专利名称：硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法
技术领域：
本发明涉及对硫酸盐还原菌这种非严格厌氧菌进行分离及提纯的一种新方法，本方法定名为平板喷雾分离法。此方法采用API固体培养基培养，主要用于提取硫酸盐还原菌纯菌种，并从多个纯菌种菌株中挑选出生物活性最强的菌株。此法也可推广到其它耐氧型、兼氧型和非严格厌氧型细菌纯菌种的提取，但不适合严格厌氧菌。
背景技术：
细菌纯菌种的分离及纯化是指将混杂在一起的不同种类的微生物分离开来以得到生产和研究所需要的单一菌种，这需要特殊的分离方法。微生物纯菌种的提取是微生物工业应用和研究的关键技术，广泛地应用于微生物防腐、污水处理、矿物提冶、食品工业、医药品生产等领域。传统上，细菌纯菌种的分离及纯化主要采用十倍稀释分离法、平板划线法、倒平板和平板涂布法、穿刺分离法、单细胞分离法和超微膜分离法等。但是这些方法往往涉及工艺精细、程序繁琐、尤其要求操作人员有相当高的、熟练的操作水平，给微生物纯菌种的提取造成很大的困难和不便。目前，针对硫酸盐还原菌分离和纯化的通用方法采用的是穿刺分离法即用注射器抽取杂菌菌液，将针头刺入固体培养基中一定深度，注射菌液，然后延原路拔出针头，然后加液体石蜡对培养基进行厌氧密封，固体培养基在厌氧环境中进行恒温培养，最终在沿针头的部位长出单个的纯培养菌落。这种方法操作难度大，往往需要控制好固体培养基中的琼脂含量、注射菌液数量，还要创造厌氧环境，且挑取单个菌落非常困难，提取成功率极低。此种方法是基于传统上对硫酸盐还原菌的生理特性的误解而产生的，早期通常认为硫酸盐还原菌是严格厌氧菌，但近期的文献表明，硫酸盐还原菌有较强的耐氧能力，能够在空气中进行正常的生命活动。
技术内容本发明的目的在于提供一种菌种提取准确、方法简便易行、成功率高的硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法。
本项发明的技术路线是在保证快速、准确、简便地获得硫酸样还原菌的单个纯培养菌落的前提下，采用平皿固体培养基作为细菌生长的载体，用带针头的注射器将菌液以雾状喷溅在培养基的表面，以获得单个的细菌附着在培养基表面，经恒温恒湿无菌环境下培养，获得有单个细菌繁殖的菌落，然后挑取单个菌落放入液体培养基中繁殖，最终获得大量的、生物活性良好的，单一硫酸盐还原菌的纯菌种。具体技术方按是一种硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法，是在有氧环境下提取和培养出硫酸盐还原菌纯菌种并以挑选出生命活性最强的纯化菌种作为二次分离及纯化的菌种，具体工艺步骤如下
a)将选用的硫酸盐还原菌专性液体培养基，在无菌环境中加热至即将沸腾时，加入适量琼脂后搅拌均匀，然后冷凝为固态；b)在无菌环境中，首先将装上针头的无菌注射器进行含菌处理后抽取一段空气，然后将含菌空气以雾状均匀喷射到固体培养基的表面，在恒温培养箱中培养出菌落，在其中挑取单个菌落，放入灭菌的液体培养基中培养出活性最好的硫酸还原菌纯化菌种；c)以硫酸还原菌纯化菌种为菌种，再按菌种的一次分离及纯化步骤重复进行一次分离及纯化，所得的液体培养基即是所要获得的硫酸还原菌的纯菌种。
所说的硫酸盐还原菌专性液体培养基按成分称量、配制、并调节PH值到中性略呈微碱性后，装入经灭菌处理的锥形瓶中加热；所说的冷凝过程是在无菌环境中，将含琼脂的培养基趁热加入到平皿中，加入量不超过平皿深度的1/3，然后冷却凝固为待用的固体培养基。
所说的装上针头的无菌注射器进行含菌处理是用无菌注射器并装上针头，从含有杂菌的硫酸还原菌菌种中抽取适量菌液，然后再将菌液注射回菌种瓶中，排空菌液，使注射器和针管被硫酸还原菌污染。
所说的恒温培养箱中温度约37℃。
是所说的灭菌的液体培养基为在培养基中加入灭菌的硫酸亚铁铵和抗坏血酸。
本发明提供方法直接对固体培养基表面进行菌液喷雾附着，直接在有氧环境中进行操作和培养，结果表明此方法菌种提取准确、方法简便易行、成功率极高。
图1采用平板喷雾分离法和传统的穿刺分离法获得的菌落的对比。
图2透射电镜下的硫酸盐还原菌的形貌。
具体实施例方式
下面结合实例进一步说明本发明的具体内容及其实施方式。
1.分离及纯化所需的设备和原材料设备及器皿洁净工作台、恒温培养箱、高温高压灭菌锅、电炉、加热用石棉垫、培养皿、接种针，玻璃棒，酒精灯，2ml注射器及针头。
材料美国石油协会(API)推荐的SRB专用培养基，琼脂粉，含杂菌的硫酸还原菌菌种。
2.分离和纯化的技术要点(1)API液体培养基的配制将API液体培养基按成分称量、配制、并调节PH值到中性略呈微碱性后，将API液体培养基装到一个锥形瓶中，然后利用电炉(上加石棉垫)加热，待到即将沸腾时，加入适量琼脂粉，用玻璃棒搅拌均匀，然后用棉塞塞好，包上牛皮纸后放入到高温高压灭菌锅中准备灭菌。
(2)玻璃器皿灭菌将培养皿、注射器和针头分别用牛皮纸包好放入到高温高压灭菌锅中准备灭菌。
(3)灭菌采用美国石油协会推荐的标准灭菌方法。
(4)API固体培养基的配制打开洁净工作台的紫外线灭菌灯将工作台灭菌一定时间，点燃酒精灯，将灭菌锅内的物品取出放入工作台中，趁热将琼脂培养基加入到平皿中，加入量不超过平皿深度的适当位置，然后冷却，培养基凝固后待用。
(5)纯菌种的分离和纯化操作在洁净工作台中进行，并点燃酒精灯a.取出注射器并装上针头，从活化后含有杂菌的硫酸还原菌菌种中抽取适量的菌液，然后再将菌液注射回菌种瓶中，排空菌液。其目的是使注射器和针管被硫酸还原菌污染。
b.用针管抽取一段空气，然后将针头对准平皿培养基的上方，针头距培养基表面一定的距离，然后推动针管，将含菌空气以雾状喷射倒固体培养基的表面。
c.反复重复步b，在固体培养基的其它表面上喷射，以获得个体特征明显的纯菌种菌落。
d.盖上培养皿皿盖，放入37℃恒温培养箱中培养，直至长出单个菌落。
(6)待长出单个菌落后，在洁净工作台中用无菌接种环分别挑取单个菌落，放入灭菌液体API培养基中，分别进行37℃恒温培养。
(7)挑选出生命活性最强的纯化菌种液体培养基最先完全变黑的即为生命活性最强的硫酸还原菌纯化菌种。
(8)然后以活性最强的硫酸还原菌纯化菌种为菌种，重复步骤(1)～(6)，再进行一次纯化，所得的液体培养基即是所要获得的硫酸还原菌的纯菌种。
实例1采用平板喷雾分离法，对含有杂菌的硫酸盐还原菌菌种进行分离及纯化。另外采用穿刺法进行对比(参阅图1)。结果表明用平板喷雾分离法这种新方法进行分离及纯化的菌落分散，菌落呈单个分布，容易识别，容易提取；而采用传统的穿刺分离法获得的菌落连成一体，很难挑选单个的纯培养菌落。小菌落个体较大，很难说明是由单个细菌繁殖而成的。因此使用新的方法的进行菌种的分离和纯化的准确率、效率和成功率远远高于传统的穿刺分离法。用新方法分离和纯化的硫酸盐还原菌纯菌种，经硫酸亚铁铵鉴别、H2S气体鉴别，普通染色法鉴定，革兰氏阴性菌鉴定，透射电镜下形貌鉴定(参阅图2)等多种方法综合鉴定，结果表明用新方法分离和纯化的菌种确系硫酸盐还原菌的纯菌种。
实例2采用平板喷雾分离法，对含有杂菌的干酪乳杆菌菌种进行分离及纯化，准确地获得了干酪乳杆菌的纯菌种。与平板划线法相比，使用平板喷雾分离法提取菌种的准确率、成功率及工作效率要优于后者。
实例3采用平板喷雾分离法，对含有杂菌的米根霉菌菌种进行分离及纯化，准确地获得了米根霉菌的纯菌种。与平板划线法相比，使用平板喷雾分离法提取菌种的准确率、成功率及工作效率要优于后者。
权利要求
1.一种硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法，其特征是在有氧环境下提取和培养出硫酸盐还原菌纯菌种并以挑选出生命活性最强的纯化菌种作为二次分离及纯化的菌种，具体工艺步骤如下a)将选用的硫酸盐还原菌专性液体培养基，在无菌环境中加热至即将沸腾时，加入适量琼脂后搅拌均匀，然后冷凝为固态；b)在无菌环境中，首先将装上针头的无菌注射器进行含菌处理后抽取一段空气，然后将含菌空气以雾状均匀喷射到固体培养基的表面，在恒温培养箱中培养出菌落，在其中挑取单个菌落，放入灭菌的液体培养基中培养出活性最好的硫酸还原菌纯化菌种；c)以硫酸还原菌纯化菌种为菌种，再按菌种的一次分离及纯化步骤重复进行一次分离及纯化，所得的液体培养基即是所要获得的硫酸还原菌的纯菌种。
2.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法，其特征是所说的硫酸盐还原菌专性液体培养基按成分称量、配制、并调节PH值到中性略呈微碱性后，装入经灭菌处理的锥形瓶中加热；所说的冷凝过程是在无菌环境中，将含琼脂的培养基趁热加入到平皿中，加入量不超过平皿深度的1/3，然后冷却凝固为待用的固体培养基。
3.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法，其特征是所说的装上针头的无菌注射器进行含菌处理是用无菌注射器并装上针头，从含有杂菌的硫酸还原菌菌种中抽取适量菌液，然后再将菌液注射回菌种瓶中，排空菌液，使注射器和针管被硫酸还原菌污染。
4.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法，其特征是所说的恒温培养箱中温度约37℃。
5.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法，其特征是所说的灭菌的液体培养基为在培养基中加入灭菌的硫酸亚铁铵和抗坏血酸。
全文摘要
硫酸盐还原菌纯菌种的分离及纯化新方法涉及对硫酸盐还原菌这种非严格厌氧菌进行分离及提纯的一种新方法，本方法适用于微生物防腐、污水处理、矿物提冶、食品工业、医药品生产等工业领域和实验研究领域。在保证快速、准确、简便地获得硫酸样还原菌的单个纯培养菌落的前提下，采用平皿固体培养基作为细菌生长的载体，用带针头的注射器将菌液以雾状喷溅在培养基的表面，以获得单个的细菌附着在培养基表面，经恒温恒湿无菌环境下培养，获得有单个细菌繁殖的菌落，然后挑取单个菌落放入液体培养基中繁殖，最终获得大量的、生物活性良好的，单一硫酸盐还原菌的纯菌种。本方法的分离及纯化的准确率、效率要高于传统的细菌分离及提纯的方法。
文档编号C12N1/02GK101050438SQ200710055389
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月9日 优先权日2007年3月9日
发明者方世杰, 刘耀辉, 王强, 蒋磊, 于思荣 申请人:吉林大学