专利名称：以云母为衬底的dna样品制备方法
技术领域：
本发明属于显微技术，具体涉及原子力显微镜(Atomic Force Microscopy, 简称AFM)观测DNA所用样品的制备方法。
背景技术：
1982年，宾尼(Binnig)等人发明了扫描探针显微镜(Scanning Probe Microsc叩y， SPM)，它是一类可以从原子水平到纳米尺寸观察物质结构的三维成 像工具，是一种新型的显微技术。1986年宾尼(Binnig)与魁特(Calvin F. Quate) 和盖博(Christoph Gerber)合作推出了原子力显微镜(Atomic Force Microscopy: 简称AFM)。 AFM在观测生物样品方面有着独特的优势，例如可以在近似生理环 境下直接观测生物样品；在扫描样品过程中将针尖对样品的作用力控制在 10—9-10—12N，使针尖对样品的损伤降低到非常低的水平；AFM样品制备突破了导电 性的限制，与电子显微镜相比制样过程相对简单。因此，AFM出现以后在生物研 究中迅速得到了广泛应用。在各类AFM应用中，最为关键的一步无疑是DNA样品的制备，制样的好坏将 决定整个实验的成败。现在，国内外各个实验室的DNA样品制备方法各种各样， 无论是衬底的选择，还是DNA样品的浓度，以及制样的细节等都各不相同。国内 外应用比较广泛的主要有两大类DNA制样方法 一是对云母表面进行修饰，所用 的试剂有3—氨丙基三乙氧基(简称APS)，戊二醛，亚精胺以及用阳离子进行预 处理等；二是在DNA水溶液中加入阳离子，但是各家所使用的阳离子种类及浓度 都不相同。在第二种方法中，阳离子和DNA的浓度是决定制样成败的关键，比如， 阳离子浓度太大，容易使DNA分子相互结合在一起而不能均匀分散在云母片上； DNA的数量太少，对于要做大量统计的实验显然不利；DNA太多以至于不同分子 之间有重叠，对长度的测量也不利。下面将针对现有制膜技术的缺陷，提供一种适于对质粒DNA及其碎片进行 长度测量并进行大量统计分析的要求的制样方法。本发明所提供的AFM的DNA样品制备方法，由如下步骤组成① 用蒸馏水和Mgcl2溶液将原始DNA样品稀释成DNA溶液；② 在涡旋震荡器上震荡2-3分钟，使得样品在溶液中分散均匀；③ 取4-5pl的样品滴于新解理的云母上，沉积5-10分钟；④ 用四次蒸馏水冲洗7-12次，每次水的体积大约在120-160 pl左右；⑤ 放置在空气中大约6-7小时后再进行观测。其关键技术在于步骤1中，DNA浓度为1-3 ng/pl， Mg"浓度为1-4 mM。 为了保证整个操作过程中不引入杂质，所用的蒸馏水为四次蒸馏水。 使用本发明提供的方法所制出的样品，经AFM成像后，不但能够在较高的图像分辨情况下真实地显现DNA的形态，而且DNA及碎片的数量也较为适中，适合于进行DNA及其碎片长度的测量并做统计分析。实施例下面将用具体的实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。 实施例l实验设备与材料上海爱建纳米公司生产的AJ-III型原子力显微镜，在室温下以Tapping mode在空气中成像，相对湿度为33%—39%，所有图像采集的扫 描速度为1.5Hz，像素为256x256;针尖选用俄罗斯MikroMasch公司的型号为 NSC11的硅针，共振频率为315KHz，力常数为48N/m;云母为中国科学院上海原 子核研究所提供；PUC19DNA购于大连宝生物工程有限公司，长度为2686bp，含 有70%以上的共价闭环。DNA样品制备流程如下 ①用四次蒸馏水和Mgcl2溶液将原始DNA样品稀释成DNA浓度为lng/^l, Mg"浓 度为lmM的溶液；參在涡旋震荡器上震荡2-3分钟，使得样品在溶液中分散均匀； §取4-5^1的样品滴于新解理的云母上，沉积5-10分钟； 纖用四次蒸馏水冲洗7-12次，每次水的体积大约在120-160 nl左右效果最好;⑤放置在空气中大约6-7小时以上再进行观测。本实施例所制出的样品供AFM成像，图像中的DNA分子无论在形态还是数 量上都非常合适，分散也比较均匀，适合进行长度测量和大量统计分析的研究。实施例2本实施例所用的实验设备和材料如实施例1，操作步骤也与实施例相同，其 区别在于步骤1中DNA浓度为3 ngAil， Mg"浓度为4 mM。实施例3本实施例所用的实验设备和材料如实施例l，操作步骤也与实施例相同，其 区别在于步骤1中DNA浓度为2 ng/Vl， Mg"浓度为3 mM。
权利要求
1. 一种AFM的质粒DNA样品制备方法，由如下步骤组成①用蒸馏水和Mgcl2溶液将原始DNA样品稀释成DNA溶液；②在涡旋震荡器上震荡2-3分钟，使得样品在溶液中分散均匀；③取4-5μl的样品滴于新解理的云母上，沉积5-10分钟；④用四次蒸馏水冲洗7-12次，每次水的体积大约在120-160μl左右；⑤放置在空气中大约6-7小时后再进行观测；其特征在于步骤1中，DNA浓度为1-3ng/μl，Mg2+浓度为1-4mM。
2. 根据权利要求1所述的DNA样品制备方法，其特征在于所用的蒸馏水 为四次蒸馏水。
3. 根据权利要求1所述的DNA样品制备方法，其特征在于所针对的样品 为质粒DNA。
全文摘要
本发明公开了一种AFM的质粒DNA样品制备方法，该方法是用蒸馏水和MgCl<sub>2</sub>溶液将原始DNA样品稀释成DNA浓度为1-3ng/μl、Mg<sup>2+</sup>浓度为1-4mM的DNA溶液；在涡旋震荡器上震荡2-3分钟，使得样品在溶液中分散均匀；取4-5μl的样品滴于新解理的云母上，沉积5-10分钟；用四次蒸馏水冲洗7-12次，每次水的体积大约在120-160μl左右；放置在空气中大约6-7小时后再进行观测。使用本发明提供的方法所制出的样品中，质粒DNA分子无论在形态还是数量上都非常合适，分散也比较均匀，适合进行长度测量和大量统计分析研究。
文档编号C12Q1/68GK101265496SQ20071008700
公开日2008年9月17日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者倪嵋楠, 孔福全, 蔡明辉, 丽 隋 申请人:中国原子能科学研究院