专利名称：：一种表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株、疫苗及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于动物细菌基因工程
技术领域：
，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌丝状粘附素基因OfeiS)的TypeI片段和百日咳杆菌粘附素基因(pm)的R2片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的构建、疫苗制备及应用。菜狡不猪霍乱沙门氏菌cai/柳加脂cw卿,纽)是导敷4月齢仔猪副伤寒的主要病原，感染猪后引起以急性败血症、慢性坏死性肠炎、顽固性下痢等典型症状，常弓應断奶仔猪大批发病，如伴发或继发感染其它疾病或治疗不及时，死亡率较高，造成重大损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生学上也具有重要意义。人们最早用灭活的全菌疫苗来预防沙门氏菌引起的伤寒，由于灭活苗具有容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能,保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制。随后，人们发现弱毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活的或亚单位疫苗更为有效。于是，各种沙门氏菌弱毒苗在世界范围内得到了广泛应用，取得了良好的预防效果。我国在60年代初，房晓文等将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株接种含有醋酸铊的培养基中传数百代后，选出一株免疫原性好的弱毒株，被命名为C500(房晓文等，仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究，畜牧兽医学报，1981(2):29~36)。C500菌株在全国推广使用，使我国仔猪副伤寒得到有效控制(黄昌炳等，仔猪副伤寒弱毒通气培养冻干苗口服免疫研究，中国农业科学，l诉l(6):8994;康凯，仔猪副伤寒活疫苗，中国兽药杂志，2003(37)3749。近30年来，人们开始关注,减毒沙门氏菌作为载体表达各种外源抗原以预防重大人、畜传染病这一研究领域。应用各种基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多价疫苗等已成为该领域的研究热点。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多的优点(1)产生细胞毒性T细胞的杀伤反应(CTL反应)(2)减毒沙门氏菌因侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫(3)通过自然感染途径如口服或鼻内接种，可以激发系统和粘膜免疫反应(4)具有免疫佐剂作用(5)兔疫具有持续性；(6)具有联合免疫作用，可以稳定表达原核和真核基因，本身不致病，而且也作为伤寒疫苗；(7)所表达的耙抗原不需提纯，制备简单可直接用于免疫保护试验，显著降低了疫苗的制作成本；(8)接种简单方便，易于操作等(Curtiss，R等，1996，Strategiesforflieuseofliverecombinantaviralentbactraialvaccinesformucosalimmunization,p.499-511,J"H.Kiyo加andM.F.Kagnoff(ed),Essentialsofmucosalimiminoto欧，AcademicPress,S旭Diego等,2006.RationaldesipiofSalmo加lla-basedvaccinati加strategies.Metiiods38:133-143;SkaKiJ等,l卿.LiveattemiatedSalmo加Ua:a^radigmofmucosalvaccines.Immunol.Rev.171:5-26)。重组沙门氏菌疫苗的发展常常需要使用选择标记，由于以前普遍采用携带抗性基因的表达质粒，抗性基因成为体外转化筛选转化子和质粒在体外遗传的的主要标记。但是，抗生素是临床上治疗细菌感染的主要药物，由此引起的最大恐慌是抗扭基因在环境病原微生物中传播，从而减弱治疗这赚原感染的药物效果。因此，抗生素抗性质粒选择系统不被人们所接受。如今，人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗系统，如将外源抗原稳定整合到沙门氏菌染色体，或用能筛选选择重组菌但不需要抗生素的质粒平衡系统(Balanced-lethalPlasmidStabilisationSystem),其中，应用最多的系统是osrf质粒载体平衡致死系统。沙门氏菌的幼遮因编码天冬氨酸P"半乳糖脱氨酶(aspartateL>semialdehydedehydrogenase),是二氨基庚二酸(diami加pimdicac近DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，助d缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡，由于哺乳动物组织中不含DAP,因此突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内均被降解。将目的基因插入含OK^质粒，转化OKT宿主菌后可形成互补，OK/质粒丢失的做^f沙门氏菌在体内死亡，只有含有OKf质粒的沙门氏菌才能存活，并稳定的在体内体外表达外源抗原。由于用烟4暖粒载体平衡致死系统代替了抗生素抗性标记，因此也更加安全(Nakayama，K等，1诉8.Constructkmof助Asd+exjesski-cloningvector:s^btemaintenanceandhi缺levelexpressionofclonedgenesinaSa/柳加Z/avaccinesteain.Bi(^Teclmolo欧6:693-柳；Kang,H等,2002,ImmuneresponsestoreccnnbinantpneumococcalPspAantigendeliveredbyliveattenuatedSla/wow//fle甜erfcaserovarTyphimuri咖vaccine.Infe汰tom肌,70:1739-1749)。支气管败血波氏杆菌(5owfefc/tofero/KrA纽伊rtca，56)与百日咳波氏杆菌(丑owfete/to/er/uw&，雄)、副百日咳波氏杆菌(5o/vfetefffliKiw^ftm&，5邵)同属波氏菌属，后两者通常只感染人，主要导致人特别是婴幼儿的百日咳和副百日晐。支气管败血波氏杆菌可广泛感染多种哺乳动物，偶尔也感染人，表现为呼吸道的急慢性炎症，统称为波氏菌病(Bordeteltosis)。在猪群中，支气管败血波氏杆菌,感染可引起猪发fel^炎和萎缩性鼻炎。另外，更大的危害在于该病原菌的先期感染易于导致猪继发感染其它多种病原，如多杀性巴氏杆菌(i^fct^toimiteMr,i^)、猪链球菌OSr印tococcitf幼纽，S幼&)、副猪嗜血杆菌(/foemoifeft4s幼&,HP5)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(？orcinereproductiveandrespiratorySyndromevirus,PRRSV)等，从而提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度，造成较大的损失(Brockmeier,S等，EffectsofintranasalinocuMonwith丑onfe威a6ro加射鄉故a,pcs^ine邵roductive旭dre一atoiysyndromevirus,oraco迈binadonofbotho^aniaasonsubseqi^ntinfectionivilhi>a^6i<re//a附u/toci血hipigs.力m./等,1992.Ei^ram^dadherenceofPasteurellamultocidatoporcinetrachealringspreinfectedwithBordetellabro加hisepticaCanJV改Res.56:260~264;Vecht，U等，1992.,VirulenceofS/repfocoeciASsa纽type2strainsinnewbonigermfreepigsdepraidsonphenotype,.J/i:ctliwrww.60:550~556;BrockmeiraS.L.2004.Priorinfectionwi也Bo油紐/fo6wwcMs伊ft'e。increasesnasalcokmizatioiibyHaanophilusparasuisinswine.附Mero6to/.99:75-78;DeJongM.F.1999.Progressiveandnonprogressiveatrophicjhinitis.InStewB.E.,d'AllaireS.，MengelingW.L.andTaylorD.J.(eds.),Diseasesofswine.Ames,IA:IowaStateUniversityPress,p.355—384)。直至鹏在，人们才逐渐意识到支气管败血波氏杆菌对猪群造成的危害远远被低估了(BorckmeierS.Theroleof5owfeteWa6ro加lt纽一cainrespiratorydiseasesofswine:atrophicrhinitisandbeyond.PigProgress(special).2003，6:20"21)。同时，人们也发现该菌可在免疫功能缺陷或低下的入群(如AIDS患者体内)形成严重感染，因此引起了高度关注(Val幼ciaM.E.,EnriquezA.,CaminoN.，etal.BordetellabroncMsqpticapneumoniainpatientswithHIV.EnfermInfeccMicrobiolCliA2004，22:502-503)。支气管败血波氏杆菌与百日咳波氏杆菌、副百R咳波氏杆菌亲缘关系较近，许多毒力因子为3种病原菌所共有，包括粘附素和毒素两大类。粘附素包括丝状血凝素(份amentoushemagghrtiii^FHA)、百曰咳杆菌粘附素(pertactin,PRN》、气管粘附因子(trachealcolonizationfactor,TcfA)、菌毛(fimbriae，FIM)等毒素包括皮肤坏死毒素(dennonecrotictoxin,DNT)、气管细胞毒素(trachealcytotoxin)、腺苷环化酶溶血素(adenylatecyclase-hemolisin,AC-Hly)等。这些毒力因子的表达与病原所处的环境具有紧密的相关性，均由BvgA/S双因子调节系统调节表达。FHA和PRN被认为是最重要的粘附因子和抗原成分，是已经广泛使用的商品化百闩咳疫苗的主要成射Greco,D,Sahnaso，S，Masteantonio,R，Giuliano,M.,Tozzi，A.，Anemo叫A.,CiofidegliAtti,M.L.,Giammanco，A,P咖i,R，Blackwelder，W.C.,Kleii^D.L，Ww鹏ilak,S.G.F"andProgettoPertosseWoikingGroiq>.1996.Acontrolledtrialoftwoacellularvaccinesandonewhole《e11againstpertussis.JVew五"g/.JMed334:341-348;GustafssonuL.，HallandCT，H.O.,Olin，P.，ReizensteiiijE.旭dStonaeter,L1996.Acontrolledtrialofatwocomponentacellular,afive-componentacellular,andawhole-cellvaccineagainstpeitussisvaccine.JSTew￡"g/.Med334:349-355)。FHA是是ft/M基因编码的一种介导细菌粘附到宿主细胞的分泌型大蛋白，在细菌粘附宿主细胞的a^中起到关键作用，可以直接粘附作为宿主受体的纤毛膜甘氨酸鞘脂。同时，FHA介导的粘膜定殖功能对于细菌抵抗粘膜纤毛的自动清除也有很大作用。FHA具有良好的抗原保护性，含有C端的TypeI和N端的TypeII两个保护性抗原区域，而TypeI较Typen包含了更多的抗原表位从而具有更好的抗原保护性(LeiningerE.，BowenS.,Renauld-MongenieG..RouseJ.H.，M節02ziF.D.,LochtC.,HeronI.,BrennanM.J,1997.bnmunodomimntdomainspresen，onllie丑or血fe/fa^per(itirf纽vacckecomponentfilamentoushemagglutinin.JInfectDis.175:1423-1431;PiattiG.1999.Ideni他cationofimmunodominant邻itopesinthefilamentoushemagglutininofJ8or血紐f/ajje/"/wss纽.FEMSImmunolMedMi咖biol.23:235-241;J.B.Knight,Y.Y.HuangjS.A.Halperin，R.Anderaon^A.Morris,A.KfecMill叫T.Jo加s，D.S.B赋G.VanNest,S.F.Lee.2006.bmnunogaiidtyandprotectiveefficacyofarecombinantfilamentoushaem^g^utininfiomBordetellapeitussis.Clinical&Experim節talImmunology144:543-551)。PRN是由pm基因编码的一种具有抗原保护性的支气管败血波氏杆菌外膜蛋白成分，也是其重要的黏附因子。在猪的感Mi验中，猪群的保护率与PRN抗体水平呈线性关系，被认为是支气管败血波氏杆菌最主要的保护性抗原。PRN包括Rl(GGXXP^和Rl(PQPn)两个氨基酸重复序列区域。R1区靠近一个RGD序列，而RGD序列主要具有粘附真核细胞的功能，因此推测R1区可能与粘附功能相关(LeiningerE"EwmiowichC.A"BtorgivaA"PeppierM.S.,ICew拓erJ.'O.,BrennanM.J.1992.ComparativerotesofiieArg-Gty-Aspsequencepresentintheflowte化/fc戸r加f纽adhesinspertactinandfilamentoustona幽utiiiiiLMeet&nmun60:2380~2385)R2区被鉴定为PRN的主要保护性抗原表位(Charies,I.G.,J.Li,M.Robert^K.Beesley,M.R(肪肪os，D.J.Hckaid，M.Francis,D.Campbell,G.Doupn，M.XBminan,C.R.M旭clark,M.AuJensen,I.H咖iijA.Chubb,P.Novotoy,andN.F.Fakweather.l朔.IdentificationmidcharactoizationofapratectiveinnmmodomirantBcellepitopeofpatactin(R69)fromBowletellapertussis.E孤IImm咖l.21:薩-薦)。目前商品化各种支气管败血波氏杆菌疫苗(主要是佐剂灭活苗)已在世界范围内广泛应用，但免疫效果普遍较差，由支气管败血波氏杆菌所弓應的萎縮性鼻炎和肺炎仍然是危害养猪业一个非常重要的问题(Backsfro迈L.I卿.Presentusesofandexperienceswi也swi加vaccines.In:Veterinaiyv鉱cin然anddiagnostics.S旭Diego:AcademicPress;UnitedStatesDepartmentofA扭euitwe.2001.PartI:iefamceofswinehealthandmanag咖entintheUnitedS但tes,2,.CO:NationalAnimalHealthMonitoringSystranFortCollins,#N338.0801:2001:39;UnitedStatesDepaitmentofAgricultiue.2002.PartII:refe腿ceofswinehealthandheal也imnag咖entintheUnitedStates,2000.CO:USDA:APfflS:VS,CEAH，NationalAnimalHeal1hMonitoringSystem,FortCollins,#N355.0202:2002:29)。因此，开发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。与灭活疫苗和单纯的亚单位疫苗不同，重组沙门氏菌活疫苗自然感染或试验感染诱导执任何异源血清型沙门氏菌保护的同时，沙门氏菌因侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主产生针对异源抗原的体液和细胞免疫反应等优点。这样，重组弱毒活疫苗也许是解决当前支气管败血波氏杆菌商品化疫苗不足的一种可行方法。构建沙门氏菌重组菌株的传统方法存在很多缺陷。如以往普遍采用携带抗性基因的表&ll粒，因存在生物安全问题而不被人们所接受。质粒载体平衡致死系统具有表达量高、外源基因表达稳定、不需纯化无抗生素抗性标记等优点，同时鉴于猪霍乱沙门氏菌C500的良好免疫原性，将其开发为表达,支气管败血波氏杆菌抗原保护性基因的重组活疫苗具有广阔的应用前景。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，获得一种免疫原性更好和安全性更强的表达猪源支气管败血波氏杆菌，和基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株；本发明的第二个目的是利用表达猪源支气管败血波氏杆菌jfe诏和pm基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗；本发明的第三个目的是表达,支气管败血波氏杆菌,oS和基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株在制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗中的应用。本发明通过以下技术方案实现-—种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌,和i7f基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株(分类命名SW卿加ffflcAoferae孤&)C501&YA-F1P2),2007年9月6R保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCCNO:M207138。所述的不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌，和pm基因的重组猪霍乱沙门氏菌,失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因做rf基因(需要含a^基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能正常生长、繁殖)，同时该重组菌株含有外源质粒pYA-FlP2(含有a^基因)，该重组菌株保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA-FlP2能在该菌株中表达o^基因与猪源支气管败血波氏杆菌免疫原性基因^的l!ypel区域(本发明命名为Fl)和pw的R2区域(本发明命名为P2)片段。其中，a^基因^ii产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成相关成份。^a5基因Fl片段和,"基因P2片段的表达产物提供良好的针对猪源支气管败血波氏杆菌的免疫原性。本发明的不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌加诏和pm基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株，其基因工程菌株衍生于在中国已经使用了多年的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株；黄昌炳等，仔猪副伤寒弱毒通气培养冻干苗口服免疫研究，中国农业科学，l诉l(6):89~94;康凯，仔猪副伤寒活疫苗，中国兽药杂志，2003(37),37:49)。所述的重组猪霍乱沙门氏菌株，缺失了C5加菌株基因组中的做d基因，同时插入了含有做d基因和猪源支气管败血波氏杆菌j^S基因Fl片段和拜基因P2片段的质粒pYA-FlP2。由于需要pYA-FlP2的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA-FlP2(也就是^基因Fl片段和prn基因P2片段)在重组菌株中的稳定性。基因Fl片段和/wti基因P2片段在重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪源支气管败血波氏杆菌很好的免疫保护力，本发明的基本构建方法是利用基因工程技术使猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(简称C500,下同)必需的细胞壁形成相关基因o^基因缺失从而构建成新菌株，我们将该新菌株命名为C501。同时构建含有osrf基因和猪源支气管败血波氏杆菌，基因Fl片段和pr基因P2片段的质粒pYA-FlP2。将该质粒pYA-FlP2转入C501.ok/基因缺失株中，由于生长的需要质粒pYA-FlP2与C500aKf基因缺失株互补而稳定共存，形成我们发明的不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌，和戸基因片段的重组C501(pYA-FlP2)菌株。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌的二价疫苗。本发明的主要优点是1、本发明制备的基因工程菌株表达的,支气管败血波氏杆菌，基因Fl片段和,《基因P2片段为猪源支气管败血波氏杆菌重要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。由于猪源支气管败血波氏杼菌危害日益严重，而目前市场上各种商品化猪支气管败血波氏杆菌疫苗(主要是佐剂灭活苗)免疫效果普遍较差。因此，用本发明的基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。2、本发明制备的基因工程菌株衍生于在中国已经使用了多年的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500,完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，本发明的基因工程菌株毒力比C500稍弱，因而具有更好的生物安全性。3、本发明制备的基因工程菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌和支气管败血波氏杆菌两种病原的保护。4、本发明制备的基因工程菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。附國说明图l:是本发明制备的转移质粒pREasdl2的物理图谱。图2:是本发明制备的转移质粒pREasdl2的酶切鉴定结果。图中M:DNAmarte(DL15,000)1:pREasdl2/JZwI+A^"I图3:是本发明制备的转移质粒pREasdl2构建的流程图。图4:是本发明中不含抗性标记的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗菌株C500a^基因缺失突变菌株的PCR检测电泳图谱。图4A:awf缺失菌株PGR鉴定图(Pa5aa6),图中MhDNAmarker(DL2,000):M2:DNAmarker(DL15,000);1^6为筛选的owf缺失菌株7-12为亲本菌株C500对照13为pREasdl2质粒对照；14为H20对照o图4B:owf缺失菌株PCR鉴定图(Pa7/Pa6)，图中Ml:DNAmarker(DL2，000);M2:DNAmarker(DL15,000);14为筛选的owf缺失菌株；5为亲本菌株C500对照；6为pREasdl2质粒对照；7为1120对照图5:是本发明制备的重组质粒pYA-FlP2的物理图谱。图6:是本发明制备的重组质粒pYA-FlP2的酶切鉴定结果。團中M:DNAmarker(DL15,000)1:pYA-FlP2/五coJU+賴ofin國7:是本发明制备的重组质粒pYA-FlP2构建的流程图。图8:是本发明中一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌j&诏和pm片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株C501(pYA-FlP2)的PCR鉴定电泳图谱。图8A:是重组菌株okT缺失PCR鉴定图，图中M:DNAmarker(DL15,000):1和2为重组菌株；3为亲本菌株C500对照。图犯是该重组菌中飼基因F1片段的PCR鉴定图，图中M:DNAmarker(DL2,000);1为亲本菌株C500对照2为重组菌株图8C:是该重组菌中irii基因P2片段的PCR鉴定图，图中M:DNAmarker(DL2,000):1为亲本菌株C500对照；2为重组菌株图9:是本发明中一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌，和pm片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株C501(pYA-FlP2)的SDS-PAGE和Westem-Wot分析结果。图9A:是用SDS-PAGE方法检测—基因Fl片段和pm基因P2片段融合蛋白rFlP2，图中l为重组菌株；2为亲本菌株C500对照箭头所示为融合表达蛋白tflP2。图犯是用W坊tem-Wot方法检测，基因Fl片段和,n基因P2片段融合蛋白rFlP2，图中1为重组菌株；2为亲本菌株C500对照图他是本发明中一种不含抗性标记的表达|支气管败血波氏杆菌_/^5和jr"片段的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的遗传稳定性实验结果。图10A:该重组菌中解基因片段的PCR鉴定图，图中M:DNAmarker(DL2,000);1为亲本菌株C500对照；2-7为1-50代重组菌株图10B:该重组菌中戸基因片段的rcR鉴定图，图中M:DNAmarker(DL2,000);1-6为1-S0代重组菌株；7为亲本菌株C500对照具体实施方式以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。实施例1猪霍乱沙门氏菌C邻Oof基因缺失菌株的构建1、引物设计(用于基因克隆和分子检测)参照已报道的鼠伤寒沙门氏菌LT2株a^基因序列(GenBankNo:AE008863)设计2对引物(pal/pa2和pa3/pa4,见表l),从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株)基因组中分别扩增osi/基因上下游片段a^(上臂)和okS(下臂)，扩增片段大小分别为2112bp和20诉bp,上臂两端分别引入Jftal和5amHI酶切位点，下臂两端分别引入5awHI和酶切位点。另设计2对引物(pa5/pa6和pa7/pa6,见表l)进行C500亲本菌株和OK/缺失菌株的鉴定。引物均由上海生物工程公司合成。表l:PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、猪霍乱沙门氏菌C500o^基因上下游片段owO(上臂)与os必(下臂)的克降将冻干的猪霍乱沙门氏菌C500在LB固体平板上划线，37。C培养16h。挑取单菌皿种于LB液体培养基中，37°C、200r/min振摇培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(购自北京TtANGEN公司)说明书提取基因组为PCR模板。os必和osd2扩增反应均在25jiL的体系中进行，反应体系(PCR相关试剂均购自大连宝生物工程有限公司)如下模板DNA1pL,10xPCR缓冲液2.5(iL,25mmol/LMgCl22nL,10pnol/L上、下游引物各1jiL,2mmol/LdNTPslnL,2U/mLTaqase0.5pL,ddH2016|iL。做必和os必扩增条件为:95°C变性5min后进入循环,循环参数为94°C1min,57°CImta,72°C2.5rain.30个循环后，72。C延伸10min。扩增的PCR，经OJ。/n的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为2112bp和2069bp。将得到的目的基因克隆到pMD18-T载体(购自大连宝生物工程有限公司)，送大连宝生物工程有限公司进行外源基因序列的测定。3、pREasdl2转移貭粒的构建用JSaI和肠ffl双酶切os必和pBluescriptSK(+傳体(购自美頃Stratagene公司)，回收纯化后用T4DNAligase(购自大连宝生物工程有限公司)连接，16。C水浴12h，转化鹏。感受态细菌(购自大连宝生物工程有限公司)，37。C在固体LB培养基(lOg胰蛋白胨，5g酵母浸裔，5g氯化钠，15g琼月識，蒸馏水定容至1000mL,121°C髙压25min)培养12h,挑菌到液体LB培养基U0g胰蛋白胨，5g酵母浸裔，5g氯化钠，蒸馏水定容至1000mL,121°C高压25min),37°C、225r/min振摇培养12h,使用质粒提取试剂盒(购自北京HANGEN公司)小量制备质粒从而获得质粒pSKasdl。再用fi《wtHI和J^附I双酶切osd2与质粒pSKasdl。回收后用T4DNAligase连接，转化DH5a感受态细菌，37°C培养12h，挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h,小备质粒从而获得质粒pSKasdl2。用為al和J^附I双酶切转移质粒pSKasdl2与自杀性质粒pRE112(由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtissIII教授惠赠；Miller,V.L，MdcalanosJ.J.l卿.Anovelsuicidevectoranditsuseinconstructiononinsertionmutations:oanoreguMonofoutermembrane拜teinsandvirulencedeterminantsinMbriochoteraerequirestoxR.J.Bacteriol.170:2575-2583)，回收os必+asrf2片段和质粒pREl12,用LDNAligase连接，16。C水浴12h,电转化(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔DW泉分子克隆实验指南(第三版).北京科学出版社,2002)大肠杆菌x7213(由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtissHI教授惠赠;Edwards,ItA.,L.H.Keller,andD.M.Schifferli.1998.Imprwedal，dicexchangevectorsand也eir鹏toanal拜诉7Pfimbriag咖expression.Gene207:149—157)构建重组菌株3^213(pREasd12),37。C培养12h挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h,小量制备质粒从而获得pREasdl2转移质粒，其物理图谱见图1。鉴定结果证实构建的转移质粒pREasdl2是正确的(见图2)，转移质粒pREasdl2构建流程如图3所示。4、fl^基因缺失株C501的构建以(pREasdl2)为供体菌，C500为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，无菌磷酸盐缓冲液(PBS，NaC18.0g，KC10,2g,Na2HP04.12H202.9g,KH2P040.2g，蒸馏水加至1000mL，经12PC高压灭菌30min維两遍，调整菌浓度至ODfiw为0.8,各取100jiL菌悬液混合,将无菌硝酸纤维滤膜贴于含二氨基庚二酸(diaminopimelicadd,DAP,购自美国Sigma公司)的固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37。C培养12h,同时做供体和受体对照,洗下滤膜上菌液，无菌PBS洗两遍,涂布含氯霉素(Cm,终浓度30pg/ml)的面体LB平板，37°C培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5%蔗糖的平板，筛选Cm抗性(Cm^)接合子，提取基因组，用引物pa5/pa6(见表1)扩增鉴定(见图4A)。阳性接合子在无抗性无Naa的LB液体培养基中培养12h,连续10倍稀释，涂布含5%庶糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5%靡糖的固体平板，筛选Cm敏感(CmS)菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，awf缺失株进一步用引物pa6/pa7(表l)鉴定(见图4B),C500的a^基因缺失株由于缺失asd基因而失去合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。结果表明，所构建的owf基因缺失株asd'C500是正确的，我们将其命名为C501。实施例2重组质粒pYA-FlP2的构建1、引物设计参照已报道的支气管败血波氏杆菌^flS(GenBankNo:NC002927)和(GenBankNo:AJ245927)基因序列设计2对引物，分别从猪源支气管败血波氏杆菌(5owfete/to6n^力&e,.va)HH0809(该菌株于2007年9月18日，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:M207148)的基因组中扩增,oS基因的Fl片段和/r"基因的P2片段。扩增片段大小分别为465bp和300bp,pfl和pf2分别引入及o及I和&n酶切位点，ppl和pp2分别引入swr和好办K/in酶切位点。引物序列如下-pfl5，-1TTAAM^EIQCTGACTGCCCTGGACAAT-3，(&感)pf2:5'-TTTAAQIeS^￡TCGCAGATCCGCGGCAAA-3,(&fl)Fl片段465bp卯l:5，-TAATTglSS^QAACACCATGCTGCTGGTG"3，(,pp2:5，-TTTAA￡ie￡^eGGCGGACAACTCCCTGCC-3(Mrfffl)P2片段300bp2、猪源支气管败血波氏杆菌Fl和P2基因片段的克隆将猪源支气管败血波氏杆菌HH0809株在含有15%脱纤绵羊血的鲍-姜氏(购自-夷国Difco公司)平板上培养48h,无菌PBS洗卞，按细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组为PCR模板。F1和P2基因片段扩增反应均在25pL的体系中进行，反应体系如下模板DNA1jiL,10xPCR缓冲液2.5nL,25mmol/LMgCl22f*L'10拜ol/L上、下游弓l物各1^L,2mmol/LdNTPslnL，2U/pLT叫0.5nL，細2016^。Fl和P2基因片段扩增条件为95°C变性5min后进入循环，循环参数为94°C30s,58°C30s，72。C30s。30个循环后，72。C延伸10min。扩增的PCR产物经0,/n的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为465bp和300bp。3、重组质粒pYA-FlP2的构建与鉴定用五co范和SWI双酶切Fl与pMD18-T载体，回收纯化后用T4DNAKgase连接，16。C水浴12h,转化DH5a感受态细菌，37nC培养12h,挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pMD18-Fl。再用&/I和招n^ni双酶切P2与转移质粒pMD18-Fl，回收纯化后用T4DNAligase连接，16eC水浴12h,转化DH5u感受态细菌，37°0培养1211,挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h,小量制备质粒从而获得质粒pMD18-FlP2。用五co及I和招wHI双酶切质粒pMD18-FlP2中的F1P2片段与穿梭质粒pYA3493(由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtissID教授惠赠;Kang,H.Y,J.Srinivasan,andR.Curtiss迈.2002.Immuneiesfpon鄉torecombiimitpneumococcalPspA旭tigendeliveredbyliveattenuatedSofmone//aenfer!-aiserovarTyphimuriumvaccine.Infect.Imnnm.70:1739-1749),回收纯化后用T4DNAligase连接，16nC水浴12h,电转化大肠杆菌3^097(由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtiss迈教授惠赠Nai^yam^K"S.M.Kelly,助dR.CurtissIII.1诉8.ConstructionofanAsd+expression-cloningvector:stablemaintraianceandhi扭levelexpressionofclondlgenesinaSWOTo附aivaccinestrain.Bio/Technology6:693497)感受态细胞，37°C培养12h，挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pYA-FlP2,其物理图谱见图5。鉴定结果证实构建的重组质粒pYA-FlP2是正确的(见图6),重组质粒pYA-FlP2构建流程如图7所示。实施例3表达F1和P2基因片段的重组菌株的构建C500的ow/基因缺失株C501由于缺失o^基因而失去合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长，但是当其获得含有asd基因的重组质粒pYA-FlP2后将获得合成DAP的能力，恢复在不含DAP培养基上生长的能力。将重组穿梭质粒pYA-FlP2电转化C500的ow/基因缺失株C501,在DAP阴性平板上进行筛选阳性克隆，挑取单菌落进行培养，并用引物pa7/pa6、pfl/pf2和ppl/R)2进行PCR鉴定(分别见图8A、图8B和图8C)。结果表明获得含有pYA-FlP2质粒的C501重组菌株是正确的，我们将其命名为C501(pYA-FlP2)。实施例4表达F1和P2基因片段的重组菌株的生物学特性1、Fl和P2基因片段大肠杆菌表达产物兔抗血清的制备用&0及I和招"rf迈双酶切质粒pMD!8-FlP2中的F1P2片段和pET-28a,回收纯化后用T4DNAligase连接，转化大肠杆菌DH5。感受态细菌，37°C在固体LB平板上培养！2h,拼菌小量制备质粒从而获得表JiM粒pET28a-FlP2。将pET28a-FlP2质粒进行序列测定，证实克隆正确后，转化大肠杆菌BL21(购自大连宝生物工程有限公司)，在含有卡那霉素(Kan,终浓度50ng/mL)固体LB平板上挑取阳性转化子到液体LB培养基，37°C、200r/min培养至对数生长期(吸光值0D柳-a6l邻加入IPTG(终浓度lmM)进行诱导表达4h,使用组氨酸融合蛋白提取试剂盒ffiS-BindPurificaticmKit(购自美国Qiagen公司)按该公司提供的操作说明书，对表达产物纯化，获得浓度为320Mi/mL的融合表达蛋白，命名为HIS-F1P2。将100吗表达产物HIS-F1P2与等体积弗氏完全佐剂(购自美国Sigma公司)均匀混合，皮下注射新西效白兔(购自湖北省预防医学科学院实验动物中心)，分别在3周(二免)和5周(三免)后各加强免疫l次(使用弗氏不完全佐剂，购自美国Sigma公司)。在3免后10d采血，提取血清，0.22拜滤膜过滤除菌，置-20。C备用。2、C501(pYA-FlP2)重组菌株的表达特性分析.挑取重组菌株C501(pYA-FlP2)的单菌落在LB液体培养基中，37°C、200r/tnir,培养8，卿r/min离心收集菌体，进行聚丙稀,凝胶电泳(SDS-PAGE,黄培堂等译.萨姆布鲁克J.拉塞尔DW著.分子克隆实验指南(第三版).北京科学出版社，2002i,并使用兔抗HIS-WP2血清进行Western-blotting分析(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔DW著.分子克隆实验指南(第三版).北京科学出版社,2002)。结果表明€50他￥八-12)能表达大小为29.51￡0&的重组蛋白(命名为rFW2),且表达的重组蛋白具有良好的免疫学反应原性(见图9)。3、C501(pYA-FlP2)重组菌株的表型鉴定将C501(pYA-FlP2)重组菌株与亲辅C500划线接种固体LB平板，然后转接葡萄糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、甘鹏、阿拉伯糖、木糖、卫矛醇、尿素等碳源及H2S等生化鉴定管(购自杭州天和公司)进行生化反应。按血清因子(购自中国兽药监察所)说明书并进行0和H抗原鉴定。结果表明重组菌株C501(pYA-FlP2)的生化特性与亲本株C500--致。两者均不能产生H2S,不能利用乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖醇和尿素，但是能够利用麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和木糖为唯一炭源。重组菌株C501(pYA-FlP2)的血清型为6，7:C:1，5:与亲本株C500—致。这些结果表明重组菌株C501(pYA-FlP2)的生化特性与亲本菌株C500—致，符合猪霍乱沙门氏菌的典型表型特征。4、C501(pYA-FlP2)重组菌株的生长特性分析C50i(pYA-FlP2)重组菌株在LB平板37。C培养12h,菌落其直径约为1.7mm,较亲本比C500株(2mm)稍小a亲本株C500与C501(pYA-FlP2)重组菌株从106CFU/ml开始培养，每lh取样，并进行活菌计数。结果显示，C501(pYA-FlP2)重组菌株生长速度稍慢f'亲本株C500,其平均世代间隔(Meangenerationtime)为30.7min,较亲本株(27.9min)延长2.8m柳。5、CS01(pYA-FlP2)重组菌株的遗传稳定性将本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌株在固体LB平板上划线培养，挑取单菌落到液体LB培养基中，37。C、200r/min培养16h,按体积1:1,000的比例转接到LB液体培养基中培养1211,再次按体积1:1，000的比例转接到LB液体培养基中，连续进行10次转接。用引物pfl/pe和ppl/pp2进行PCR扩增，扩增质粒在重组菌中的遗传情况见图10。图10表明，每次扩增的结果均无可见差别，表明本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌株能够稳定遗传。实施例5C邻l(pYA-FlP2)重组菌株疫苗的制备将获得的C501(pYA-FlP2)重组菌株进行鉴定,每代接种于LB培养基上,利用弓l物pya/pf2进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性,经20次传代后发现仍然能扩增出大小分别为645bp片段，其遗传性能稳定。通过Western-blotting检测发现，rFlP2重组蛋白可以在重组菌株中稳定表达，并具有良好的免疫学反应原性。该C501(pYA-FlP2)重组菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到lxl0WCFUtoL。按细菌液-明胶保护剂(体积体积)为7:1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是每100mL去离子水中加蔗糖40g,明胶8g,充分融化后，置12PC下灭菌30mto后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.011/瓶分装，置-5(FC冷冻干燥机中冻干，冻干3640h后压盖，用10%铝胶生理盐溶解并进行活菌计数(CFU),并确定没有杂菌污染，置-20。C保存备用，作为研制蜇组疫苗的疫苗菌株。实施例6C幼l(pYA-FlP2)重组菌株疫苗的安全性评价l、小鼠腹腔感染途径的安全评价为测定构建的重组菌株C501&YA-F1P2)对BALB/c小鼠的安全性，将32只Bab/C小鼠平均分为2个大组，每大组分为4小组。第l大组小鼠进行腹腔途径感染C501(pYA-FlP2),每小组每只分别注射2.1x10sCFU、2.1xl06CFU、2.1xl07CFU和2.1xl08CFU:第2大组进行腹腔接种亲本菌C500,每小组每只分别注射2,lxl0SCFU、2.1xl06CFU、2.1xl07CFU和2.1xl08CFU。记录死亡情况并按照ReedandMuendi法进行计算小鼠半数致死剂量(Lt^)。评价C501(pYA-FlP2)重组菌株与亲本菌株C500相比毒力是否减弱以及对小鼠是否安全。试验结果见表2:显示C501(pYA-FlP2)重组菌株和亲本菌株C500的LDso分别为1.5xl07CFU和3.3x106。表2本发明的双基因炔失疫1豕菌株与亲本株毒力比较试验<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>CFU,计算可知重组菌株的毒力较亲本菌株C500降低了4.5倍。这说明本发明的C501(pYA-FlP2)重组菌株与已被证明安全的弱毒疫苗亲本株C500相比，毒力更低，对猪应该更加安全。2、本发明的重组菌株C501&YA-F1P2)对猪的安全性评价以亲本菌株C500的免疫剂量(3xl(fCFU)为参考数据，分别通过颈部肌肉注射4周龄断奶仔猪和怀孕母猪(结果见表x)。本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌株按每头猪注射2mL(含5xl(fCFU活菌数)接种4周龄的断奶仔猪10头，所有仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，免疫2周后均可以检测到沙门氏菌抗体和rFlP2重组蛋白的特异性抗体。亲本菌株C500接种的仔猪(即对照l),也没有异常临床表现。本发明的C501(pYA-FlP2)重组菌株按每头猪注射4mL(含140'nCFU活菌数)接种妊娠母猪5头，所有妊娠母猪的精神食欲正常，未见异常变化，免疫2周后均可以检测到沙门氏菌抗体和rFlP2重组蛋白的特异性抗体；和未接种的妊娠母猪比较，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等。这两顿验证实本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌株对妊娠母猪也是安全的。实施例7本发明的重组菌株C501(pYA-FlP2难小鼠体内的免疫效力检測1、小鼠的免疫程序-使用5-6周龄的BALB/c小鼠作为免疫效力评价，根据试验要求分为3组，分别为本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌株疫苗组、C500亲本菌株疫苗组和非免疫空A对照組。免疫途径为背部皮下注射0.2mL(含1.2xl08CFU活菌量)细菌液或LB培养基14天后加强免疫l次。分别于免疫前0天、首免后14天和28天检测沙门氏菌血清抗体(标准ELISA方法，参照Covo加,M.G.，M.Brocchi，E.PallaW.Dias，daSilveira^R.Rappuoli，andC.L.Galeotti.998.Levelsof^pessionandimimmogadcityofattenuatedSa〖卿加ZZae"fm'caserav站Typhimuri咖strainsexpressingEs^e"'cWaco&'咖lmth敏-labileeatm)toxin.infectImmun.66:224-231)。同时以实施例4中制备的组氨酸融合表,物fflS-FlP2为抗原(10tog/孔)包被ELISA板，按间接ELISA方法(方法参照柳忠辉等，免疫学常用实验技术，北京科学出版社，2002)检测rFlP2重组蛋白抗体水平。2、免疫小鼠体液免疫抗体水平检测小鼠免疫前采血，第二三次采血分别在首免后14、28天进行，每组选取5只经尾静脉负压采血，分离血清，分别检测抗沙门氏菌血清抗体、rFlP2特异性抗体效价，取平均值。结果见表3。从表3中可以看出，首免后第2周本发明的C501^YA-F1P2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体为1:384和1:448,二免后2周(即首免后4周)，本发明的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组和C5加亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体效价分别升至在1:3584和l::40邻。而同步进行的13对照均为阴性(<1:10)。首免2周本发明的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组rFlP2特异性抗体效价为1:512,二免后2周，本发明的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组rFlP2抗体效价上升到1:3328,而同步进行的对照亲本菌株C500和PBS对照均为阴性(<1:10)。二免后2周(即首免后4周)，本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗免疫组产生的EUSA抗体均有一定程度的上升，且效价接近。本发明制备的C501^YA-FlP2)重组菌疫苗组能产生rFlP2特异性抗体，抗体效价平均水平为1:3328,LB对照组抗体检测仍为阴性(<1:10)。上述结果表明本发明制备的C501(pYA-FlP2)璽组菌疫苗免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌和支气管败血波氏杆菌的体液免疫应答表3本发明制备的重组菌C幼l(pYA-FlF2)疫苗兔疫小鼠血鳙抗体检澜(EUSA法)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3、C501(pYA-FlP2)重组菌疫亩免疫BALB/c小鼠的保护性试验将54周龄沙门氏菌阴性BALB/c小鼠卯只，平均分为三组，即本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组、C50O亲本菌疫苗组对照组、LB对照组。本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组和C500亲本菌疫苗组对照组以0.2mL(活菌含量1.2x108CFU)培养液通过背部皮下注射BALB/c小鼠；LB对照组每只背部皮下注射0.2mLLB培养基。14天后加强免疫1次，二免后第2周(首免后4周)，从各组小鼠随机选取10只，均使用100xLD5a(含有2加106CFU)猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-l(弱毒疫苗菌株C500的亲本菌株，购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心商业菌株)对小鼠口服攻毒，观察30天。LB对照组小鼠攻毒后6h开始呈现精神沉郁、不食、扎堆第2天开始出现死亡，死t高峰出现第5天，到第8天全部死亡。本发明制备的C50地YA-F1P2)重组疫苗组与攻毒后没有出现明显的发病症状，没有死亡情况发生。C500亲本菌疫苗对照组情况与C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组相似。这说明本发明制备的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组能够抵御IO(WLD幼猪霍乱沙门氏菌强度株C78-l的攻击。攻毒后保护率情况见表4所示，表4本发明制备的重组菌C501(pYA-FlP2)疫苗对猪霍乱沙门氏菌C78-1强毒株攻击BAL/c小白鼠的保护性评价<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>二免后16天(首免后30天)，将各组剩余小鼠(每组剩余20只)用于猪源支气管败血波氏杆菌的攻击。将支气管败血波氏杆菌强毒株HH0809在含有15%脱纤绵羊血的鲍-姜氏平板上培养48h后，用含有m水解酪蛋白氨基酸的PBS洗下，调整到合适的攻毒浓度(30nL含有5.2xl06CFU活菌)。每只小鼠通过,注射0.2mL麻醉药品(含有0.25mg甲苯噻嗪和1.25mg氯胺酮)麻醉小鼠，将其仰卧，然后用30fiL含有5.2x10sCFU活菌的溶液注射到小鼠的鼻孔中，让其完全吸收。观察30天。C500亲本菌疫苗对照组和LB空白对照组小鼠攻毒后均表现精神萎靡，不食，8h后开始出现死亡，死亡高峰出现在3-4d，7d后死亡停止。死亡小鼠剖检可见肺有明显的坏死、出血，渗出液增多、变稠肝、肠脏器出血、坏死，表面多附有--层伪膜，易剥离从死亡小鼠心血、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏均能分离到感染菌。本发明的C50地YA-F1P2)重组菌疫苗组20只小鼠全部存活，且在攻毒后没有出现任何发病情况，保护率为100%(20/20)。而C500亲本菌疫苗对照组(20只)和LB空白对照组小鼠(20只)分别存活3只和4只。这说明本发明制备的重组菌C501(pYA-FlP2)疫苗组能够抵御4xLDsn猪源支气管败血波氏杆菌强度株HH0809的攻击。攻毒后保护率情况见表5所示。表5本发明制备的重组疫苗C幼地YA-F1P2)对猪源支气管敗血波氏杆苗野生型强毒株HH冊砂攻击BALB/c小白鼠的保护4生<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例8本发明制备的重组菌疫苗C邻l(pYA-FlP2)在猪体内的免疫效力检测1、猪的免疫程序选择20-25日龄、沙门氏菌和支气管败血波氏杆菌阴性的仔猪24头，试验分3组，第1组为LB对照组，编号1-8,第2组为C500亲本菌疫苗对照组，编号916,第3组为本发明的C501(pYA-FlP2)重组菌疫苗组，编号1724。LB对照组每头猪注射lmLLB培养基，C500亲本菌疫苗对照组和本发明的重组菌疫苗C5(H(pYA-FlP2)组每只猪颈部肌肉注射lmL培养物(活菌含量4xl09CFU),免疫2次，间隔2周。在一免后2周和二免后2周各采血一次，分别用ELISA方法检测沙门氏菌血清抗体(标准EUSA方法,参照Covo加，M.G.，M.BroccM，E.PalKW:Dias，da,Silveira，R.Ra卯uoli，andC.LGaleotti.l卿.Levelsofexpressionandimmunogenicityofattenuated&/鹏娜&ew敝fcaserovarTyphimuriumstrainsexpressing勘c/te"'c射aco/imutantheat-labileenterotoxiii.Meet.Immun.66:224-231)和rFlP2重组蛋白抗体水平(方法同实施例7)。试验分组、免疫途径和免疫剂量详细情况见表6。2、免疫仔猪ELISA抗体水平检测分别在第一次免疫后2周和第二次免疫后2周前腔静脉采血，分离血清，采用间接ELISA雄分别检测沙门氏菌血清抗体、rFlP2特异性抗体效价，取平均值。结果见表6:首免后第2周本发明的重组菌疫苗C501(pYA-FlP^)组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体均为|:320,:免后2周(即首免后4周)，本发明的)重组菌疫苗C501(pYA-FlP2组和C500亲本菌疫苗组沙门氏菌抗体效价分别升至在1:2816和1:3072。而同步进行的LB对照均为阴性(<1:5)。首免2周本发明的重组菌疫苗C501(pYA-FlP2)组rFlP2特异性抗体效价为1:288,::免后2周，rFlP2抗体效价上升到1:1920,而同步进行的C500亲本菌株对照组和LB对照组均为阴性W:5)。上述结果表明本发明制备的C50地YA-F1P2)重组菌疫苗免疫仔猪后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌和rFlP2特异性抗体的体液免疫应答。表6本发明制备的重组菌疫苗C幼地Y緒P2)免疫仔猪血清抗体检鑭(ELKA法)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3。本发明制备的重组菌疫苗C501&YA-F1P2)免疫仔猪的保护性试验二免后第16天，(首免后30天)，从第1、2和3组中每组选取4头，每头猪耳静脉注射lmLC78-l强毒株菌液(含有约5xLD幼，约2xl(fCFU活菌)进行攻毒，观察30天。LB对照组仔猪攻毒后表现为体温升髙至41-42°C,精神不振，伏卧，食欲减退或废绝，呼吸困难，步行摇晃，呕吐与腹湾。四肢末端及腹部发绀。攻毒后3天开始死亡，7天内全部死亡。本发明的重组菌疫苗C501(pYA-FlP2)组和C500亲本菌疫苗组仔猪攻毒后无明显发病症状,全部存活。这说明C501(pYA-FlP2)重组疫苗保留了C500亲本菌疫苗的抵抗猪霍乱沙门氏菌感染的能力,能够抵御5xLDsc猪霍乱沙门氏菌强度株C78-l的攻击。攻毒后保护率情况见表8所示。表8本发明制各的重组疫苗C邻物YA-MP2)对猪霍乱沙门氏菌C78"l野生型强毒株攻击仔猪的保护性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二免后第16天，(首免后30天)，将各组剩余仔猪(每组剩余4头)用于猪源支气管败血波氏杆菌的攻击。将支气管败血波氏杆菌强毒株HH0抑9在含有15%脱纤绵羊血的鲍-姜氏平板上培养48h后，用含有m水解酪蛋白氨基酸的PBS洗下，调整到合适的攻毒浓度(2xl0"CFU/mL活菌)。每头仔猪通，部气管注射2mL含有4xlO"CFU活菌的溶液注射到呼吸道中，让其完全吸收。攻毒后连续观察一周，亲本菌C500疫苗对照组和LB空白对照组仔猪攻毒后均表现体温升高，咳嗽，呼吸困难，不食，流舆涕，发病率为100%。本发明的重組歸C501(pYA-FlP2)疫苗组4头仔猪在攻毒后没有出现任何明显发病情况发病率为0。攻毒后7夭所有仔猪解剖观察病理变化。攻毒后保护情况见表9表9本发明制备的重组疫苗C幼l(pYA-FlP2)对支气管敗血波氏杆苗野生型强毒株HH0809攻击仔猪的保护结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a,b肺炎和气管炎的病变程度一，无+,轻微++,中等程度+++,严重c呼吸频率每15秒的呼吸次数d呼吸困难0,正常l,轻微2,中等程度3,严重e嗜睡程度:O,正常1,轻微；2,中等程度3,严重f食欲情况(36h内)0,吃食1,不吃食g细菌分离+,从肺部能分离；一，不能分离本发明实施例的试验结果都明确显示，本发明的一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌，和基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株C501(pYA-FlP2)疫苗能激发机体产生高效价的猪霍乱沙门氏菌抗体，以及产生高效价的针对猪支气管败血波氏杆菌FHA和PRN免疫性抗原的特异性抗体，对小鼠和猪毒性很低，安全性好，在免疫保护力试验中，对猪霍乱沙门氏菌和自支气管败血波氏杆菌都具有很高的攻毒保护率，权利要求1、一种表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株(Salmonellacholeraesuis)C501(pYA-F1P2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNOM207138。2、权利要求l所述的菌株，其特征在于1)该菌株缺失了猪霍乱沙门氏菌生长必需的fl^基因,并含有能在该菌株中表达的做rf基因;2)插入了猪源支气管败血波氏杆菌;fe诏和pm基因的重组质粒pYA-FlP2。3、一种重组质粒pYA-FlP2，其含有能在猪霍乱沙门氏菌株中表达的o^基因与猪源支气管败血波氏杆菌，和基因片段。4、一种如权利要求1或2所述的重组猪霍乱沙门氏菌的制备方法，其特征在于，包括下列步骤(1)从猪霍乱沙门氏菌C500株中构建缺失做rf基因的突变株，将该菌株命名为C501:(2)构建重组质粒pYA-FlP2:(3)将歩骤(1)的突变株C501和步骤(2)的质粒构建表达猪源支气管败血波氏杆菌丝状血凝素,fl丑和百日晐杆菌粘附素pm基因片段的重组得到如保藏号CCTCCNO:M207138所述的猪霍乱沙门氏菌C501(pYA-FlP2)。5、包含权利要求1或2重组猪霍乱沙门氏菌制备的猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌疫苗。6、包含权利要求3所述的重组质粒pYA-FlP2制备的猪霍乱沙门氏菌和猪源支气脊败血波氏杆菌疫苗。7、权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌疫苗中的应用。全文摘要本发明属于动物细菌基因工程领域，涉及一种不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株的构建、疫苗制备及应用。得到一株不含抗性标记的表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌C501(pYA-F1P2(保臧号为CCTCCNOM207138)。该菌株缺失了猪霍乱沙门氏菌的asd基因，含有能在该菌株中表达asd、猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的质粒pYA-F1P2。公开了该重组株及疫苗的制备以及在制备猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌疫苗中的应用。本发明的基因工程疫苗可以刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌野毒株的保护性免疫反应，能有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪源支气管败血波氏杆菌的感染。文档编号C12N1/21GK101157907SQ20071005338公开日2008年4月9日申请日期2007年9月27日优先权日2007年9月27日发明者华何,何启盖,顺卢,斌吴,锐周,徐引弟,汤细彪,胡睿铭,云薛,赵战勤,郭爱珍,金梅林,陈焕春申请人:华中农业大学