专利名称：对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽胞杆菌BSn5及抑菌蛋白APn5的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物应用技术领域。具体地说，涉及一株对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽 胞杆菌的分离及其抑菌活性蛋白的纯化与鉴定，与微生物农药技术领域有关。
背景技术：
枯草芽胞杆菌(及w7/幼M^/to)是一种革兰氏阳性杆状细菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动，是一种 在自然界中广泛存在的非致病菌，也是常见的植物内生菌，可以定殖在植物的各个器官。枯草芽胞杆菌能 够产生多种具有抗菌生物活性的代谢产物。这些抗菌物质主要分为两大类， 一类是低分子量抗菌肽，包括 环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽，另有少量为蛋白类抑菌物质，这一类占枯草芽胞杆菌抑菌物质的绝 大部分；另一类主要包括聚酮类、氨基糖类以及脂肽类等的抗生素。迄今为止国内外多个实验室通过分离 其发酵产物，得到了一些低分子量的抗菌物质，并进行了深入研究(TorstenStein，Bflci7Zwss"&做s antibiotics: structures, syntheses and specific ftmctions， Mo/ Mcro&i'o/， 2005, 56 (4)845 - 857)。枯草芽胞杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质 抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防目的。其主要防治对象大部分为 丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病(Stogo"cw/7oracwrfe7)、番茄叶霉病(Cto^w/w!'鹏/w/v鹏)、 大豆根腐病(Fusar/ww grawn'股rarww)、苹果霄心病(^ter""n'a afer""fa)、棉花立枯病(/ /r&o"o/7/"5o/(3"'')、 棉花枯萎病(尸ttsw/鹏o^/w鹏sp.v咖'"/e加m)等(程洪斌等，枯草芽胞杆菌防治植物真菌病害研究进 展，上海农业学报，2006， 22 (1): 109-112)。对于细菌性病原菌具有抑制作用的枯草芽胞杆菌菌株的报 道还比较少。与其它内生细菌相比，枯草芽胞杆菌能够产生耐热、耐干旱的芽胞，具有极强的抗逆能力， 作为生防菌剂具有良好的应用前景。目前商品化的内生枯草芽胞杆菌制剂还处于研发阶段，已获得推广应 用的菌剂多为根际枯草芽胞杆菌。例如获得美国环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可的枯草 芽胞杆菌生防菌株GB03、 MBI600、 QST713,解淀粉枯草芽胞杆菌变种(var. a/wy/o "e/。"'e"s) FZB24,我国有枯草芽胞杆菌菌剂"菜丰宁"。魔芋(Amorphophallus)是单子叶植物纲(Monocotyledoeae)、天南星科(Areaceae)、魔芋属(Blume) 的多年生草本块茎植物，其块茎内含丰富的葡甘聚糖(Konjacglucomannan)，是唯一能大量提供葡甘聚糖 的经济作物。葡甘聚糖属于可溶性半纤维素，在人体中不被吸收、不含热量，有饱腹感且能减少和延缓葡 萄糖的吸收，可预防肥胖和缓慢减肥，也可作为糖尿病的辅助药物，具有医疗和保健功能。葡甘聚糖又是 一种植物胶，与其它天然胶如黄原胶等相比，其粘度更高，且与其它胶如黄原胶等复配后可使黄原胶的粘 度大大增高。葡甘聚糖还具有增稠、乳化、胶凝、粘结、保水等性能，在冷食品、肉制品及粮食加工食品 等方面作为添加剂已获得广泛使用(李静等，魔芋的应用价值与开发前景'西昌学院学报'2006， 20 (4): 17-19)。近年来，由于魔芋加工业的迅速发展，带动了魔芋种植产业，使栽培面积逐年扩大。魔芋软腐病在魔芋产区普遍发生，是魔芋的主要病害，其病原菌属于胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐 亚种，能够侵染多种植物。 一般魔芋种植的第1年生长良好，病害很少；种植的第2年有少量病害发生 种植的第3年大量病害发生，有时大面积受害，雨季更容易发病，发病率可达80%以上，严重时引起成片 倒苗，造成全田无收。软腐病菌从魔芋的根部和植株表面伤口侵入，具有潜伏期长、传播快、难控制的特 点，目前尚无有效的防治方法。由该病原菌引起的软腐病害是造成作物严重经济损失的重要病害之一，在 世界范围内广泛发生，限制了魔芋种植业发展，是魔芋产业发展的重大难题(周锬等，魔芋病害今年持续 发生流行原因分析及对策，中国植保导刊，2004， 8: 45-48)。发明内容本发明的目的在于分离得到一株对魔芋软腐病具有抑菌活性的枯草芽胞杆菌，并从中提取出具有抑菌 活性的蛋白。本发明是这样实现的申请人分离筛选得到一株对胡萝卜欧文氏软腐病菌具有抑菌活性的枯草芽胞杆菌(fecL 7〃s 幼力"7A)菌株，将其命名为BSn5,该菌株于2007年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 其保藏号为CCTCC NO: M207124。该菌株具有下列明显特征.-(1) 对胡萝卜欧文氏软腐病菌具有抑菌活性；(2) 能够产生大小为31.6kDa的分泌型蛋白，该蛋白被命名为APn5;(3) 蛋白APn5对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性。 本发明的BSn5菌株的菌学特征如下菌体大小为(0.6~1.0) umx (1.5~2.0) um，细胞呈杆状，芽孢中生，革兰氏染色呈阳性反应，能运 动。在LB琼脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落圆形、边缘波状、表面隆起、湿润、色暗、起皱折。 最适生长温度为28'C, pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。还原石蕊牛奶，水解酪素、淀粉，接 触酶阳性，在7。/o的NaCl浓度中生长。该菌株按照常规甘油管保藏方法保藏。更详细的技术方案参见实施例部分的描述。
图l:是本发明的枯草芽胞杆菌16srRNA基因系统发生树，图示各节点处为不同的枯草芽胞杆菌菌株 的16SrRNA基因序列；图2:是本发明枯草芽胞杆菌BSn5对软腐菌SCGl的抑病活性检测结果；图中培养基为马铃薯切片，1、为不接种细菌；2、为接种BSn5和SCGl; 3、为接种SCG1; 图3:是本发明应用不同硫酸铵饱和度的BSn5蛋白提取液的SDS-PAGE检测结果；图中1、为标准分子量蛋白；2、为30%硫酸铵饱和度蛋白提取液；3、为50°/。硫酸铵饱和度蛋白提 取液；4、为80%硫酸铵饱和度蛋白提取液。 图4:是本发明的标准蛋白相对迁移率曲线；图5:是不同含量的抗菌蛋白形成的抑菌圈图中1、 13fig抗菌蛋白形成的抑菌圈；2、 6.5吗抗菌蛋白形成的抑菌圈； 3、 33.2ng抗菌蛋白形成的抑菌圏；4、 26吗抗菌蛋白形成的抑菌圈。 蛋白提取液的SDS-PAGE凝胶电泳图。图中1: marker : 2:未处理的样品；3:胰蛋白酶处理的样品；4:蛋白酶K处理的样品；5:蛋白 酶K;6: 50。C处理的样品；7: 80'C处理的样品；8: 120'C处理的样品。具体实施方案实施例l一、枯草芽胞杆菌BSn5菌株的分离、鉴定与抑菌活性检测1、 魔芋软腐病内生拮抗细菌的分离与筛选将花魔芋(Amorphophalluskonjac)块茎在自来水下冲洗15min,洗净表面污物。之后将块茎表面灭菌， 方法如下0.15% (m/v)升汞溶液浸泡30min，然后用70% (v/v)酒精浸泡2min，最后用灭菌水漂洗3 次，去除表面残余化学试剂。将表面灭菌后的块茎置于灭菌水中削去表皮，然后切成约为0.5cn^的小块， 灭菌吸水纸吸干表面水分，接种于花魔芋愈伤组织诱导培养基(MS基本培养基+3Q/。蔗糖+0.7"/。琼脂+NAA (萘乙酸)0.5 mg/L+6-BA (6-节氨基嘌呤)0.5 mg/L,补充水分至1L， pH6 , 121'C灭菌30 min)，置 26'C培养室暗培养。在培养过程中，经常出现被细菌感染的愈伤组织。本发明以上述花魔芋被细菌感染的愈伤组织为材料，用胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp carotovora) SCG1菌株(Dong Y H, et al. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of ￡rwz'"/a carotovora.尸rac 7Vaf/爿cac/ 5W, 2000, 97(7): 3526-3531)为指示菌，进行拮抗细菌的分离与筛选。具体方法是用0.5 ml牛肉膏蛋白胨液体培养基(配方牛肉膏0.5%，蛋白胨1%， NaC10.5%, 补充水分至1L， pH7.2， 12rC灭菌30min)冲洗被细菌感染的愈伤组织，将获得的洗液保存备用。取0.05 ml洗液按照IO倍梯度稀释至10—5， 0.20ml稀释液涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基(配方牛肉膏0.5%, 蛋白胨1%， NaC10.5%，琼脂粉1.5%,补充水分至1L ， pH 7.2， 121'C灭菌30 min)平板，28。C培养 过夜，根据菌落数，选择稀释倍数为10J的稀释液进行下一步实验。在以上实验基础上，利用如下方法筛选具有抑菌活性的细菌将约109cfu/ml (colony forming unit, cfu) 的软腐病菌SCG1菌悬液0.201111加入无菌培养皿中，倒入已冷却至40'C左右的牛肉膏蛋白胨固体培养基 (配方同上)，充分摇匀，制成SCG1混菌平板。取0.20ml稀释倍数为1()J的稀释液涂布SCG1混菌平板。 28"C培养2天，平板上约1/10菌落形成了抑菌圈。这些具有抑菌活性的细菌菌落形态相似，都表现为菌落 突起，表面有褶皱，形成的抑菌圈直径都约为5mm。将能形成抑菌圈的菌落分别点种于牛肉膏蛋白胨固体 培养基、马铃薯葡萄糖固体培养基(配制方法马铃薯去皮，切片，称20g并加蒸馏水100ml,煮沸30min， 纱布过滤，补足蒸馏水至100ml，制成马铃薯汁，再加入葡萄糖2g,琼脂粉1.5g， pH 7.2-7.4 ， 115'C灭 菌20min)和LB固体培养基(配方蛋白胨1%,酵母粉0.5%, NaCl 1%,琼脂粉1.5%,补充水分至1L， pH7.0-7.2, 12rC灭菌30min)， 28。C培养过夜，均能够生长。2、 魔芋内生细菌的菌种鉴定(1) 魔芋内生细菌的显微镜观察随机挑取25个可以产生抑菌圈的单菌落，用蕃红染色液(配置方法2.5。/。蕃红的乙醇溶液10m1,加 蒸馏水稀释至100ml，过滤)简单染色后置普通光学显微镜下观察，均为产芽胞的杆状细菌。(2) 内生细菌总DNA的抽提
从显微观察的菌落中，随机挑取一个单菌落，用接种环通过无菌操作接种于S mL的LB液体培养基 中(配方同上述LB固体培养基，不加琼脂粉)，置于28'C、 200rpm的摇床中培养过夜；然后通过无菌操 作将50 pL的培养物转移至5 niL的LB液体培养基中，同样条件培养3-4小时；然后以12000 rpm, 0.5 min 离心收集菌体，用lmLSTE [配方0.1 mol/LNaCl, 10 mmol/LTris-HCi (pH 8.0), ! mmol/L EDTA (pH8.0)〕 洗涤一次，加100jiL溶液I [配方:1 mol/LTris-HCl(pH8.0)， 0.5 mol/LEDTA(pH8), 50mmol/L葡萄糖] 和10jiL溶菌酶(浓度50mg/mL)，在37。C作用30 min以上；加入200pL2。/。的十二烷基磺酸钠(SDS) 于55'C水浴30 mhi;加入200 5 mol/LNaCl混和，再加入500 苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比25:24:1), 离心12000 rpm, 5min，吸取上清液，重复抽提1—2次；将上层DNA溶液转移至1.5 ml离心管，加入等 体积95%乙醇，室温静置5 min后以12000 rpm离心5 min，沉淀用200 pL 70%乙醇洗涤一次，冷冻抽干 后溶于50jiLTE溶液中。(3) PCR扩增内生细菌的16SrDNA根据真细菌16S rDNA保守区设计通用引物CW34667和CW34668 (BW Eckloff, et al， A comparison of 16S ribosomal DNA sequences from five isolates of Helicobacter pylori, International Journal of Systematic Bacteriology, 1994,44: 320-323)进行PCR扩增。通用引物序列如下CW34667: 5'-CTCTCAAACTAGGACCGAGTC-3' CW34668: 5，-TTCCTCCACTAGGTRGGCGT-3，PCR反应体系为10xbuffer2 pi, 2 mmol/L dNTP 1.5 pi, 10 pmoi/L通用引物各0.4 pl， T叫酶IU, 拮抗细菌总DNA 1 pi,补加灭菌去离子H20至20j_a。PCR扩增反应程序为-第1步94'C预变性5 min;第2步94。C变性1 min，第3步58'C复性1 min, 第4步72r延伸1.5min;第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72'C延伸5 min。(4) PCR产物的序列测定及分析将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下需要的DNA片段所在的琼脂糖块，使用V-gene公司 DNA片段回收试剂盒回收DNA片段。将回收产物连接到大连宝生物公司的T-载体连接试剂盒所提供的 pGEM-T easy载体上，利用CaCl2转化法(Sambrook J., Molecular Cloning:A Laboratoiy Manual [M]. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 200i.)将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，筛选阳性克隆， 送至北京奥科生物技术有限责任公司测序。通过两个测序反应获得PCR扩增产物的全长1543 bp,测序结 果输入NCBI,用Blastn程序交送GenBank数据库进行比较分析，表明该序列与GenBank数据库中的枯草 芽胞杆菌属的不同菌株的16S rDNA同源性较高，相似性达到99.2%，鉴定该菌株属于芽胞杆菌科 (Bacillaceae)芽胞杆菌属(Bacillus),申请人将其命名为BSn5。从GenBank数据库中提取产活性物质或者内生性的枯草芽胞杆菌及枯草芽胞杆菌标准菌株168的16S rRNA基因序列(包括不完整的16S rRNA基因序列)，利用CLUSTALW (http:〃align.genome.jp)与BSn5 的16S rDNA序列作多序列比对(multiple s叫uence alignment)。涉及的枯草芽胞杆菌菌株及其16S rRNA 基因的序列号如下IS13 (Gl: 20502053)，能够降解氯酚；NEB4 (Gl: 15420952)和NEB5 (GI: 15420953),定殖于大豆组织内部的内生菌，能够促进大豆的生
长；MP-2 (Gl: 93210286)，降解甲基对硫磷的菌株； KD-1 (Gl: 95107068),能够降解角蛋白Bs against Fusarium (GI: 33333692),从土壤中分离，能够抑制镰刀菌生长；JM4(GI: 51945078),从土壤中分离，产生两种抑菌肽Subpeptin JM4-A (MW 1422.71 Da)和Subp印tin 腿-B (MW 1422.65 Da);168 (GI: 50812173),枯草芽胞杆菌的标准菌株，已完成基因组测序。根据多序列比对结果绘制成系统发生树(见附图1)，图中线段的长度不同表示同源性的差异。表明不 同的枯草芽胞杆菌菌株的进化途径分成了两个支路。本发明分离鉴定的BSn5菌株与已报道的枯草芽胞杆 菌标准菌株168处于同一进化分支，且与产抑菌物质的枯草芽胞杆菌Bs against Fusarium和Bs JM4在进化 分支上相距较远。因此进一步确证BSn5为一株枯草芽胞杆菌，与产抑菌物质的枯草芽胞杆菌菌株Bs against Fusarium和Bs JM4不同。3、 内生菌BSn5的内生定殖鉴定在LB液体培养基28'C下过夜培养所述的BSn5菌株，在无菌操作台上取2(^1过夜培养的BSn5菌液， 注射入无菌培养的花魔芋试管苗茎基部，同时以大肠杆菌DH5a作为阴性对照，每个菌种设3个重复。置 于26'C光照培养室中培养40天，取魔芋试管苗根部进行表面灭菌，具体方法如下用0.15。/。(m/v)升汞 浸泡30 min，然后用75% (v/v)酒精浸泡2 min，最后用灭菌水漂洗3次，取最后一次的洗液0.2 ml涂布 牛肉膏蛋白胨培养基平板，28'C培养48h,没有菌落长出，说明表面灭菌彻底。取表面灭菌后的花魔芋试管苗根部于灭菌离心管中，用lml枪头碾碎，加入0.5ml牛肉膏蛋白胨液体 培养基，上下振荡离心管，静置，待溶液分层后取不含组织碎片的上部分菌液涂布牛肉膏蛋白胨培养基平 板。28'C培养24小时，长出与菌株BSn5形态特征相似的菌落。挑取10个上述菌落与本发明分离鉴定的 菌株BSn5同时点种于胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1混菌平板(制备方法如前所述)，均能产生直径大小相同 (5mm左右)的抑菌圈，说明这些从花魔芋试管苗根部分离的细菌为BSn5,进而说明菌株BSn5为魔芋 内生菌，能够在魔芋根部定殖。4、 本发明的菌株BSn5的抑病活性检测采用市售的马铃薯，自来水洗净表面，去皮，用750/。(v/v)乙醇进行表面消毒。在无菌操作台上，用无 菌刀片将马铃薯切成厚度约为lcm的片状，接种BSn5培养液(浓度约109cfu/m)5 pl于上述马铃薯切片 的中央,28'C培养箱孵育30min。孵育完毕后，在接种了 BSn5培养液的位置接种胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1 培养液(浓度约106cfu/ml) 5^1。另取马铃薯切片，不接种BSn5，只接种SCGl,作为对照。再取一马铃 薯切片，不接种任何细菌，作为空白对照。将上述马铃薯切片放在28'C培养箱，培养24小时。本发明分离鉴定的菌株BSn5对由胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1引起的软腐病的抑病活性试验结果见图2,结果表明培养24小时后接种SCG1而不接种BSn5的马铃薯切片产生明显的软腐症状，病斑较大；同时接种BSn5和SCG1的马铃薯切片无明显软腐症状，说明菌株BSn5能够大大削弱胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1的致病力，对软腐病具有抑病活性。二、 BSn5中抑菌蛋白的提取与活性鉴定1、 BSn5胞外分泌型蛋白的提取与活性鉴定
LB培养液中接种BSn5，过夜培养。以12000 rpm离心10 min，弃沉淀得到培养液上清。各取100ml 培养液上清，冰浴，按照164g/L、 291 g/L和516g/L的浓度分别缓慢加入(NH4)2S04，并不断振荡以防止 局部(NH4)2S04浓度过高，分别得到饱和度为30%、 50%和80%的硫酸铵溶液。静置30 min以上，以12000 rpm于4'C离心0min，将得到的蛋白质沉淀用适量去离子水溶解，移至透析袋(截留分子量8kD 10kD) 中，在去离子水中4'C透析48小时，之后在透析袋表面铺上聚乙二醇10000 (PEG10000)粉末进行浓縮， 最终获得蛋白粗提液。用十二垸基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(汪家政，范明，蛋白质技术手册，北京科 学出版社，2000,第一版)检测蛋白含量相同的上述三种蛋白粗提液，结果见附图3，表明用饱和度为30% 的硫酸铵溶液提取的蛋白粗提液相对较纯，仅有一条可见的蛋白条带。根据标准蛋白相对迁移率(见表1) 绘制标准蛋白相对迁移率曲线(见附图4),根据该曲线得出上述BSn5蛋白粗提液中蛋白条带的相对迁移 率为0.62，进而计算出该蛋白条带大小为31.6kD (汪家政，范明，蛋白质技术手册，北京科学出版社， 2000，第一版)。表l标准蛋白相对迁移率标准蛋白logMW1)相对迁移率2)p-半乳糖苷酶(p-galactosidase)2,060.148牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)1.820.272鸡卵白蛋白(ovalbumin)1.650.41学L酸脱氧酶(Lactate dehydrogenase)1.510.53Rease bsp9811.40.72B國乳球蛋白(p-lactoglobulin)1.260.89溶菌酶(lysozyme)1.160.991) MW:表示分子量2)相对迁移率=样品迁移距离/染料迁移距离2、 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化BSn5胞外蛋白利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(汪家政，范明，蛋白质技术手册，北京科学出版社，2000，第一 版)分离用饱和度为30%的硫酸铵溶液提取的蛋白粗提液。在粗提液中加入等体积2x非变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳加样缓冲液(100mmol/LpH6.8TrisHCI+2(m甘油+0.2。/。溴酚蓝)，加入点样孔，电泳至溴酚蓝带 电泳出凝胶底部停止电泳。电泳完毕后，取一侧凝胶少许染色，根据显色蛋白带的位置切下剩余凝胶上的 该蛋白带。将切下的凝胶加2ml去离子水，碾钵中碾碎，8000卬m离心lmin,取上清，得到不含凝胶碎 片的纯化蛋白液。另切下相同大小的空白凝胶重复以上步骤，将空白凝胶提取液作为阴性对照。3、 BSn5胞外蛋白抑菌活性的鉴定1) BSn5胞外蛋白粗提液抑菌活性的鉴定按照前述方法制备胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1混菌平板，在平板上用无菌镊子均匀放置四片直径约为 5 mm的无菌滤纸片，将20nl按照表2配制的不同浓度的BSn5胞外蛋白粗提液样品少量多次点加在无菌 滤纸片上，在28'C培养过夜。测量所形成的抑菌圈直径，结果表明BSn5胞外蛋白含量与形成的抑菌圈大 小呈正相关(见附图5),含量为3.25昭的BSn5胞外蛋白即可形成直径为16 mm的抑菌圈。进而说明'BSn5胞外蛋白对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1具有抑菌活性。表2不同含量的BSn5胞外蛋白产生的抑菌圈直径样品编号1样品体积(w)201052.5去离子水(fll)0101517.5样品含量(吗)26136.53.25样品浓度(pg/w)1.30.650.330.16抑菌圈直径(mm)211917.5162)纯化后的BSn5胞外蛋白抑菌活性的鉴定按照前述方法，用非变性凝胶电泳(汪家政，范^|，蛋白质技术手册，北京科学出版社，2000，第 一版)纯化用饱和度为30%的硫酸铵蛋白粗提液。按照BSn5胞外蛋白粗提液抑菌活性的鉴定方法，检测 发现含量为50ng的纯化后的BSn5胞外蛋白形成的抑菌圈的直径为10mm,而阴性对照没有形成抑菌圏。 重复该实验三次，结果一致。表明该31.6 kD蛋白为BSn5的对胡萝卜软腐欧文氏菌SCGl具有抑菌活性 的物质，将该蛋白命名为APn5。4、抑菌蛋白APn5的活性分析将BSn5胞外蛋白粗提液分别用50。C、 60°C、 70'C、 80°C、 100。C和120'C处理30 min;用蛋白酶K、 胰蛋白酶(两种酶均为商业购买，其反应浓度均为20mg/L)在37'C下处理60min,同时以未作任何处理 的BSn5胞外蛋白粗提液为阳性对照，以添加了等量蛋白酶K和胰蛋白酶的去离子水为阴性对照。按照BSn5 胞外蛋白粗提液抑菌活性的鉴定方法，检测其对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1的抑菌活性，各样品均设两个实验结果表明，未加热处理的BSn5胞外蛋白粗提液和分别用50'C、 60'C、 70'C处理的蛋白粗提液均 能形成抑菌圈，80'C、 IOO'C和12(TC处理的蛋白粗提液不能形成抑菌圈(见表3)，说明BSn5胞外蛋白粗提 液中的抑菌物质对较高的温度敏感。蛋白酶K处理的蛋白粗提液和蛋白酶K阴性对照不能形成抑菌圈(见 表3),表明蛋白酶K能够破坏BSn5胞外蛋白粗提液中的抑菌物质的活性。胰蛋白酶处理的蛋白粗提液形 成了抑菌圈，而胰蛋白酶阴性对照不形成抑菌圈(见表3),说明BSn5胞外蛋白粗提液中的抑菌物质经胰蛋 白酶处理后仍然保持活性。表4应用不同蛋白酶和温度对BSn5蛋白提取液抑菌圈大小的影响不同处理蛋白含量(吗)形成抑菌圈直径(mm)12未处理26212150°C2620.82160°C26202070。C26191980°C2600100°C2600120°C2600胰蛋白酶262020蛋白酶K2600利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析部分经过不同处理的BSn5胞外蛋白粗提液成分(见 附图6),表明1) 分别用胰蛋白酶和50'C处理样品时，APn5蛋白条带不受影响，而此时抑菌活性基本不变；2) 当用蛋白酶K处理样品时，绝大部分APn5蛋白降解成小于14.4kD的蛋白，而此时检测不到抑菌 活性；3) 80'C和120'C处理样品时，APn5蛋白全部降解成多肽或小于14.4 kD的蛋白，而此时也检测不到 抑菌活性。BSn5的蛋白粗提液的抑菌活性与APn5的蛋白条带呈正相关(见表4),说明APn5是BSn5产生的抑 菌活性物质，且APn5蛋白具有热不稳定和对蛋白酶K敏感的特性。_表5不同处理抑菌活性与APn5蛋白的关系_不同处理 APn5蛋白 抑菌活性未处理 存在50°C 存在80°C 不存在120。C 不存在胰蛋白酶 存在蛋白酶K 痕量有有无无有无
权利要求
1一种对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)BSn5，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NOM207124。
2、 权利要求l所述的枯草芽胞杆菌，其特征在于，它能够产生分子量为31.6kDa的抑菌 蛋白，该蛋白被命名为Apn5。
3、 一种对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的蛋白，它是由保藏号CCTCC N0.M20712'4 的枯草芽胞杆菌BSn5所分泌的。
4、 权利要求3所述的蛋白，其分子量为31.6kDa。
5、 权利要求1或2所述的枯草芽胞杆菌在制备防治魔芋软腐病的微生物制剂中的应用。
6、 权利要求3或4所述的蛋白在防治魔芋软腐病中的应用。
全文摘要
本发明属于农业微生物学技术领域。公开了一种对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)BSn5及其抑菌蛋白APn5。从被细菌感染的花魔芋愈伤组织中，分离得到一株新的枯草芽胞杆菌菌株BSn5(保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM207124)，该菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性，抑菌蛋白APn5分子量大小为31.6kDa。
文档编号C12N1/20GK101165171SQ20071005342
公开日2008年4月23日 申请日期2007年9月30日 优先权日2007年9月30日
发明者盈 周, 喻子牛, 明 孙, 韩冬梅 申请人:华中农业大学