专利名称：鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法鉴定道地浙玄参的技术领域，具体地说， 是涉及一种鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。
背景技术：
玄参(^brap/m/aharaV^poem^/feww/.)最早"i己载于《神农本草经》，又名元 参，浙玄参，水萝卜，八秽麻等(中国植物志六十七巻第二分册，1979)，是著 名中药材"浙八味"之一，根药用，有滋阴降火，消肿解毒的功效；现也运用 于化妆品生产，作为植物润滑剂、防冻霜、防皱霜等。
玄参是我国特有种，分布较广，很多地区都有栽培，其中浙江种源的玄参根 粗肥大、产量高、品质佳。但是，中药材种植上存在品种混乱问题，原材料市 场上存在品质优劣问题。仅仅依靠传统的形态分析已不能进行品种的科学鉴定 和种源的遗传分析。目前还没有一种可靠有效的方法可以将品质较好的浙江种 源的玄参与其他地区的玄参区分开来，解决药材地道性问题。
近年来，随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展和 打入国际市场的瓶颈。药用植物或植物药的发展离不开标准化生产，即目前大 力推行的GAP(Goodagriculturing Practice,中药材生产质量管理规范)工作的核 心。而种(品)质的标准及科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提。 迄今为止，国际上有关玄参植物化学、药用价值等方面的研究已有不少报导， (戴金秋等，1994;邹节明等，2005;谢丽华等，2000;俞静静等，2006.)但是 尚未见有关玄参药材道地性DNA快速鉴定的技术的研究报导(Cao H.， Liu YP., 1998)。因此，有必要在DNA分子标记水平采用新方法新技术快速鉴定浙江种 源的玄参，解决中草药种植上品种混乱和原材料市场上品质优劣等问题。
(Elizabeth et al" 2003; Elizabeth, A.S. ， 2003 ) 参考文献
《中国植物志》1979，第六十七巻，第二分册，科学出版社。 戴金秋等，1994.浙江产玄参的化学成分。现代应用药学，11 (4): 16-17. 邹节明等，2005.苦玄参HPLC指纹图谱研究.中国药学杂志09期. 谢丽华等.，2000.中药玄参薄层色谱鉴别法的建立.中国中药杂志，25(11): 654-656.
俞静静等，2006.玄参有效部位的药理研究进展.Chinese Journal of the
Practical Chinese with Modern
Medicine 2006 VOL. (19) NO. 15. Cao H. ， Liu Y. P. ， 1998. Applications of molecular markers in the detection
of herbal medicine. Chin. Pharm. J. 33(5) : 269-273.
Fu， R.Z. et al. ， 2000. RAPD differentiation of five medicinal Dysosma
species. Chin. Pharm. J. 9(2)， 57-60. Braunner et al 1992 rDNA and RAPD variation in the rare plant family
Lactoridaceae. Amer J. Bot. 79:1436-1439......
Elizabeth et al. , 2003. Development of species—specific SCAR markers in
Bentgrass. Crop Sci. 43:345 - 349. Bandana, D. ， Mahipal, S. ， 2003. Molecular detection of cashew husk
(Anacardium occidentale) adulteration in market samples of dry tea
(Camellia sinensis). Planta Med. 69:882—884. Elizabeth, A. S. ， Michael, D. C. ， Geunhwa, J. ， 2003. Development of
species-specific SCAR markers in Bentgrass. Crop Sci, 43:345 - 349.
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探 针和方法。
用于鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列是该序列来源于ISSR通用引物 UBC874扩增所得的浙江玄参特异性核苷酸序列，具体序列为
actatcatcgtctttgtccatcccatcatcctgtcctccttcttcttttctcttttggagggcaagct tccacttcttaaaccacatgattctttgacgggttttcattatatttgcaagatctctcctaccttga tgtttctctttctccgaaaaataacggaaaaaaactcggggactcccaactcaacaaacaceictattc aaatcagctggacaattctcattgtaaattgtggtatccaattcatgaatgtcgggtaaaacaatgtc cggaattggtatattcaactcatccaacatctcaBctgatgggacttcacattcaaaaccatcaatct cagtgtcgctcacagaattaaccaactccatgaaattttcctaattttctttggcttttccttgtcct tttccttgtcttttgatgttggcgtcaaagaccaatcaaagggctagttaatagaaattgtttatgca aataacttacatacataacttaatagaaatttgcactcttaaagagttacgcgttaaatgtaattgaa acaaaatttgtatttactcatcaagttaaaaagggctctatELteLatttcatgctcagcaacaaagaac aagctgaaaaactgaacaatagtttcaagttgagLatgagttacttagacaceiaatgagaaaataBaag agagctcacactttctactcacattattactgccttattagaaatagcagctaagcaaaagttgaagc ttttaacagaacaacaacaatgcaacatagaacaaacttcggttaatgatagatcaatatacacacat atataaactgaatacacaaattagaaaattgatagtttttattgcaagaaattgctccaaacccttga taagtaattttataatgctcgaactggttacaaattgtatatacatccatcaatttaacacattaata caaaatgtgtcatttcttaacacatatttcatgtgtaaattacaacatttaatactcggctatctttc cat gattttgtcgatgcttctaatttcgaacaactatgtttccttacttttgaagaacaggagaacta gctataactccacagacttttctaaagtaatagaaagatagatacactactaccaagttcaaatgttt caaagcatgaaatatttgttcacgctaggacaatcacctgaaatctttcgatgacggtgaggcggcga tgggcggtgggcggcgtgacttgtgcgcgctgagggagggagggagg。
浙江种源的玄参专一性核酸分子探针是该核酸分子探针来源于权利要求1 所述核苷酸序列中的1段或2段22个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补 序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10%的序 列。
核苷酸序歹ij为cc874u : 5'-ctatcatcgtctttgtccatcc-3'或 cc874d : 5'-tgctttgaaacatttgaacttg画3'，或者为cc874u禾卩cc874d。
鉴定浙江种源的玄参的方法是采用PCR方法，以权利要求2或3所述的核 酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。 所说的核酸分子探针为权利要求3所述的cc874u和cc874d。 本发明具有的有益效果
1) 样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。
2) 准确、灵敏度高，cc874u/cc874d为浙江种源玄参的专一性分子探针，若 为其他种源，为阴性反应。
图1是釆用ISSR引物UBC874进行PCR扩增的电泳图(红色框内的条带 是浙江种源的玄参特有的条带，分子量为1300bp左右)；
图2是采用玄参浙江种源专一性核酸分子探针cc874u和cc874d对各地玄参 进行检测的PCR扩增电泳图3是采用玄参浙江种源专一性核酸分子探针cc874u和cc874d对各地玄参 进行检测的PCR扩增电泳图中YC:浙江磐安窈川种源的玄参，RL:浙江磐安仁川种源的玄参，GMC: 浙江磐安光明村种源的玄参，XJ:浙江仙居种源的玄参，PA:浙江磐安尚湖种
源的玄参，HB:湖北种源的玄参，SX:陕西种源的玄参，SC:种植在四川广源 地区的玄参(引种自浙江)，M:分子量。
具体实施方法
技术领域：
本发明可以从遗传本质上客观准确地鉴定浙江产的玄参。具体包括1提 供用于玄参浙江种源鉴定的DNA片段；2提供来源于上述DNA片段的浙江种 源玄参专一性核酸分子探针；3提供利用上述核酸分子探针鉴定浙江种源的玄
参的方法。
在釆用ISSR分子标记研究各地产的玄参的遗传多样性时发现，ISSR通用 引物UBC874扩增的带型中，浙江产的玄参有特异性条带，能将其与其他地区 的玄参区别开。因此，可根据此特异性条带合成专一性的核酸分子探针，建立 快速、准确鉴定浙江种源玄参的分子生物学方法，用于玄参药材道地性的检测。
本发明提供的用于鉴别浙江种源玄参的核苷酸序列来源于采用ISSR通用引 物UBC874扩增所得的浙江玄参的特异性序列，该序列的结构特征如序列表中 的序列1 (<210〉1)所示。
该序列(<210>1)可通过如实施例1所述的方法得到；或者按已知的该序 列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。
本发明的浙江种源玄参专一性核酸分子探针是以上述浙江玄参特异性核苷 酸序列为基础，利用Primer Primer 5.0 (Vinay Singh, 1998)软件设计得出。该分 子探针为浙江玄参特异性核苷酸序列中的1段或2段22个核苷酸组成的寡核苷 酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列再经修饰、变化，且其核苷 酸变化量不超过总核苷酸量的10%的序列。。
本发明的上述浙江玄参专一性核酸分子探针为序列表中<210>2和<210>3 所示的序列(分别简称为cc874u和cc874d)。
本发明的上述浙江玄参专一性核酸分子探针，可按照预先根据浙江玄参特 异性核苷酸序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可 以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。
本发明的上述浙江玄参专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与浙 江种源的玄参专一性反应，但不与其他种源的玄参的DNA发生反应。所以，利 用该核酸分子探针，通过PCR方法可以快速、准确地鉴别浙江种源的玄参。
本发明所提供的玄参浙江种源的鉴定方法，可采用PCR方法以前面所述 的本发明的核酸分子探针(优选为cc874u和cc874d)为PCR引物，进行PCR 反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行按照经过优化的PCR体系 逐一将样品加入PCR管中，放入PCR仪器，采用经过优化的PCR程序进行PCR 扩增。采用该PCR方法可快速、准确地检测鉴定玄参的浙江种源，而且样品用
由于本发明所提供的核酸分子探针为浙江种源的玄参专一性探针，因此， 在样品种源未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列， 鉴定出其是否为浙江种源，为玄参药材道地性的鉴定提供了客观、快速、准确 的方法，解决了药材巿场上玄参种源混杂的问题。
序列表中的<210>1序列是浙江种源的玄参特异性核苷酸序列，其中带下划 线的部分(70-92bp和1210-1232bp)分别为本发明的浙江种源玄参专一性寡核 苷酸分子探针cc874u和cc874d。
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明 实施例1:浙江种源玄参特异性核苷酸序列的制备
1基因组DNA的提取
采用改良CTAB法(Doyle, 1991)提取叶片基因组DNA。步骤如下
1) 取约0.05克的硅胶干燥叶片，加入少量PVP粉，置入磨样管中，用 BIO101磨样机研磨，SPEED 4.0, TIME 20s 。
2) 迅速加入65。C预热的2XCTAB提取缓冲液(含2。/。b-巯基乙醇)800 — 1000ul， 摇均后转入5ml离心管中，再用800—1000ul2XCTAB清洗磨样管， 转入同一个5ml管中，65。 C水浴30分钟。
3) 冷却至室温，加等体积的氯仿异戊醇(24: 1)，混合均匀(缓慢颠 倒)15-30分钟，室温10000rpm离心10 — 15分钟。
4) 吸取上层水相，加入1/10体积的10%CTAB，轻轻混匀，再加入等体 积的氯仿异戊醇(24:1)抽提，重复步骤(3)。
5) 吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积-2(TC预 冷的异丙醇，轻轻摇匀，于放置2小时或过夜。
6) 10000rpm离心10min，使DNA附着离心管管底，弃水相。
7) 加75%乙醇浸洗2-3次，用无水乙醇清洗一次，去乙醇，风干。
8) 用适量O.lxTE溶解DNA沉淀，-20 1;保存备用。 2 ISSR—PCR
用ISSR通用引物UBC874进行PCR扩增，扩增体系如下表所示10XBuffer (Mg2+ free)2. 5W (IX Buffer )
MgCl2 (25mM)(2. 0 mM )
d,s (10 mM)0. 5H1 (0. 2 mM)
引物UBC874 (5赠214 (0. 4 MM )
Taq酶(5U / W )0. 25W (1, 2 U)
模板DNA ( 30 ng / (4 )2. 5H1 (60ng)
ddH2015. 7614
总体积25^1
PCR程序为
94。C5 min
94°C30 sec
59。C45 sec
72。C1.5 min
72°C10 min
4°C保温
45 cycles
PCR产物电泳结果见图1，红色框内的条带(分子量为1300bp左右)是采 用ISSR引物UBC874进行PCR扩增时寻找到的浙江种源的玄参特有的条带。 如图所示，浙江种源的玄参(包括种植于四川的玄参)在分子量1300bp左右均 有条带出现，而其他种源的玄参在分子量1300bp左右没有条带出现。因此，此 条带即为浙江种源玄参的特有条带。 3序列测定
PCR结束后，PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，对只在浙江群体中出现的 特异性ISSR片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(Sangon， Shanghai, China) 回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体(Sangcm， Shanghai, China)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中。目的片段采用引物M13+/-于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中<210>1序列所示的核苷 酸组成与排列。
实施例2:玄参浙江种源专一性核酸分子探针cc874u和cc874d的制备
在获得浙江玄参特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Primer 5.0 (Vinay Singh, 1998)软件设计，得出cc874u和cc874d (分别为序列表中<400>1所示的 70-92bp和1210-1232bp)的核苷酸组成与排列是用于鉴定浙江种源的玄参的良
好寡核苷酸片段。根据cc874u和cc874d的核苷酸组成的排列(序列表中<210>2 和<210>3序列所示的核苷酸组成与排列)，在DNA自动合成仪上合成得到。 实施例3:玄参浙江种源的鉴定(常规PCR方法)
1 、 DNA的提取采用改良CTAB法提取玄参DNA
2 、 PCR反应体系为
10XBuffer (Mg2+ free)2. 541 (IX Buffer )
MgCl2 (25mM)21^1 (2. 0 mM )
dNTPs (10 mM)0. 514 (0. 2 mM)
cc874u(5140(0. 4 MM )
cc874d(5MM)(0. 4 MM )
T叫酶(5U / Pi )0.25H1 (1.2 U)
模板DNA ( 30 ng / Ml )2. 5W (60ng)
ddH2015. 76t4
总体积25ri
3、 PCR操作取2个0.5毫升PCR管，按照步骤2分别加入22.5微升PCR 混合液，然后一管加入DNA2.5微升，另一管加入2.5微升PCR混合液(对照)， 放于PCR仪卜.，按下列程序进行PCR反应 940C
94。C 59。C 72。C 72°C
5 mm 30 sec 45 sec 1.5 min 10 min
45 cycles
PCR扩增结果用含有0.1% EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果见 图2和图3，如图所示，浙江种源的玄参(包括种植于四川的玄参)在分子量 1300bp左右均有条带出现，而其他种源的玄参在分子量1300bp左右没有条带出 现。表明采用cc874u和cc874d进行PCR检测，若样品中含有浙江种源的玄 参则为阳性反应，反之则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了 cc874u和cc874d 引物的专一性。
权利要求
1、一种用于鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列，其特征是该序列来源于ISSR通用引物UBC874扩增所得的浙江玄参特异性核苷酸序列，具体序列为tccctccctccctcccttaaatccgaatccacaattacactcctactactctcaacaccctccaaatcactatcatcgtctttgtccatcccatcatcctgtcctccttcttcttttctcttttggagggcaagcttccacttcttaaaccacatgattctttgacgggttttcattatatttgcaagatctctcctaccttgatgtttctctttctccgaaaaataacggaaaaaaactcggggactcccaactcaacaaacacactattcaaatcagctggacaattctcattgtaaattgtggtatccaattcatgaatgtcgggtaaaacaatgtccggaattggtatattcaactcatccaacatctcaactgatgggacttcacattcaaaaccatcaatctcagtgtcgctcacagaattaaccaactccatgaaattttcctaattttctttggcttttccttgtccttttccttgtcttttgatgttggcgtcaaagaccaatcaaagggctagttaatagaaattgtttatgcaaataacttacatacataacttaatagaaatttgcactcttaaagagttacgcgttaaatgtaattgaaacaaaatttgtatttactcatcaagttaaaaagggctctatataatttcatgctcagcaacaaagaacaagctgaaaaactgaacaatagtttcaagttgaaatgagttacttagacacaaatgagaaaataaaagagagctcacactttctactcacattattactgccttattagaaatagcagctaagcaaaagttgaagcttttaacagaacaacaacaatgcaacatagaacaaacttcggttaatgatagatcaatatacacacatatataaactgaatacacaaattagaaaattgatagtttttattgcaagaaattgctccaaacccttgataagtaattttataatgctcgaactggttacaaattgtatatacatccatcaatttaacacattaatacaaaatgtgtcatttcttaacacatatttcatgtgtaaattacaacatttaatactcggctatctttccatgattttgtcgatgcttctaatttcgaacaactatgtttccttacttttgaagaacaggagaactagctataactccacagacttttctaaagtaatagaaagatagatacactactaccaagttcaaatgtttcaaagcatgaaatatttgttcacgctaggacaatcacctgaaatctttcgatgacggtgaggcggcgatgggcggtgggcggcgtgacttgtgcgcgctgagggagggagggagg。
2、 一种以权利要求1的核苷酸序列为基础而设计的浙江种源的玄参专一性 核酸分子探针，其特征是该核酸分子探针来源于权利要求1所述核苷酸序列中 的1段或2段22个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述 这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10%的序列。
3、 按照权利要求2所述的核酸分子探针，其特征是其核苷酸序列为:cc874u: 5'-ctatcatcgtctttgtccatcc-3'或cc874d: 5'誦tgctttgaaacatttgaacttg-3'，或者为cc874u 和cc874d。
4、 一种用权利要求2或3所述的核酸分子探针鉴定浙江种源的玄参的方法， 其特征是采用PCR方法，以权利要求2或3所述的核酸分子探针为PCR引物， 进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。
5、 按照权利要求4所述的方法，其特征是所说的核酸分子探针为权利要求 3所述的cc874u和cc874d。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。属于利用分子生物学方法鉴定玄参药材道地性的技术领域。本发明提供了浙江种源的玄参(Srophularia ningpoensis)特异性核苷酸序列及来源于该序列的核酸分子探针，以及利用该探针鉴别玄参浙江种源的方法。本发明具有的有益效果1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。2)准确、灵敏度高，cc874u/cc874d为浙江种源玄参的专一性分子探针，若为其他种源，为阴性反应。
文档编号C12N15/11GK101096708SQ20071006988
公开日2008年1月2日 申请日期2007年7月3日 优先权日2007年7月3日
发明者傅承新, 潘兰兰, 赵云鹏, 川 陈, 陈炳龙 申请人:浙江大学