水稻广亲和基因s5的分离克隆及应用的制作方法

专利名称：水稻广亲和基因s5的分离克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻广亲和基因5"5的分离克隆、功能验证及在水 稻改良中的应用。
背景技术：
水稻属禾本科(Cr柳/"eae)、禾亚科(尸owVeae)的稻属(Qrj^eae),分为两个栽培稻种亚洲栽培 稻(Ory幼幼t/ra L.)和非洲栽培稻(&丁za ^aAerri咖)。亚洲栽培稻又分为籼亚种(ssp. y/K/ica) 和粳亚种(ssp. Japo/7ica)。两个亚种在形态和遗传上存在着明显的差异，同时也存在着生殖障碍，籼粳 亚种间杂种往往表现为不育或半不育(Kato S， Kosaka H, Hara S (1928) On the affinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants. 5W Fac〃"化 3:132-147;
Oka HI (1988) Origin of cultivated rice. Scientific Societies Press, Tokyo, Japan pp 181 -209; Liu KD， Zhou ZQ， Xu CG， Zhang Q, Saghai Maroof MA (1996) An analysis of hybrid sterility in rice using a diallel cross of 21 parents involving /"o^'ca,力/7cwica and wide compatibility varieties. E卯hytica 90:275 - 280)。水稻籼粳亚种间具有比水稻品种间更强的杂种优势，但籼粳亚种间杂种的不育 性却限制了对其杂种优势的利用。日本学者Ikehashi和Araki (Ikehashi H， Araki H (1984) Variety screening of compatibility types revealed in Fl fertility of distant cross in rice. Jpn J Breed 34:304- 313)，通过对74种不同生态型水稻品种间杂交结果的研究，发现某些水稻品种与籼粳稻杂交， 杂种都表现为可育，他们将这些特殊的水稻品种称为广亲和品种(Wide Compatibility Variety, WCV)。 水稻广亲和品种中的广亲和基因可以有效的克服籼粳亚种间杂种的不育性。
研究者利用各种遗传标记对水稻籼粳亚种间杂种的不育现象进行了广泛的研究。研究表明影响小穗育 性的位点分别对应于胚囊育性和花粉育性，说明雄性败育和雌性败育对亚种间杂种败育都有着很重要的作 用。
Ikehashi和Araki (Ikehashi H， Araki H (1986) Genetics of Fl sterility in remote crosses of rice. In: IRRI (ed) Rice genetics. IRRI， Manila, pp 119-130)首先将广亲和基因定位在第6染色 体的色素基因C和糯性基因盯之间，并命名为5^。他们通过对育性分离结果的考察，指出5"5位点是一组 复等位基因5fn (广亲和)、(籼稻)、(粳稻)。其中，由5^nAS^n、 5^n/5^i、 55^n/j 组合而成的合子，杂种育性正常。而由5^jA 54组成的合子，则表现为不育或半不育。
广亲和品种的发现，使得水稻籼粳亚种间杂种优势的利用成为可能。本发明旨在通过对水稻广亲和基 因55的研究更好的利用水稻籼粳亚种间强大的杂种优势，进一步提高杂交水稻的生物学产量。

发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个水稻广亲和基因S5,对该基因进行功能验证及在水稻改良中的 应用。所述的基因与天冬氨酰蛋白酶基因序列高度同源。利用该基因克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性， 从而使籼粳亚种间强大的杂种优势得以发挥，进一步提高水稻的生物学产量。
本发明涉及分离和应用一个编码天冬氨酰蛋白酶的广亲和基因的DM片段，并对该片段的作用机 理进行阐述。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 1-3所示，或者基本上相当于SEQ ID NO: 1-3所示的 高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO: 1-3所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的广亲和基因5"5的DNA片段作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基 因或同源基因。同样，也可以采用PCR技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的5^基因以及任 何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含S5基因的序列，将这一序 列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对籼稻粳稻广亲和的转基因植 株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型
启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密 码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。
携带有本发明55基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿 孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach (1998) Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition))-可使用包括本发明55基因的表达载体转化水稻籼稻和粳稻亚种，培育广亲和品种。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。


序列表SEQ ID No: 1显示的是本发明分离克隆的包含有基因编码区DNA片段序列。序列表SEQ ID No:2显示的是本发明分离克隆的包含有5^j基因编码区DNA片段序列。序列表SEQ ID No:3显示的是本 发明分离克隆的包含有i基因编码区DNA片段序列。
图l: 5"5基因克隆和分离鉴定流程图。
图2: 5"5基因效应下籼稻、粳稻和广亲和品种杂种育性示意图。
图3:互补载体构建示意图。
图4:遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。
图5: T,代转基因阳性植株(左)小穗不育和转基因阴性植株(右)小穗可育。 图6: T,代转基因阴性植株(a)和转基因阳性植株(b)花粉均可育。
图7: T,代转基因阴性植株(a)胚囊可育和转基因阳性植株(b)胚囊败育。标尺长度50Wn。 图8: T。代转基因阳性植株和转基因阴性植株(a)以及T,代转基因阳性植株和转基因阴性植株(b)胚囊 育性、花粉育性和小穗育性图示。
图9:广亲和品种、粳稻和籼稻5^基因cDNA结构示意图。 图10:广亲和品种、粳稻和籼稻S5蛋白结构示意图。
图ll: 5^基因在水稻全生育期不同组织中表达水平示意图。使用的芯片数据包括籼稻Zhenshan97和 Minghui 63不同生长时期下的25种不同组织。
图12:体外检测S5蛋白绝对活性(a)和相对活性(b)。其中绝对活性以水为对照测定，相对活性以该 蛋白活性最高的点为对照测定。白色柱状图示意蛋白酶在不同pH条件下活性，深色柱状图示意蛋白酶活 性被p印statin A抑制。
图13: SDS-PAGE胶图显示S5蛋白在不同pH条件下自身剪接活性。
图14:原位杂交确定S5基因在水稻中的表达部位。(a)该基因在Ballila珠被和孢母细胞表达；(b) 该基因在02428珠心和孢母细胞中表达；(c)该基因在Ballila小孢子母细胞中表达。标尺长度为25Wn。
具体实施例方式
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有S5基因完整 编码区段的DNA片段以及验证5"5基因功能的方法(发明流程如图l所示)。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做 出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。 实施例1 :分离克隆包含有S5基因区段的DNA片段
1.利用图位克隆技术鉴定水稻广亲和基因
本发明中构建定位群体时用到了三个亲本02428、南京11和Balilla。 02428是一个粳型的广亲和 品种，是选用两个粳稻品种云南螃蟹谷和上海汲浜稻，分别用辐射诱变处理，并经高光效筛选出的材料间 杂交，从后代中选育成的(邹江石等，广亲和选系02428在籼粳亚种间杂交的初步利用.中国农业科学，1989, 22: 6-14)。南京11为江苏农科院育成的中籼品种，属胜利籼衍生品系。巴利拉(Balilla)是引 自意大利的粳型品种。
本发明在前期工作中构建了一个包含7000个单株的三交F,大群体。1999年春在海南陵水配制02428/ 南京ll杂交组合。同年夏天布^武汉种植F,代植株，筛选阳性单株。1999年冬天，将杂种稻篼移往海南陵 水基地，并尽量分篼。在2000:b天，以02428/南京11真杂种稻篼作为母本，与Balilla大量配制三交 R杂种。2000年夏天，在水稻生长季节，在华中农业大学(武汉)水稻试验田分单株植株02428/南京 11〃Balilla三交F,群体,最后共成苗7000株。
考察7000株三交F,群体中所有高结实率的单株，总共获得了 1000多株结实率在70%以上的单株。 从中随机选取202株结实率在70%以上的真杂种单株，进行DNA抽提和标记分析，对S5区段的分子标记 进行重组交换分析。DNA的抽提按Murray和Thompson的CTAB法进行(Murray M G， Thompson W F (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl Acids Res. 8: 4321-4325)。分子标记 的RFLP分析，包括DNA酶切、电泳、转膜和杂交，按Liu等人(Liu K D et al. (1997) A ge加me-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theor A卯l Genet. 95:809-814)的实验程序进行。5"5基因限定在分子标记N29和23D12R之间，结 果如表1所示。
表1利用202株高结实率单株对广亲和基因的定位
标记RZ398RZ450RM253to323D12RRG213RG138R2171
交换单株数68685552525051535365
选取SSR标记RM253或PCR—RFLP标记Cll和RG213对所有高结实率的单株进行了扫描，单株用到SSR 标记RM276和RM225进行筛选。其中，标记RM225、 RM253和Cll位于基因S5的一侧，标记RG213和RM276 位于基因5"5的另一侧。共筛选到了 44株在标记之间发生重组的单株。利用5^区段的分子标记对这44株 高结实率的重组单株进行了重组分析，结果显示广亲和基因S5限定在分子标记7B1和15D2之间，两端各 有一个重组单株，部分重组单株的信息如表2所示。 表2利用5^区段的分子标记对44株重组单株的基因型分析(部分数据)
F 0a 0
F 0 0
F 0 0
F 1 1
F 1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
r i i o
0
1 1 1
1 1 1
1 1 1
0 0 0
0 0 0
aGenotype 0 of each locus was composed of an allele from 02428 and an allele from Balilla bGenotype 1 of each locus was composed of an allele from Nanjing 11 and an allele from Balilla 上述结果将广亲和基因5"5定位在两个亚克隆分子标记7B1和15D2之间约40 kb的DNA区段上。利用 http:〃www. softberry. com网站上的FGENSH软件对分子标记7B1和15D2之间40 kb的DNA片段进行了 开放阅读框(open reading frame: 0RF)的预测，共检测到了 5个完整的ORFs， Blaxt X同源性分析发 现候选基因0RF5与天冬氨酸蛋白酶(eukaryotic aspartyl protease)高度同源。
RG213
G200
RG138
2349
23D12R
F7
7D3
7F11
15D2
7B1
F29
F34
F38
M6
N29
Cll
E23
A30
HM253
Genotype
Individual
s
2.遗传转化载体的构建及转基因植株的表现
本发明基因55位点是一组复等位基因^^n(广亲和)、Sfi(籼稻)、5f j(粳稻)。其中，由5^n/5^n、 5fn/5^i、 n/Sf j组合而成的合子，杂种育性正常。而由SfjAS^i组成的合子，则表现为不育或 半不育(图2)。根据此基因的功能，申请人采取将籼稻片段转入粳稻植株的策略，从转基因植株(基因型 j/5fj+5^"i)的育性表型来验证。此基因将会产生不育表型。
互补载体的构建方法是根据籼稻南京11基因组序列设计PCR引物ASPHF(5， _ TAAAAAGCTTCATCATGGGCTGCTGCTAGATGGA-3，)和ASP冊(5' - TGCTAAGCTTTACGAGGTCATGGGTTGAAGTCCT-3，) 将候选基因区段扩增出来，互补载体外源PCR扩增反应所用的试剂来自Takara公司，反应条件为94'C, 3 min; 94°C， 1 min, 60'C, 1 min， 68°C， 6 min， 30 cycles; 72°C， 5 min。
互补载体构建示意图如图3所示。PCR产物直接用HindIII酶切，双元载体(图4) pCAMBIA1301 (来 自澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture),携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子Ubiquitinl的农杆菌介导的遗传转化载 体)也采用HindIII酶切，去磷酸化后连接。转化大肠杆菌DH10J3 (购自Invitrogen公司)，筛选阳性克 隆。釆用农杆菌介导的方法转化，农杆菌菌株为超毒力菌株EHA105 (Sun X, Cao Y, Yang Z， Xu C， Li X, Wang S， Zhang Q (2004) Ja邻 a gene conferring resistance to Ja"t力。/i70/2as o/yzae pv. o/jzae in rice, encoding a LRR rec印tor kinase-like protein. Plant J 37:517-527),转基因的受体为粳稻品 种Balilla。
本发明遗传转化的主要步骤、培养基及其配制方法如下所述
(1) 试剂和溶液縮写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA (6-BenzylaminoPurine， 6-苄基腺嘌 呤);CN (Carbenicillin，羧节青霉素);KT (Kinetin,激动素);NAA (Napthalene acetic acid, 萘乙酸);IAA (Indole-3-acetic acid,巧l哚乙酸):2， 4-D (2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2，4-二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone， 乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate， 水解酪蛋白)；HN (HygromycinB，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜)；N6max (N6 大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS 微量元素成分溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培养基大量元素母液(按照10倍浓縮液(10X)配制) 硝酸钾(KN03 ) 28 . 3克 磷酸二氢钾(KH2P04) 4.0克
硫酸铵((NH》2S04) 4.63克 硫酸镁(MgS04 7H20) 1. 85克
氯化钙(CaCl2 2H20) 1. 66克
将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。
2) N6培养基微量元素母液(按照100倍浓縮液(100X)配制 碘化钾(KI) 0.08克
硼酸(H3B03) 0. 16克
硫酸锰(MnS04 4H20) 0. 44克
硫酸锌(ZnS04 7H20) 0. 15克
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。
3) 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓縮液配制)
将3. 73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA 2H20)和2. 78克FeS04 7仏0分别溶解，混合并用蒸馏水定 容至1000毫升，至70'C温浴2小时，4'C保存备用。4) 维生素贮存液(按照100X浓縮液配制) 烟酸(Nicotinic acid) 0. l克 维生素Bl (Thiamine HC1) 0. l克 维生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. l克 甘氨酸(Glycine) 0. 2克 肌醇(Inositol) IO克 加蒸馏水定容至1000毫升，4'C保存备用。
5) MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制) 硝酸铵(NH4N03) 16. 5克
硝酸钾 19.0克
磷酸二氢钾 1.7克
硫酸镁 3. 7克
氯化钙 4.4克
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6) MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制) 硫酸锰(MnS04 4H20) 2.23克
硫酸锌(ZnS047H20〉 0.86克
硼酸(H3B03 ) 0. 62克
碘化钾(KI) 0.083克 钼酸钠(Na2Mo04 2H20) 0. 025克
硫酸铜(CuS04 5H20 ) 0. 00 25克
氯化钴(CoCl2 6H20 ) 0. 00 25克
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7) 2,4-D贮存液(l毫克/毫升)的配制-
秤取2,4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，于室温下保存。
8) 6-BA贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，室温保存。
9) 萘乙酸(NAA)贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取NM100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存备用。
10) 喷哚乙酸(IAA )贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取IM 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存备用。
11) 葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制
秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4'C保存备用。
12) AS贮存液的配制
秤取AS 0.392克，加入DMS0 10毫升溶解，分装至l. 5毫升离心管内，4'C保存备用。
13) 1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。 (3)用于水稻遗传转化的培养基配方 1)诱导培养基
N6max母液(取已经制备好的10X浓縮液，下同) IOO毫升
N6mix母液(取已经制备好的100X浓縮液，下同) IO毫升
Fez+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓縮液，下同) IO毫升
维生素贮存液(取已经制备好的100X浓縮液，下同) IO毫升
2， 4-D贮存液(取上述制备好的) 2. 5毫升
脯氨酸(Proline) 0. 3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸馏水至900亳升，1N氢氧化钾调节pH值到5. 9,煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如12rC下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的 灭菌方法相同)。
2) 继代培养基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA IC存液(100X) IO毫升
维生素贮存液(100X) IO毫升
2， 4-D贮存液 2. 0毫升
脯氨酸 0.5克
CH 0.6克
庶糖 30克
Phytagel 3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50亳升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3) 预培养基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA Jt存液(100X) 2. 5毫升
维生素贮存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D fC存液 0. 75毫升
CH 0. 15克
蔗糖 5克
琼脂粉 1.75克 加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升 /皿)。
4) 共培养基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA jt存液(100X) 2. 5毫升
维生素贮存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D贮存液 0. 75毫升
CH 0.2克
蔗糖 5克
琼脂粉 1.75克
加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升ASIfc存液，分装倒入培养皿中(25毫升/ 每皿)。
5) 悬浮培养基
N6max母液(10X) 5毫升 N6mix母液(100X) 0. 5亳升
Fe2+EDTA贮存液(100X) 0. 5毫升
维生素贮存液(100X) l毫升 2， 4-D贮存液 0. 2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4,分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。 使用前加入l毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6) 选择培养基
25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 625毫升
0, 15克 7.5克
1. 75克
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升)分装倒入培养皿 中(25毫升/皿)。(注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养 基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7) 预分化培养基 N6隨母液(10X) N6mix母液(100X) Fe"EDTA IC存液(100X) 维生素贮存液(100X) 6-BA贮存液
KT ie存液 naa ie存液
IAA !t存液 CH 蔗糖 琼脂粉
N6隨母液(10X) N6raix母液(100X) Fe^EDTA IC存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2， 4-D贮存液 CH
琼脂粉
25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 5毫升 0. 5毫升 50微升 50微升 0. 15克 7. 5克 1.75克
加蒸馏水至250毫升，1 N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。 使用前溶解培养基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升) 毫升/皿)。 8)分化培养基
N6max母液(10X) IOO毫升 N6mix母液(100X) IO毫升
分装倒入培养皿中(25
Fe2+EDTA贮存液(100X) IO毫升 维生素贮存液(100X) IO毫升 6-BA JC存液 2毫升 KT贮存液 2毫升 NAA Jt存液 0. 2毫升
IAA贮存液 0. 2亳升
C H l克 蔗糖 30克 Phytagel 3克 加蒸馏水至900毫升，1 N氢氧化钾调节pH值到6. 0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000亳升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。 9)生根培养基
MSmax母液(10X) 50毫升 MSmix母液(100X) 5 Fe2+EDTA IC存液(100X) 5 维生素贮存液(100X) 5 庶糖 2 Phytagel 3 加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5. 8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤 4. 1愈伤诱导
1) 将成熟的Ballila水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCh)种子 表面消毒15分钟；
2) 用灭菌水洗种子4-5次；
3) 将种子放在诱导培养基上；
4) 将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25土1'C。 4. 2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25士1'C。 4. 3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25士rc。 4. 4农杆菌培养
1) 在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南， 第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002,北京)上预培养农杆菌5ffi4205(该菌株来自CAMBIA公 司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28'C;
2) 将农杆菌转移至悬浮培养基里，28'C摇床上培养2-3小时。 4. 5农杆菌侵染
1) 将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
2) 调节农杆菌的悬浮液至0D6。。 0. 8-1. 0;
3) 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20'C。 4. 6愈伤洗涤和选择培养
1) 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2) 浸泡在含400毫克/L潮霉素的灭菌水中30分钟；
毫毫毫魄克3) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4) 转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。 4.7分化
1) 将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
2) 转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26'C。 4.8生根
1)剪掉分化时产生的根；
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。 4.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
本发明共获得独立转基因T。代水稻植株33株，包括29株阳性单株和4株阴性单株。所获得的T,代 水稻植株以B10家系为例，包括15株阳性单株和14株阴性单株。
转基因水稻阳性和阴性植株小穗育性(图5)差异显著(^=7.4, /M).0000);转基因水稻阴性植株小 穗平均育性(53.3%)远高于转基因水稻阳性植株2.8%的小穗育性。申请人亦检测了 T。代转基因水稻植株 的胚囊育性和花粉育性，其中花粉育性在转基因阳性和阴性水稻植株中无显著差异(见图6)，而转基因阴 性植株胚囊育性显著高于转基因阳性植株胚囊育性(图7) (t=12.33， P=0.0000)。 T。f^转基因阳性植株和 转基因阴性植株以及T,代转基因阳性植株和转基因阴性植株胚囊育性、花粉育性和小穗育性如图8所示， 结果表明S5位点引起水稻籼粳亚种间育性降低是由于胚囊败育所致。
结果表明，本发明克隆的基因5"5是一个介导水稻籼粳亚种间广亲和的基因。
3.含有5"5基因区段的DNA片段的分离克隆
分别使用cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR引物延伸的方法获得该基因全长cDNA。使用材料为籼稻 南京11 ，粳稻Bal 1 i la和广亲和品种02428幼穗发育的五期叶片，液氮冷冻后于-70'C冰箱待用。按照TRIZ0L 说明书所述步骤提取RNA (注TRIZ0L Reagent, Invitrogen Cat. No. 15596-018),稀释浓度至1P g/u 1， -7(TC保存待用。
RACE具体步骤使用Clontech的SMART RACE cDNA Amplification Kit,步骤参照该试剂盒说明书。 5，端RACE引物S5-GSP1: CCGTTCCAACCAGAATAGTCGTGCT
S5-R1: ACCCGAACATGAGATCCATAAACGA 3，端RACE引物S5-GSP2: AAGATGGTGACAGACACGCTGAGGA
S5-RACE4: CAATCAACAGGCCAACCTACTCAC UPM: Long (0. 4M): CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCAA CGCAGAGT
Short (2uM): CTAATACGACTCACTATAGGGC NUPM: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 其中UPM和NUPM由上述试剂盒提供。 第一轮PCR反应条件 94'C变性30秒，72'C3分钟，5个循环; 94。C变性30秒，7(TC退火30秒，72'C延伸3分钟，5个循环； 94。C变性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸3分钟，27个循环； 72'C最终延伸10分钟。 5' 1^〔￡使用引物1^11+ S5-GSP1 3' 1^^￡使用引物1^1 + S5-GSP2 第二轮PCR反应条件 94'C预变性4分钟；
94'C变性1分钟，59'C退火1分钟，72t;延伸l分钟20秒，35个循环；
72'C最终延伸10分钟。
5， 1^。￡使用引物昍 1{+ S5-Rl
3， 1^06使用引物1\11^1 + S5-RACE4
PCR引物延伸具体步骤反转录采用20" 1体系，按照DNaseI说明书所述步骤去除RNA中痕量DNA 后，按Superscript II说明书所述步骤操作，产物于-20。C保存待用。(注Deoxyribonuclease I， Invitrogen Cat. No. 18068-015; Superscript II Reverse Transcriptase, Invitrogen Cat-No. 18064-022)使用上述反转录产物In 1为模板做PCR。使用raAara ￡r fs9(Takara code: DRKOIAM)做 PCR， PCR所用试剂均来自7^ytara r邵包装。
PCR所用引物如下 F5-3: ATCAACCCATTTCCTTTCCTACG F5-2: CTGCCCCTGAGCAAGCAAGAAAG F19-3: AGCCGACGACGAGTTGGAGTGT 5F2: CCAAGATCTGCCGACGACGAGTTGGAGTGT BDF2: GACGACGAGTTGGAGTGT S5-F11: CAGCCGACGACGAGTTGGAGT S5-F2: GTGCGGCGAGCTGAGGTACGAT S5-GSP2: MGATGGTGACAGACACGCTGAGGA S5-RACE4 CAATCAACAGGCCAACCTACTCAC Rll: ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA BDR: CATTAGGAACAGGAAGTCGT S5-Rll: CTCTGCCCGTTGGCGATAAGC S5-R2: TCTGGGTGGCAAAGCGAGTGC -S5—R33: ATGGCGGCACGGTCGTATCTT
R3--1ACGTAAACATCTAGTAGTGGCTCA
R3--2TTGGCACGAACGGTTCAAGAG
R3--3GATCAGTTATTTGGGCAAACCAG
R3--4GGTCCCAAATCAAGTACCGCTAG
R3--5GCTCAACAATTAGGACATACGAC
分别对RACE产物和PCR产物测序获得所需全长基因。
实施例2: 5"5基因在水稻不同亚种的结构分析
对实施例1中测序得到的序列进行分析水稻品种02428 (广亲和)、Ballila (粳稻)和南京11 (籼 稻)的全长cDNA分别是1778bp、 1912bp和1911bp，其结构由三个外显子和两个内含子组成(图9)。籼 稻和粳稻有且仅有三个碱基的差异，其中南京11在3'非翻译区有一个单碱基的缺失，南京11和Ballila 在编码区有两个单碱基多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，这两个SNP在编码蛋白中形 成两个错义突变(图10) 。 55基因编码一个472氨基酸的蛋白质，BLASTp分析 (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/ )表明该蛋白与天冬氨酰蛋白酶高度同源。PROSITE (http:〃丽.expasy.ch/cgi-bin/prosite/)分析发现该蛋白在第129-140个氨基酸和334-345个氨基 酸存在两个活性位点。SignalP 3.0 (http:〃丽.cbs. dtu. dk/cgi-bin/)软件分析表明S5蛋白存在一 个信号肽，它在蛋白成熟过程中被切除。
实施例3:利用芯片数据检测S5基因在水稻全生育期中表达水平
本发明禾U用芯片数据(Database of the National Center of Plant Gene Research, available at
http:〃cr印.ncpgr.cn/.)检测5"5基因在水稻全生育期不同组织中表达水平，使用的芯片数据包括籼稻 Zhenshan 97和Minghui 63不同生长时期下的25种不同组织(表3)的表达谱(图11)。结果表明S5基 因在全生育期都极低水平表达。
表3芯片数据对应水稻组织名称_
_5"柳; je 7Yss"e__________
1 Calli:15 day after induction
2 Resistant calli-screening stage
3 Seed: germination (72 h after imbibition)
4 Seedling: 3 days after sowing
5 Seedling: trefoil stage
6 Shoot: seedling with 2 tillers
7 Root: seedling with 2 tillers
8 Panicle: secondary branch primordium differentiation stage
9 Leaf: secondary branch primordium differentiation stage
10 Sheath: secondary branch primordium differentiation stage
11 Panicle: 4-5 cm young panicle
12 Leaf: 4-5 cm young panicle
13 Sheath: 4-5 cm young panicle
14 Panicle: pistil/stamen primordium differentiation stage
15 Panicle: pollen-mother cell formation stage
16 Stem: 5 days before heading
17 Flag leaf: 5 days before heading
18 Stem: heading stage
19 Panicle: heading stage
20 Glume: one day before flowering
21 Stamen: one day before flowering
22 Spikelet: 3 days after pollination
23 Endosperm: 7 days after pollination
24 Endosperm: 14 days after pollination
_25 EndospeniK 21 days after pollination_
实施例4: S5蛋白具有天冬氨酰蛋白酶活性
天冬氨酰蛋白酶在酸性条件下被激活且其活性为p印statin A所抑制(Rawlings ND， Barrett AJ (1995) Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods Enzymol. 248:105-20)。而本发明基因与天冬氨酰蛋白酶高度同源，为了验证本发明基因55是否是一个典型的天冬 氨酰蛋白酶，本实例设计一个体外实验来验证S5蛋白是否具有这一功能。
具体实施步骤为
(1) 原核表达载体构建
设计引物5F1 (5， - GGGAGATCTATGGTGATCTTGGAGCAGCCA-3'， 接头加BglII酶切位点)和5R (5'-AGGCTCGAGCGACGATCAGCAMCGGCA-3' 接头加Xhol酶切位点)，以日本晴全长cDNA (来自北京凯拓公司) 为模板PCR扩增全长。PCR扩增反应所用的试剂来自Takara公司。反应条件为94°C， 5min; 94'C, 1 min， 59°C， 1 min， 72°C, 1. 5min， 30 cycles; 72°C, 5 min。产物构建到pGEM ~T (购自Promega)载体中， 测序验证。然后分别将外源构建到PMAL-c2x载体中(购自5i'oZa6s),载体用BamHI和Xhol酶切。
(2) 蛋白诱导表达
将构建好的表达载体转化表达菌株BL21 (购自Invitrogen公司)，等菌液0D值达到0. 6时，加入终 浓度为0. 5mM的IPTG(isopr叩yl 1-thio-P -D-galact叩yranoside),然后37。C诱导表达3hrs。收集菌体， 加入一倍体积的PBS悬浮，置-20 'C过夜。第二天溶解，立即放在冰上，加入终浓度为lmM的PMSF，超声 处理，整个超声过程在冰上进行，以保证蛋白处于天然状态。超声处理完成之后12000rpm， 4'C冷冻离心。 收集上清，用Amylose Resin (购自A'oZaAsO纯化。纯化步骤参照pMAL Protein Fusion and Purification Instruction Manual, Catalog ttE8000S
(3) 蛋白酶活性检测
20ul (10ug)纯化的蛋白，加入等体积的pH缓冲液与20u 1 FITC-casein(Protease Fluorescent Detection Kit), 37。C下反应15小时后加入lOOul 0.6N三氯乙酸(TCA)沉淀，12000rpm离心lOtnin,吸 上清100ul，力口入2ml assay buffer,用荧光分光光度计(Fluorescence spectrophotometer, Hitachi850) 测量。水为对照。
pH缓冲液配方
0.1M Gly-HCl， pH2. 5
0. 1M 0.1 M sodium citrate, pH3. 0, pH3. 5, pH 4.0; 0. 1M sodium acetate, pH 5.0; 0.1 M sodium phosphate, pH 6.0;
(4) 检测ASP是否被p印statin A抑制剂抑制
实验步骤8ug纯化的目标蛋白中加入终浓度为0.15mM p印statin A， 4°C孵育1.5小时后，加入 pH二3的缓冲液至终体积40iil，然后再加入底物FITC-Casein 20 li 1 (sigma， PF0100), 37 。C下孵育12小 时后，加入100 u 1 0. 6NTCA沉淀，吸上清100 u 1，加入2ml assay buffer,用荧光分光光度计(Hitachi M850 fluorescence spectrophotometer ， Japan)测量。只含有标签麦芽糖结合蛋白(MBP)的纯化蛋白 作为对照，每个做三次重复。
(5) 天冬氨酸蛋白酶的自身剪接，形成成熟蛋白的初步分析
原核表达纯化的/I邵10ul(20ug),加入1/2体积的PH缓冲液，37'C反应过夜，加入一倍体积的 loading buffer,水煮5min， 12%SDS_PAGE电泳，考马斯蓝染液染胶。
结果表明该蛋白在pH3.0的条件下活性最高(图12)，且被p印statin A完全抑制(图12)。实验同 时表明该蛋白pH 2.5-4.0的条件下通过自身剪接，形成成熟蛋白(图13)。
上述结果表明本发明基因确实编码一个典型的天冬氨酰蛋白酶。 实施例5: S5基因的表达部位
为了确定55基因的表达部位，本实例使用了 RNA原位杂交技术。根据RNA探针杂交信号确定本发明 基因在珠心、珠被、孢母细胞和小孢子母细胞中表达(图14)。
RNA原位杂交流程参见Drews (Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71 Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71)。序列表
<110> 〈120> <130〉 <141〉 <160> <170> <210〉 <211> <212〉 <213> <220> <221〉 <222> <223> <220> <221〉 <222> <223> <220〉 <221> <222> <223> <220> <221> <222〉 〈223> <400>
华中农业大学
水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用
2007-10-10 7
Pstentin version 3.1 1
1778 DNA
水稻(Oryza sativa) gens
(l).. (1778)
5' UTR (1441).
(1778)
3'UTR (l).. (21)
CDS (22).
1
(1440)
atcaacccat ttcctttcct a cgt ttg
Arg Leu 1
caa gaa 3ga sag aa3 gaa ggg 3tt Gin Glu Arg Lys Lys Glu Gly lie 15
gca gcc gac gac gag ttg gag tgt Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys 30
gtg aac tct caa ggc gcc att cag Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin 45
caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val 60 65
act gcc tgc Thr Al3 Cys 5
aaa ttt get Lys Phe Ah 20
ccc tec tec Pro Ser Ser 35
ttc ccc gtg Phe Pro Val 50
cgt gca acc Arg Ala Thr
ctg ccc ctg Leu Pro Leu
taa tec ggc Ser Gly
ate ttc gat lie Phe Asp
ttc Phe
CElg
Gin
C8C
His
Ala 70
aag
Lys
55
tec
Ser
age Ser
gcc Ala
C3C
His 40
Lys
sag
Lys
10
aca
Thr
25
get
Ala
cac His
teg acc Ser Thr
51
99
147
195
243
ggs gca tc3 gga gcs gg3 aaei gga gga gga ttg犯c肪t cta cag g33 291 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gin Glu
75 80 85
gag gag ate act tea tea agt agt aca aaa ate gac gtg ate gaa gac 339 Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie Asp Val lie Glu Asp 90 95 100 105
age age ate aac gac ttc ctg ttc cta atg gcc gtc agt ctg ggc aag 387 Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys
110 115 120
cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga tec acc etc teg 435 Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser
125 130 135
tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac acg cag tec gcg 483 T卬Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His Thr Gin Ser Ala
140 145 150
aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac aca tec egg cga 531 Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg
155 160 165
gtt cgc tgc teg teg gtc肌g tgc ggc gag ctg鄉tac gat ctg egg 579 Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg 170 175 180 185
etc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa gac age tgc acg tac age 627 Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser
190 195 200
gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac age gtg ggc aag atg gtg aca 675 Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr
205 210 215
gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc atg ttc ggg tgc 723 Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys
220 225 230
age atg gat gtc aag tac age gaa ttc gag gcc ggc ate ttt ggt ttc 771 Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly lie Phe Gly Phe
235 240 245
ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca ggg tac cct gat 819 Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala Gly Tyr Pro Asp 250 255 260 265
att ctg agt tac aag gca ttc age tac tgc ttg ccc act gac gag acc 867 lie Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr
270 275 280
aag ccc gga tac atg ate ctg gga卿tac gac cgt gcc gcc atg gat 915 Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp
285 290 295
ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg cca acc tac tea 963 Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg Pro Thr Tyr Ser300
ctg acg atg gag atg ctt
Leu Thr Met Glu Met Leu 315
tct tcg gag atg ate gtc
Ser Ser Glu Met lie Val
330 335
cct tec act ttt get etc
Pro Ser Thr Phe Ala Leu 350
tcg att Ser lie
tgc tac Cys Tyr
ccc ttc Pro Phe 395 ggc ggt Gly Gly 410
Pro His
ggg tat Gly Tyr 365 tta tcg Leu Ser 380
tec犯c Ser Asn
get gC3 Ala Ala
cgc ggt Arg Gly
C2LC
His
gag Glu
tgg Trp
etc Leu
ttg ILeu 430
ggg Gly
egg Arg
His
tec Ser
get Ala 415 tgc Cys
ate lie 320 gat Asp
ctt Leu
￡Lca Thr
gac Asp
gcc Ala 400 ttg Leu
3tg Met
305
gcc犯c Ala Asn
tec ggg Ser Gly
g￡ic犯g Asp Lys
tX￡L 3g￡L
Ser Arg 370 tat tct Tyr Ser 385
ttg cct Leu Pro
CC￡l ccc Pro Pro
acc ttt Thr Phe
ggg csg Gly Gin
gCC C￡lg
Ala Gin 340 3CC ate Thr lie 355
gcg cgc Ala Arg
ggt tgg Gly Trp
ctg ctg Leu Leu
3g3犯c Arg Asn 420 get C3g Ala Gin 435
cga tec Arg Ser
tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr 445 450 gac ate cag ggg ￡L3a c犯ttc ggc ttc a犯tat Asp lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr
460 465 tegtcgatta ttcctcatcc tatgatatat cttatagctt gtttgcccaa ataactgatc ggattggagt cttctcccgc gategtatea c犯gctagcg gtacttgatt tgggacctaa cagcttaatt tgggacctag tagctagctg agccactact tccgtcgttt gtttgtgtct cctgtgcttg tgctaasicct c犯cttaatt atttggtcgt atgtcctaat tgttgatc 〈210〉 2 〈211〉 21 〈212〉 PRT
〈213〉 水稻(0ryza sativa) <400> 2
Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys Gin 1 5 10
310 卿ttg Arg Leu 325
鄉acg Arg Thr
scg cag Thr Gin
caa g犯 Gin Glu
￡L￡LC ggC
Asn Gly 390 gag ate Glu lie 405
gtc ttc Val Phe
aat cct Asn Pro
ttc gga Phe Gly
gtg Val
tec Ser
Ala
tea Ser 375 acc Thr
ggc Gly
tac Tyr
get Ala
Thr 455 tgc Cys
tcg Thr Ser
ctg tgg Leu Trp 345 atg tcg Met Ser 360
tac ate Tyr lie
ate lie
ttc Phe
Asn
etc Leu 440
Thr
tga
acg Thr
gcc Ala
gat Asp 425 ￡igg Arg
ttc Phe
gcc get Als Ala 470
gegggtcgat t犯ttagctg gctacactac ccctagctgc ttcgttcaaa肌aaacttgg agatgtttac gtaccagcta atctcttg犯ccgttcgtgc
1011
1059
1107
1155
1203
1251
1299
1347
1395
1440
1500 1560 1620 1680 1740 1778
Glu Arg Lys Lys Glu 15 Gly lie Lys
<210〉 3 <211〉 450 <212> PRT <213> 水稻 ■〉 3 Ser Gly Ala 1
Phe Asp His
His Lys Lys 35
Ala Ser Ser 50
Asn Leu Gin 65
Val lie Glu
Ser Leu Gly
Ser Thr Leu 115
Thr Gin Ser
130 Thr Ser Arg 145
Tyr Asp Leu
Cys Thr Tyr
Lys Met Val 195
Met Phe Gly
210 lie Phe Gly 225
Gly Tyr Pro
Thr Asp Glu
Ala Ala Met 275
Pro Thr Tyr
Phe Ala 20
C0ryza sativs!)
Thr Ala Ala Asp Asp Glu 5
Ala Val Asn Ser Gin Gly 20 25 Cys Leu
Leu Glu 10
Ala lie
His
Thr
Glu
Asp
Lys 100 Ser
Ala
Arg
Arg
Ser 180 Thr
Cys
Phe
Asp
Thr 260 Asp
Ser
Gin
Gly
Glu
Ser
85
Pro
Trp
Lys
Val
Leu 165 Val
Asp
Ser
Gly
lie 245 Lys
Gly
Leu
Arg Pro 40
Ala
Glu
70
Ser
Pro
Val
Ala
Arg 150 Gin
Thr
Thr
Met
Ser 230 Leu
Pro
Gly
Thr
Ser
55
lie
lie
Val
Gin
Gly 135 Cys
Gin
Tyr
Leu
Asp 215 Ser
Ser
Gly
Tyr
Met
Gly
Thr
Asn
Val
Cys 120 Pro
Ser
Ala
Gly
Arg 200 Val
Ser
Tyr
Tyr
Thr 280 Glu
Ala
Ser
Asp
Asn 105 Gin
lie
Ser
Asn
Asn 185 lie
Lys
Phe
Lys
Met 265 Pro
Met
Trp
Gly
Ser
Phe
90
Leu
Pro
Phe
Val
Cys 170 Gly
Gly
Tyr
Ser
Ala 250 lie
Leu
Leu
Ser
Lys
Ser
75
Leu
Val
Cys
Asp
Lys 155 Met
Trp
Asp
Ser
Phe 235 Phe
Leu
Phe
lie
Cys
Gin
Val
Gly
60
Ser
Phe
Ala
Ala
Pro 140 Cys
Glu
Ala
Ser
Glu 220 Phe
Ser
Gly
Arg
Ala
Pro Ser Ser lie 15
Phe Pro Val Phe 30
Arg Ala Thr Gin 45
Gly
Thr
Leu
lie
Val 125 Gly
Gly
Lys
Tyr
Phe 205 Phe
Glu
Tyr
Arg
Ser 285 Asn
Gly Leu Asn Lys Met
Asp 110 His
Arg
Glu
Glu
Ser 190 Met
Glu
Gin
Cys
Tyr 270
lie
Gly
lie Asp 80
Ala Val 95
Thr Gly
Cys His
Ser Tyr
Leu Arg 160 Asp Ser 175
Val Gly
Asp Leu
Ala Gly
Leu Ala 240 Leu Pro 255
Asp Arg Asn Arg Gin Arg
290
Leu Val Thr Ser Ser Ser 305 310 Thr Ser Leu Trp Pro Ser 325
Gin Ala Met Ser Ser lie 340
Glu Ser Tyr lie Cys Tyr 355
Gly Thr lie Thr Pro Phe 370
lie Gly Phe Ala Gly Gly 385 390 Phe Tyr Asn Asp Pro His 405
Pro Ala Leu Arg Ser Gin 420
Gly Thr Thr Phe Asp lie 435
Ala Cys 450
〈210>4
<211〉1912
<212>腿
<213〉水稻(Oryza sativa)
<220>
<221〉gen6
<222>(l).. (1912)
<223>
<220〉
〈221>5'UTR
<222>(1577)., (1912)
<223>
<220>
〈221>3' UTR
<222>(l).. (157)
〈223>
<220〉
<221>CDS
<222>(158).. (1576)
<223>
<400>4
atxaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga 60
aagaa卿ag ggattaaatt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt犯c犯tgsct 120
gacttttaat ttgtttgcag ctagggtggg gatcgag atg gtg ate ttg gag cag 175
Met Val lie Leu Glu Gin 1 5
cca cag ctg etc ctt ctt ctt ctt ctt ctt gta gca get gca get gca 223 Pro Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala
10 15 20
acc ggc gcc aca gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tec tec ate 271 Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser lie
25 30 35
ttc gat cac get gtg aac tct c犯ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc 319 Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin Phe Pro Val Phe
40 45 50
cac aag aag cac caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag 367 His I>ys Lys His Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gin 55 60 65 70
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<223>
〈220〉
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〈223〉
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Ala Leu
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Glu His
Trp Ser 400 Leu Ala 415
Leu Cys Gly Asn Lys Gin
权利要求
1、分离克隆的水稻籼粳亚种广亲和基因S5，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1778位所示的核苷酸序列，SEQ ID NO2中第1-1912位所示的核苷酸序列和SEQ ID NO3中第1-1911位所示的核苷酸序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。
2、 合适启动子连接的权利要求l所述的核苷酸序列。
3、 权利要求1所述的基因S5在水稻改良中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻广亲和基因S5的分离克隆、功能验证及其在改良水稻中的应用。所述基因的DNA片段包含一个编码天冬氨酰蛋白酶的水稻广亲和基因。水稻籼粳亚种间具有比水稻品种间更强的杂种优势，但籼粳亚种间杂种的不育性却限制了对其杂种优势的利用。利用本发明克隆的广亲和基因，能够克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性，从而利用籼粳亚种间强大的杂种优势以进一步提高水稻的产量。
文档编号C12N15/29GK101200725SQ20071005355
公开日2008年6月18日 申请日期2007年10月15日 优先权日2007年10月15日
发明者丁寄花, 刘克德, 张启发, 欧阳亦聃, 陈炯炯 申请人:华中农业大学