专利名称：：一种用微生物制备的粗酶液及其应用的制作方法
技术领域：
：-本发明涉及一种用微生物制备的粗酶液及其应用，属应用微生物
技术领域：
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背景技术：
：烟草是我国财政的重要支柱之一，随着我国正式加入WTO和签署WHO《烟草控制框架公约》，我国巻烟和烟叶市场的国际化程度逐步加深，《烟草控制框架公约》对烟草制品的限制愈加严格，中国烟草面临着新的形势与新的挑战。为此，国家烟草专卖局制定了《中国巻烟科技发展纲要》，明确提出中国巻烟发展的方向是以市场为导向，大力发展中式巻烟。而发展中式巻烟的关键技术就是要在保持高香气的前提下"降焦减害"，开发"低焦油、低危害、高香气"的中式巻烟品牌。因此，降低烟草中烟碱等有害成分的含量，是促进巻烟工业健康发展的关键技术之一。烟碱是烟草生物碱中的主要成分，在烟草中，烟碱大部分是以有机酸(如柠檬酸和苹果酸)盐的状态存在，也有少量的以自由状态存在。烟碱进入人体内，90%被肺部吸收，进入血液后6s即可到达大脑。烟碱对人体最显著的作用是对交感神经产生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制。烟碱的作用除了增加烟味和感受刺激外，主要还在于它所产生的生理强度，通常称为"劲头"。一般来讲，烟碱含量高的烟叶，烟气劲头大，反之则小。因此，烟气中含有一定量的烟碱是必要的，但烟碱的含量也不能过高，否则不但会增加烟气的刺激性，影响巻烟吸味，而且从安全性的角度来讲也是一个非常不利的因素。我国部分烟区的烟叶外观质量己接近国际水平，但就其内在质量而言还有一定差距，其中一个较普遍且较突出的问题就是烟碱含量偏高。目前，我国烤烟烟碱的平均含量为3%4%，白肋烟平均高达6%，而美国烤烟的烟碱含量在1.5%3.5%之间；一般优质白肋烟的烟碱含量在1.5%4.0°/。之间，以3.0%为佳，美国白肋烟的烟碱含量为2.9%左右。国内巻烟企业目前贮存的上部烟叶较多，一般因其烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中，不仅占用了大量的仓储空间，而且也造成了大量的浪费。这个何题已引起有关方面的重视，如何降低这些烟叶中的烟碱含量是各巻烟企业所面临的一个现实问题。同时由于烟草的连续栽培和大量废弃烟叶的存在使土壤中的烟碱含量大大提高，对土壤环境和地下水质造成了较大的影响。关于用多种微生物能够降解烟碱(尼古丁)已有报道。但经文献检索，未发现与本
发明内容相同文献的公开报道。
发明内容本发明的目的在于通过对一株能够降解烟草中烟碱(尼古丁)含量的微生物假单孢菌nic22(i^Wo膨"msp.nic22)的研究，提供一种降低烟草中烟碱含量的方法。本发明从烟草栽培土壤中分离了一株具有降解烟碱能力的细菌nic22,对其进行了形态学、生理生化性质和16SrRNA分析，鉴定结果表明该细菌属于假单孢菌属，该菌株命名为假单孢菌(尸wwc/o/^"msp.)。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址北京市海淀区中关村北一条13号、中国科学院微生物研究所；保藏日期2007年4月12R;保藏号为CGMCCNo.1998。假单孢菌nic22(i^Wwwwwsp.nic22)的主要形态特征和生理生化性质为Nic22菌体呈短杆状，两端钝圆，无芽孢。革兰氏染色阴性，无荚膜，兼性厌氧。利用硝酸盐、脲和铵盐。Nic22菌株能产生接触酶、氧化酶，不能液化吲哚，不产生硫化氢。甲基红(MR)实验和乙酰甲基甲醇(VP)实验均为阴性。Nic22菌株可利用蔗糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖和甘露糖，不能利用纤维素，果胶，在以葡萄糖、烟碱或甘露糖为唯一碳源的固体培养基中生长旺盛，菌落扁平，乳白色，边缘齐整。在以烟碱为唯一碳氮源的培养基中，Nic22产色素，培养2d后，菌落由绿变红棕色。假单孢菌nic22(i^Wowo"msp.nic22)的分子鉴定特征为利用通用引物16F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)禾口1500R(5-GGTTACCTTGTTACGACT-3)，以细菌nic22的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的菌株Px6-4的16SrRNA序列。nic22菌株的16srRNA核苷酸序列全长1498bp，该序列己经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为EF541115。本发明按常规方法制备。即将假单孢菌nic22(i^w^ww"asp.nic22)扩大发酵培养后得到。本发明的粗酶液作为降低烟草中烟碱含量的应用。本发明具有可调整烟叶原料的烟碱含量，提高烟叶可用性，及可分解烟尘中的烟碱，减少其对环境的污染等优点。具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。本发明是这样实现的假单孢菌nic22(PseMrf<ww"assp.nic22)的培养方法1.试管斜面培养采用Luria-Bert旭i(LB)培养基，配方为1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物，1.8-2%琼脂。121。C灭菌25分钟，摆成斜面。接种尸wwcfo附o"氾sp.nic22，37'C培养18-24小时，获得试管种。2.液体扩大培养1)种子培养(LB培养基)，配方为1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物。121。C灭菌25分钟。接种i^wcfowo"wsp.nic22，30。C培养18-24小时，获得液体菌种。2)发酵培养基1mL烟叶水提液，1gKH2P04,0.5gMgS04,1mLMnSO4(0.1%),3mLFeS04(0.1%),3mLKC1(1%),加水至1000mL,pH67。培养基初始pH7.0，接种量3-5%，转速180rpm，温度3(TC。在此发酵条件下发酵培养48小时。2.假单孢菌nic22(/^"rfwMO"flssp.nic22)降烟碱粗酶液的制备利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)进行悬浮，8000rpm离心15min收集菌体，重复两次，菌体细胞最后用50ml的缓冲液进行悬浮。菌体细胞悬浮液体用超声波进行破碎处理，8000rpm离心15min，除去破碎的菌体细胞，上清液(粗酶液)-201:保存备用。3.假单孢菌nic22(/^"(to/MO"flssp.nic22)降烟碱粗酶液的降烟碱实验分别称取50g上部烟叶玉溪B3F烟丝，按照一定的添加量(分别为烟丝质量的2%、5%、10%)将粗酶液均匀喷加到烟丝上，控制烟丝相对湿度为20%，再置于恒温恒湿箱3(TC保存2天。以未经粗酶液处理的烟丝为对照，与三组经不同添加量粗酶液处理的烟丝进行对比评吸。同时，采用烟草自动化学分析仪测定对照烟丝和处理烟丝中的烟碱含量，每样做三次平行，取均值，分析结果见表l。表1:i^e^tomo"^sp.nic22粗酶液降解烟碱的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1、一种用微生物制备的粗酶液，由生产菌株及辅料经液体扩大培养、液体发酵培养后得到，其特征在于该菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)，于2007年4月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1998。2、权利要求1所述用微生物制备的粗酶液的应用，其特征在于该粗酶液作为降低烟草中烟碱含量的应用。全文摘要本发明涉及一种用微生物制备的粗酶液及其应用，属应用微生物
技术领域：
。本发明由生产菌株及辅料经液体扩大培养、液体发酵培养后得到。生产菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)，于2007年4月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1998。本发明的用微生物制备的粗酶液作为降低烟草中烟碱含量的应用。本发明具有可调整烟叶原料的烟碱含量，提高烟叶可用性，及可分解烟尘中的烟碱，减少其对环境的污染等优点。文档编号C12N1/20GK101177669SQ20071006591公开日2008年5月14日申请日期2007年5月29日优先权日2007年5月29日发明者张克勤,李雪梅,杨伟租,杨金奎,陈春梅申请人:云南烟草科学研究院