温度为25±1℃。根据权利要求1或2所述的建立花生转基因受体的方法，其特征在于所说的叶片胚性愈伤组织的诱导培养是指接种在MS培养基上的种子萌发后6～10天后，在无菌条件下切取幼嫩的叶片，大小约为3mm×3mm，接种到A培养基，培养温度为25+1℃，暗室中培养，用以诱导叶片产生愈伤组织。
所说的胚性愈伤组织的分化培养是指接种在A培养基上的叶片诱导产生的胚性愈伤组织继代培养2次后，将胚性愈伤组织转移至B培养基，置于光照培养室培养，光照强度1000～20001x，培养温度25+1℃，用以胚性愈伤组织的分化，产生丛生芽或丛生芽组织块根据权利要求1或2所述的建立花生转基因受体的方法，其特征在于所说的小苗生根培养是指接种在B培养基上的胚性愈伤组织分化出丛生芽或丛生芽组织块，待丛生芽长至3～5厘米幼苗时，将幼苗转接至C培养基，置于光照培养室培养，光照强度1000～0001x，培养温度25+1℃，用以幼苗的生根培养。
所说的瓶苗的炼苗和移栽是指接种在C培养基上的生根苗长出粗壮的根，待苗长高至8～10厘米时，将培养瓶上的封口膜去掉，开盖炼苗1～3d，加自来水少量以保持足够的湿度。后小植株取出，用流水洗净附着的培养基，移栽于装有经过高压灭菌的混合土壤(红壤∶沙土＝1∶1)的花盆中，在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～20℃，相对湿度为80％，有规律的用自来水浇灌植株，培养2周左右，移植苗产生发达的根系，然后定植至田间。
以上所限定的花生转基因受体体系均可选用农杆菌介导法进行遗传转化，并通过加压筛选获得转基因胚性愈伤组织及分化出抗性转基因幼苗，进而获得转基因植株。
花生转基因受体体系的应用，在进行转基因时，受体以选用继代后培养10～14天的胚性愈伤组织块为最佳。
在进行转基因时，受体以选用继代后培养8～12天的丛生芽组织块为最佳。
本发明提供的建立高效花生转基因受体体系的方法及其应用，可以克服花生基因型的制约，从绝大多数基因型的培养细胞再生出转基因植株，且转化率高，再生植株性状变异小，取材不受季节的限制。
具体实施例方式
本发明利用建立的花生转基因受体体系进行转基因的应用(以农杆菌介导法进行遗传转化)将带有双元植物表达载体pBI121(含有卡那霉素抗性基因和GUS基因)的根癌农杆菌菌株LBA4404(或EHA105)在附加卡那霉素的YEP培养基上(蛋白胨5g，酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，蔗糖5g，2mmol/LMgSO4)，28℃，200rpm下振荡培养至对数期。然后在250rpm下离心5分钟，弃上清液。菌体用改良1/2MS液体培养基(即改良MS培养基基本成分减半)洗涤，再离心收集。将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)(浓度为100umol/L)的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-10倍用于转化。
1、以胚性愈伤组织为受体1)在A培养基上继代培养12天左右的胚性愈伤组织块，放入含有100umol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮的菌液中浸染3-6分钟。
2)用无菌镊子取出浸染后的胚性愈伤组织，置于无菌滤纸吸干吸附的菌液，放在A培养基上于暗室中继续培养5天，培养温度为25+1℃。
3)将胚性愈伤组织转入到加有头孢霉素(Cefotaxime)300mg/L或羧苄青霉素(Carb)500mg/L的A培养基上于黑暗中培养7-10天，培养温度为25+1℃，抑制农杆菌生长。
4)将抑菌后的胚性愈伤组织块转入加有筛选剂卡那霉素(300mg/L)的A培养基上进行筛选培养，每2周继代一次，选择存活的组织块转移，筛选2代(约30天左右)后，只有部分的胚性愈伤组织块能否存活。
5)将存活的胚性愈伤组织块转移到加有筛选剂卡那霉素(300mg/L)的B培养基上进行分化培养，置于光照培养室培养，光照强度1000～20001x，培养温度25+1℃，分化出丛生芽，继代2次后获得抗性转基因小苗。
6)小苗长至3～5厘米时，将幼苗转接至加有筛选剂卡那霉素(150mg/L)的C培养基中进行幼苗的生根培养。根系发达的植株经过炼苗移栽至花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。约35％左右的个体为转基因植株。
2、以丛生芽组织块为受体1)取在B培养基上继代培养10天左右的丛生芽组织块，切割后放入含有乙酰丁香酮100umol/L的1/2MS液体培养基悬浮的菌液中浸染3-6分钟。
2)用无菌镊子取出浸染后的丛生芽组织块，用无菌滤纸吸干吸附的菌液，放在B培养基上继续培养5天，培养温度为25+1℃，光照强度1000～20001x。
3)将丛生芽组织块转入到加有头孢霉素(Cefotaxime)300mg/L或羧苄青霉素(Carb)500mg/L的B培养基上培养7-10天，培养温度为25+1℃，光照强度1000～20001x，抑制农杆菌生长。
4)将抑菌后的丛生芽组织块转入加有筛选剂卡那霉素(300mg/L)的B培养基上进行筛选培养，光照强度1000～20001x，培养温度25+1℃，每2周继代一次，选择存活的丛生芽转移，筛选2代(约30天左右)后，只有部分的丛生芽组织块能够存活形成抗性转基因小苗。
5)小苗长至3～5厘米时，将幼苗转接至加有筛选剂卡那霉素(150mg/L)的C培养基中进行幼苗的生根培养。根系发达的植株经过炼苗移栽至花盆成活后，取叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。约40％左右的个体为转基因植株。
本发明中，胚性愈伤组织是指表面光滑有光泽，结构比较致密，易于再生芽的愈伤组织块，转入分化培养基可以再生出大量的丛生芽。
本发明中，丛生芽组织块是指大量的丛生芽和胚状体组成的组织块，转入分化培养基可以再生出大量的植株。
本发明可以克服花生基因型的制约，从绝大多数基因型的培养细胞再生出转基因植株，且转化率高，再生植株性状变异小，取材不受季节的限制。
实施实例1农杆菌介导的黑花生遗传转化及转基因植株的获得1、材料黑花生品种黑霸920作为实验用材料；农杆菌EHA105，该菌株含有双元载体系统pBI121，其载体上含有GUS基因和卡那霉素抗性基因，前者可用于基因的瞬时表达检测。后者为筛选标记基因，其表达可赋予转化细胞具有卡那霉素抗性。
2、受体体系的建立1)选取颗粒饱满、个头较大、表面无裂痕、外壳颜色较黄的黑花生种子，先经自来水和洗涤剂清洗干净外壳表面的尘土和杂物，然后用自来水反复冲洗，清洗干净表面残留的洗涤剂，再用75％酒精浸泡5min，在浸泡过程中不停的摇动，再用无菌蒸馏水清洗2～3次，以清除表面的酒精，剥去外壳，切除大部分子叶后接种在种子萌发培养基MS上，每瓶中接3～5粒。接种完后，材料放在黑暗培养室里培养，培养温度为25±1℃。
2)接种在MS培养基上的种子萌发后6～10天后，在无菌条件下切取幼嫩的叶片，大小约为3mm×3mm，接种到A培养基，培养温度为25+1℃，暗室中培养，用以诱导叶片产生愈伤组织。培养7天后，在叶片周围开始出现白色愈伤组织，结构较为疏松，继代一次以后，愈伤组织块逐渐变大，结构较为致密，呈现米黄色。在继代培养中，少数愈伤组织产生不定根，继代时将其去掉。取继代培养后培养12天的胚性愈伤组织块作为转基因的受体。
3、农杆菌转化胚性愈伤组织1)将带有双元植物表达载体pBI121(含有卡那霉素抗性基因和GUS基因)的根癌农杆菌菌株EHA105在附加卡那霉素的YEP培养基上(蛋白胨5g，酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，蔗糖5g，2m mol/L MgSO4)，28℃，200rpm下振荡培养至对数期。然后在250rpm下离心5分钟，弃上清液。菌体用改良1/2MS液体培养基(即改良MS培养基基本成分减办)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)(浓度为100umol/L)的1/2MS液体培养基悬浮，稀释10倍用于转化。
2)将胚性愈伤组织块放入添加100umol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮的菌液浸泡5分钟，浸染后的组织块用无菌滤纸吸干，放在A培养基上于黑暗中培养5天，培养温度为25+1℃。
3)将浸染过的胚性愈伤组织块转入加有头孢霉素300mg/L的A培养基中于黑暗中培养7-10天，培养温度为25+1℃，以抑制农杆菌的生长。
4)将抑菌后的胚性愈伤组织块转入加有筛选剂卡那霉素(300mg/L)的A培养基上进行筛选培养，培养温度为25+1℃，每2周继代一次，选择存活的组织块转移，筛选2代(约30天左右)后，只有部分的胚性愈伤组织块能够存活。
5)将存活的胚性愈伤组织块转移到加有筛选剂卡那霉素(300mg/L)的B培养基上，置于光照培养室中筛选分化培养，产生具有卡那霉素抗性的抗性丛生芽或抗性丛生芽组织块。光照强度1000～20001x，培养温度25+1℃，继代2次后获得抗性转基因小苗。
4、转基因植株的再生和移栽1)当获得的抗性丛生芽或抗性丛生芽组织块在含有150mg/L卡那霉素筛选剂的B培养基上继代培养2次以后，即可获得抗性转基因的小苗。待小苗长至3～5厘米时，将幼苗转接至含有100mg/L卡那霉素筛选剂的C培养基，置于光照培养室培养，光照强度1000～0001x，培养温度25+1℃，用以幼苗的生根培养。培养14天左右，50％左右的苗产生新根，将未生根的基部切伤，转移到新的C培养基上培养，10天后绝大多数产生新根。
2)生根苗长高至8～10厘米时，开盖炼苗1～3d后小植株取出，用流水洗净附着的培养基，移栽于装有经过高压灭菌的混合土壤，红壤∶沙土＝1∶1的花盆中，在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～20℃，相对湿度为80％，有规律的用自来水浇灌植株。培养2周左右，移植苗产生发达的根系，然后定植至田间。
3)转基因植株采用PCR方法检测筛选，点杂交和基因组Southern杂交验证，约35％左右的个体为转基因植株，转基因效率达12.5％(阳性转基因植株数/浸染的胚性组织块数)。
权利要求
1.一种建立高效花生转基因受体体系的方法，其特征在于包括如下步骤①花生种子灭菌和萌发，②叶片胚性愈伤组织的诱导培养，③胚性愈伤组织的分化培养，④小苗生根培养，⑤瓶苗的炼苗和移栽；在以上相关培养中所采用的培养基包括基本培养基即改良MS培养基、A培养基、B培养基、C培养基。
2.根据权利要求1所述的建立高效花生转基因受体的方法，其特征在于所说的基本培养基是指NH4NO3(硝酸铵)1650mg/l，KNO3(硝酸钾)1900mg/l，KH2PO4(磷酸二氢钾)170mg/l，MgSO4·7H2O(硫酸镁)370mg/l，CaCl2·2H2O(氯化钙)440mg/l，FeSO4·7H2O(硫酸亚铁)27.8mg/l，Na2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)37.3mg/l，MnSO4·4H2O(硫酸锰)22.3mg/l，ZnSO4·7H2O(硫酸锌)8.6mg/l，H3BO3(硼酸)6.2mg/l，KI(碘化钾)0.83mg/，NaMoO4·2H2O(钼酸钠)0.25mg/，CuSO4·5H2O(硫酸铜)0.025mg/l，CoCl2·6H2O(氯化钴)0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸硫胺素0.4mg/l，盐酸吡哆素0.5mg/l，烟酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30mg/l，琼脂粉8mg/l，PH5.8-6.0；所说的A培养基是指基本培养基附加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3mg/L，用于诱导幼叶产生胚性愈伤组织；所说的B培养基是指基本培养基附加6-苄氨基嘌呤(6-BA)8mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L和AgNO31mg/L，用于诱导胚性愈伤组织分化出小苗；所说的C培养基是指基本培养基附加萘乙酸(NAA)2.0mg/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L、和活性炭200mg/L，用于无根小苗生根。
3.根据权利要求1或2所述的建立高效花生转基因受体的方法，其特征在于所说的种子灭菌和萌发是指选取颗粒饱满、个头较大、表面无裂痕、外壳颜色较黄的黑花生种子，先经自来水和洗涤剂清洗干净外壳表面的尘土和杂物，然后用自来水反复冲洗，清洗干净表面残留的洗涤剂，再用75％酒精浸泡5min，在浸泡过程中不停的摇动，再用无菌蒸馏水清洗2～3次，以清除表面的酒精，剥去外壳，切除大部分子叶后接种在种子萌发培养基MS上，每瓶中接3～5粒，接种完后，材料放在黑暗培养室里培养，培养温度为25±1℃。
4.根据权利要求1或2所述的建立高效花生转基因受体的方法，其特征在于所说的叶片胚性愈伤组织的诱导培养是指接种在MS培养基上的种子萌发后6～10天后，在无菌条件下切取幼嫩的叶片，大小约为3mm×3mm，接种到A培养基，培养温度为25+1℃，暗室中培养，用以诱导叶片产生愈伤组织。
5.根据权利要求1或2所述的建立高效花生转基因受体的方法，其特征在于所说的胚性愈伤组织的分化培养是指接种在A培养基上的叶片诱导产生的胚性愈伤组织继代培养2次后，将胚性愈伤组织转移至B培养基，置于光照培养室培养，光照强度1000～20001x，培养温度25+1℃，用以胚性愈伤组织的分化，产生丛生芽或丛生芽组织块
6.根据权利要求1或2所述的建立高效花生转基因受体的方法，其特征在于所说的小苗生根培养是指接种在B培养基上的胚性愈伤组织分化出丛生芽或丛生芽组织块，待丛生芽长至3～5厘米幼苗时，将幼苗转接至C培养基，置于光照培养室培养，光照强度1000～000lx，培养温度25+1℃，用以幼苗的生根培养。
7.根据权利要求1或2所述的建立高效花生转基因受体的方法，其特征在于所说的瓶苗的炼苗和移栽是指接种在C培养基上的生根苗长出粗壮的根，待苗长高至8～10厘米时，将培养瓶上的封口膜去掉，开盖炼苗1～3d，加自来水少量以保持足够的湿度。后小植株取出，用流水洗净附着的培养基，移栽于装有经过高压灭菌的混合土壤(红壤∶沙土＝1∶1)的花盆中，在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～20℃，相对湿度为80％，有规律的用自来水浇灌植株，培养2周左右，移植苗产生发达的根系，然后定植至田间。
8.权利要求1～7中任何一项限定的花生转基因受体体系均可选用农杆菌介导法进行遗传转化，并通过加压筛选获得转基因胚性愈伤组织及分化出抗性转基因幼苗，进而获得转基因植株。
9.根据权利要求8所述的花生转基因受体体系的应用，其特征在于在进行转基因时，受体以选用继代后培养10～14天的胚性愈伤组织块为最佳。
10.根据权利要求8所述的花生转基因受体体系的应用，其特征在于在进行转基因时，受体以选用继代后培养8～12天的丛生芽组织块为最佳。
全文摘要
本发明公开了一种建立花生转基因受体体系的方法及应用。以花生幼叶为外植体接种在附加不同激素组合的诱导培养基上，诱导幼叶产生胚性愈伤组织，进而在附加不同激素组合的分化培养上分化培养，产生丛生芽或丛生芽组织块，最后转接到附加不同激素组合的生根培养基上生根培养，获得再生植株。选取继代培养后处于旺盛生长期的胚性愈伤组织块和丛生芽组织块作为受体，采用农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经过恢复、筛选、分化、生根等步骤获得转基因植株。本发明能从绝大多数基因型的受体细胞中再生出转基因植株，且转化频率高，再生植株性状变异小。
文档编号C12N15/82GK101024820SQ20071005149
公开日2007年8月29日 申请日期2007年2月7日 优先权日2007年2月7日
发明者姚伟, 段真珍, 何正权, 余云芳, 陈发菊, 梁宏伟, 梁薇, 乐超银, 王玉兵, 陈凡, 戴建武 申请人:三峡大学