专利名称：一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法
一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法技术领域；本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术，特别是一种高效表达壳聚糖酶 的芽孢杆菌TQK菌株和高活力壳聚糖酶制剂的生产方法。
背景技术：
目前，国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和 酸降解法三大类。利用生物酶降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解 法，这是由于酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易被控制，能对降解 过程进行监控，生产出有效(2-10糖)含量较高的壳寡糖，且降解条件比较温 和，无需加入大量的反应试剂，对环境污染较少。热点论坛第6巻第2期报道 了李风平等(2003)筛选到1株产壳聚糖的腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)菌株， 摇瓶表明，产酶要84小时，酶活力45mu/ml;逢玉娟等(2005)筛选到产酶能 力强的菌株，72小时菌株YJ102发酵液中壳聚糖酶活力达到17.04u/ml;吴健等 筛选到一株半纤维A1号菌株，发酵酶活力达到300u/ml。壳聚糖酶数量众多， 但普遍存在酶活性低，酶解底物浓度低(3—10%)，酶解时间长，能耗高等问题。发明内容本发明的目的是利用TQS6菌株，通过UV (紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍 诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQk菌株，及其发酵 生产高活力壳聚糖酶的生产方法，从而能高效经济地转化生产壳寡糖。使用的微生物本发明涉及的芽孢杆菌TQK，它具有高效表达壳聚糖酶的特 性，该菌株于2007年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址.中国. 武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No:M207129 (以下简称TQK)。 芽孢杆菌TQK菌株的菌学特性a、 形态特征单个细胞0.7 0.8X2 3微米、着色均匀。无荚膜，周生 鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6 0.9X1.0 1.5微米，椭圆到柱状， 位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。b、 生理生化特征菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色、在液体培养基 中生长时，形成皱醭；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在壳聚糖的诱导下产生壳聚糖酶，在壳寡糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及 腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
本发明是这样实现的。从CCTCC (中国典型培养物保藏中心保藏)取得的 TQS6菌株为基础，通过UV (紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，紫 外诱变的条件是紫外灯功率15 30w，照射距离20 50cm，照射时间l 8min。 NTG诱变的条件是NTG浓度1 3mg/ml，在p朋.0的tris缓冲液中，处 理90 120min。将菌种接种在含有0.1 0. 5%的刚果红平板培养基中，30 35 °C，诱导培养24 48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为 1.5 2.5%琼脂，壳聚糖1 3%,胰蛋白胨0.5 2%,酵母浸粉0.5 2%, NaClO. 1 0. 5%,刚果红0.1 0. 5%。选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法 测定酶活。平均酶活力达到518u/ml。选取优良菌株进行稳定传代3代。最后得到高产壳聚糖酶斜面菌株。并将 该菌株命名为TQK，于4'C冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏，保 藏号为CCTCC No:M207129(简称TQK)发酵产酶工艺包括如下步骤(1) 一级液体培养即从斜面到1000ml三角瓶的放大培养，接种量为TQK 斜面菌一环，在30 35。C， 200 300r/min， PH6. 0 7. 0条件下，在液体培养 基中培养12 24小时。培养基配方按质量百分比计壳聚糖0 0.5%，胰蛋白 胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%， NaCl 0 0. 5%.(2) 7L小罐发酵产酶以3—5%的接种量接种，培养条件35—37'C， 300~500r/min,培养基配 方为壳聚糖1.5~~2.5%，无机盐复合成份(Na2HP04'12H20 1 3%， KH2P04 0. l 0.5%, NaCl 0.1 0. 5%，歸l 0.1 0. 5%， KCL 0. 01 0. 05%) ， 4.5—5.0%，酶 母浸粉1.0—1.5%，胰蛋白胨1.0—1.5%，玉米渣1一5%,最佳培养条件35±1 aC， 500r/min，最佳配方为壳糖聚1.5%，无机盐复合成份4.5%，酶母浸粉1.0%, 胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%,通入压縮空气，旺盛时补加纯氧，组成富氧空气， 保证发酵液溶氧浓度为30%—80%;培养18-24小时，最佳培养22小时；DNS 法测定酶液的活力，平均酶活力达到718u/ml。(4) 酶的纯化发酵完成后，用大容量低温高速离心机以6000r/min将发酵液中培养基残 余物及部分菌体除去。用0.1 y m的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残 存的微量的菌体，用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓縮除去部分水和 无机盐类物质，酶的得率》80%。(5) 高活力壳聚糖酶酶液低温下(0 4'C)贮存。 本发明与现有技术相比具有以下突出特点 1、高效产酶菌株目前， 一般菌株发酵产壳聚糖酶的较快周期在72小时(参阅热点论坛第6 巻第2期"酶法制备壳寡糖研究现状" 一文)，本发明采用的菌株则是通过诱 变、诱导、筛选出的高效菌株，发酵仅需18-24小时，产酶效率大大提高。2、 酶的活性大大提高现有壳聚糖的酶活性仅为300u/ml，而本发明提供的酶是高活性的酶，酶活 性可达718u/ml。(酶活性测定用DNS法测定)3、 酶解工艺效率高一般壳聚糖酶发酵水解工艺中，水解底物浓度为3%—10%，需72小时。 而将本发明应用于水解工艺中，底物可达20%，水解时间仅需4一6小时。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。 实施例1高效表达壳聚糖酶的TQK菌株选育.从CCTCC (中国典型培养物保藏中心保藏)取得的TQS6菌株为基础，通过 UV (紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，紫外诱变的条件是紫外灯 功率15 30w，照射距离20 50cm，照射时间1 8min。 NTG诱变的条件是 NTG浓度1 3mg/ml，在pH6. 0的tris缓冲液中，处理90 120min。将菌种接 种在含有0. 3%的刚果红平板培养基中，35'C诱导培养30小时，可见透明水解 圈。培养基配方按质量百分比计为2%琼脂，壳聚糖0.5%，胰蛋白胨1%,酵母 浸粉1%， NaCl 0.5%，刚果红0.3%。选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法 测定酶活。平均酶活力达到518u/ml。选取优良菌株进行稳定传代3代，最后 得到高产壳聚糖酶斜面菌株，于(C冰箱中保存。将该菌株命名为TQK，保藏号 为CCTCC No:M207129。实施例2发酵生产壳聚糖酶1) :将TQK菌株(保藏号为CCTCC No:M207129)用划线接种在含酵母浸粉 1%，胰蛋白胨1%,氯化钠0.5%,壳聚糖0.5%，琼脂2%的平面培养基上，33°C 温度下培养24小时使用。2) —级液体培养用1000ml的三角瓶装200 ml含酵母浸粉1%，胰蛋白 胨1%，氯化钠0. 5%，壳聚糖0. 5%的液体培养基，10磅灭菌20分钟，接种一环， 34。C摇床上震荡(260r/min)培养27小时。3) 用7升发酵罐装5升含酵母浸粉，胰蛋白胨，壳糖聚，无机盐复合成 份，玉米渣组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子200 mL于35 。C下通 气搅拌18-24小时出罐。
4)低温离心分离酶液用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速在4 。C条件下离心15-20分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所诉的酶液， 置0-4-C低温保存备用。酶活的测定，采用DNS法测定酶液的活力1、 DNS法测酶活以1%冰乙酸溶液配置浓度为1%的壳聚糖浓度，49。C水浴 保温反应10min，加入DNS试剂，沸水浴中显色10min，用纯水稀释定容到25ml。 用721分光光度计，在520nm处进行比色。通过测定OD值求出对应的还原糖含 量，再用酶活公式计算求出酶活力。酶活力定义为在49°C、 pH6.0条件下， 每分钟生成1 Pmol相当于壳寡糖的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位.2、 酶活计算公式为公式X=AX lml/VXFX 1/TX 1000/180式中X—酶活力ymol/ml A—壳寡糖生成量mg
权利要求
1、一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtill)TQK，其保藏号为CCTCCNoM207129
2、 按权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CCTCC M207129生产高活力壳聚糖酶 的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 一级液体培养即从斜面到250ml三角瓶的放大培养，接种量为TQK 斜面菌一环，在30 35。C， 200~300r/min， PH6. 0 7. 0条件下，在液体培养 基中培养12 24小时,培养基配方按质量百分比计壳聚糖0.5 1%，胰蛋白 胨0.5 2%，酵母浸粉0.5 2%，(2) 7L小罐发酵产酶以3—5%的接种量接种，培养条件35—37°C， 300—500r/min，培养基配方为壳聚糖1.5—2%，复合成份4.5—5%，酶母浸粉 1.0—1.5%，胰蛋白胨1. 0—1. 5%玉米渣1一5%最佳培养条件35± rC, 420r/min, 最佳配方为壳聚糖1.5%，无机盐复合成份4.5%，酶母浸粉1.0%，胰蛋白胨1%， 玉米渣3%通入压縮空气，旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓 度为30%—80%;培养18-24小时，最佳培养22小时；DNS法测定酶液的活力， 平均酶活力达到718iWml，(3) 酶的纯化发酵完成后，用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速 将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用0.1 u m的微滤膜对酶液进行纯化 处理，进一步除去残存的微量的菌体，用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理， 浓縮除去部分水和无机盐类物质，酶的得率》80%,(4) 高活力壳聚糖酶酶液低温下(0 4'C)贮存。
全文摘要
本发明提出了一种利用枯草芽孢杆菌TQS6，采用UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达壳聚糖酶TQK菌株及其发酵生产高活力壳聚糖酶的生产方法，对该菌株进行斜面培养，一级培养后进行发酵培养，并且在发酵过程中通入富氧空气增加溶氧，保证发酵液溶氧浓度为30％-80％；培养18-24小时，平均酶活力达到718μ/ml。在优化产酶条件下可发酵得到高活力壳聚糖酶。通过本技术生产出的酶具有产酶量高，产酶稳定，酶活力高，使用本发明的高活力壳聚糖酶能高效经济地转化壳聚糖生产壳寡糖。
文档编号C12N1/20GK101148646SQ200710053140
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者霞 万, 芳 黄, 黄代勇 申请人:武汉东方天琪生物工程有限公司