专利名称：利用菇渣发酵绿色木霉的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明是一种生物菌剂的制备方法，属于农业应用微生物技术领域。
背景技术：
本发明专利是为解决目前化学农药的频繁应用，农药残留在蔬菜和土壤中不断积累，而应用绿色木霉对多种真菌土传病害具有明显的预防作用。利用有机添加物为载体大量繁殖木霉菌株，进一步巩固两者的协同作用，不仅补充土壤养分，增强抑菌效果，而且可以提高拮抗菌在土壤中的生存繁殖能力，减少农药在土壤中的残留。
木霉菌对土传病原菌的生物防治国内外已有大量报道，许多菌株田间生产防效并不理想，原因之一是直接引入客土的拮抗微生物不能很好地在土壤中定殖并成为优势种群。有机添加物的施入在某种程度上起到“接种”作用，有机物本身已带有大量微生物，其带入的活性有机碳源又是微生物增殖的主要原因，因此利用有机添加物培养拮抗菌，不仅可以巩固拮抗菌在土壤中的定殖，而且增强了抑菌效果。1991年Ophnob报道，把木霉制剂与有机肥同时施用，能使土壤微生物活性明显提高。1999年刘琼光报道利用拮抗细菌和土壤添加剂同时施入土壤对烟草青枯病的防治效果，显著好于两种单独施用的效果。1994年上海农科院植保所周新根报道利用由蚕豆粉、无机盐等制成的“MX”有机添加物，灭菌后分别培养三种拮抗菌株，1％的添加量对辣椒疫病、番茄立枯病、猝倒病具有很好的防效，显著高于单用。在灭菌土壤中培养4周后拮抗菌的种群密度比单独施用拮抗菌的处理高50-100倍，且拮抗菌存活时间较长。本研究拟采用一些土传病害的拮抗木霉菌为拮抗菌株，利用合成有机物为载体大量繁殖。进一步巩固两者的协同作用，不仅补充土壤养分，增强抑菌效果，而且可以激活土壤原有拮抗菌的作用。
菇渣是生产食用菌后的下脚料，其含有较高的蛋白质和其他营养成分，可以为微生物生长提供良好营养，木霉菌是食用菌生产过程中主要的污染菌种，适宜其生长。同时发酵的菇渣可以作为肥料，改良土壤。因此采用菇渣生产木霉菌不仅可以降低生产成本，而且可以有效处理废弃物，提高木霉菌对土传病害的防治效果。
发明内容
本发明提供一种利用菇渣生产木霉菌剂的制备方法。包括对多种土传病害具有较强的拮抗作用的绿色木霉菌。斜面菌种保存，平皿内活化培养，三角瓶液体发酵，种子罐混合发酵后，以菇渣、麦麸等吸附进行固体发酵，干燥后而制成本菌剂。
1.菌株 用于防治蔬菜土传病害，从土壤中分离筛选的绿色木霉菌株(Trichoderma viride，编号Tr9801)。
2.原料处理选择无霉变的菇渣晒干后粉碎成80目粉状备用。
3.液体发酵将斜面保存的菌种用PDA培养基活化，接种于500ml三角瓶内装液体培养基100ml，26℃，180r振荡培养，3～5d，为液体菌种。以10％(V/V)接种量加入种子发酵罐内发酵培养，发酵温度25～28℃，通风搅拌，发酵72小时。液体培养基为0.5～1％酵母粉，2～3％淀粉，1％豆浆，0.2～0.5％CaCO3，0.03～0.05％KH2PO4，0.01～0.02％MgSO4，PH为5.5～6.5。菌液导出时孢子含量107～108cfu/ml。
4.固体发酵高压灭菌后，向固体培养基内加入3～5倍重量的孢子悬浮液，于25～28℃，培养7～10天。固体培养基菇渣90.5％，麸皮5％，2％蔗糖，1％磷酸二氢钾，1％硫酸镁，0.4％碳酸钙，0.1％尿素。
5.培养好的物料在低于50℃的条件下风干，粉碎，包装。
本发明的木霉菌株对多种蔬菜的土传病害如猝倒病、立枯病及枯萎病等具有很好的防治效果，对植株生长具有明显的促进作用。利用菇渣为营养载体大量繁殖木霉菌株，进一步巩固两者的协同作用，不仅补充土壤养分，增强抑菌效果，而且可以提高木霉菌在土壤中的生存繁殖能力，且存活时间较长，减少农药在土壤中的残留。本发明的发酵工艺简单，易于控制，成本低廉。
具体实施例方式
原料处理选择无霉变的菇渣晒干后粉碎成80目粉状备用。
液体培养500ml三角瓶内装液体培养基100ml，121℃，20分钟。晾凉后，接种木霉孢子悬浮液10ml，26℃，180r振荡培养，3～5d，得到液体菌种。以10％(V/V)接种量加入种子发酵罐内发酵培养，发酵温度25～28℃，通风搅拌，发酵72小时，菌液导出时孢子含量107～108cfu/ml。液体培养基1L5～10克酵母粉，20～30克淀粉，10克豆浆，2～5克CaCO3，0.3～0.5克KH2PO4，0.1～0.2克MgSO4，PH为5.5～6.5。
固体发酵按一定比例配制培养基，灭菌121℃，30分钟，冷却后固体培养基放入发酵槽内加入3～5倍重量的液体孢子发酵液，搅拌均匀，于25～28℃，培养7～10天。固体培养基1kg菇渣905克，麸皮50克，20克蔗糖，10克磷酸二氢钾，10克硫酸镁，4克碳酸钙，1克尿素，含水量60％。
培养好的物料在低于50℃的条件下风干，粉碎，包装。其孢子量为107～108cfu/g。
权利要求
1.一种木霉菌剂的制备方法，利用菇渣生产木霉菌剂的液固两相法发酵工艺。其特征在于，该生产方法是以液固两相法结合，利用菇渣为生产原料进行固态发酵生产木霉菌。
2.权利要求1所述的木霉菌生产方法，其特征在于，木霉菌种为绿色木霉(Trichoderma viride，编号为Tr9801)。
3.权利要求1所述的木霉菌生产方法，其特征在于，原料处理，选择无霉变的菇渣晒干后粉碎成80目粉状备用。
4.权利要求1所述的木霉菌生产方法，其特征在于，液体发酵，液体培养基为0.5～1％酵母粉，2～3％淀粉，1％豆浆，0.2～0.5％CaCO3，0.03～0.05％KH2PO4，0.01～0.02％MgSO4，PH为5.5～6.5。先在500ml三角瓶内装液体培养基100ml，26℃，180r振荡培养，3～5d，为液体菌种。以10％(V/V)接种量加入种子发酵罐内发酵培养，发酵温度25～28℃，通风搅拌，发酵72小时。
5.权利要求1所述的木霉菌生产方法，其特征在于，固体发酵，固体培养基菇渣90.5％，麸皮5％，2％蔗糖，1％磷酸二氢钾，1％硫酸镁，0.4％碳酸钙，0.1％尿素。高压灭菌30～40分钟，物料冷却后接入加入3～5倍重量的权利要求4的发酵液，搅拌均匀，于25～28℃，培养7～10天。
6.培养好的物料在低于50℃的条件下风干，粉碎，包装。
全文摘要
本发明属于农业应用微生物技术领域。为解决目前化学农药的频繁应用，农药残留在蔬菜和土壤中不断积累，而应用生物制剂绿色木霉对多种真菌土传病害具有明显的预防作用，从而制定的一种产孢量大、发酵时间短的生产工艺。技术要点是利用菇渣为原料，液固两相法发酵生产菌剂。原料易得，成本低廉，工艺简单。生产的菌剂不仅预防土传病害，而且可以促进植物生长。广泛应用于连作重茬严重的保护地蔬菜生产引起的土传病害预防和防治，还可以作为蔬菜育苗的基质，培育壮苗。
文档编号C12R1/885GK101063088SQ20071005718
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者郝永娟, 王正祥, 王万立, 刘春艳, 王勇, 杨秀荣 申请人:天津市植物保护研究所