新型肽生成酶基因的制作方法

专利名称：新型肽生成酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及不必通过复杂的合成方法即可容易地、高产率地和廉价地生成肽的新型酶。更具体地，本发明涉及催化由羧基成分和胺成分的肽生成反应的新型酶，产生该酶的微生物，以及采用该酶或微生物生产二肽的方法。
背景技术：
肽被用于药物、食品领域和多种其它领域中。例如，由于L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定性和水溶性高于L-谷氨酰胺，故其被广泛地用作输液和无血清培养基的成分。
化学合成法(生产肽的已知方法)并非总是容易的方法。所述方法的已知实例包括使用N-苄氧羰基丙氨酸(以下称为“Z-丙氨酸”)和保护的L-谷氨酰胺的方法(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))，使用Z-丙氨酸和保护的L-谷氨酸-γ-甲酯的方法(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))，使用Z-丙氨酸酯和无保护的谷氨酸的方法(参见专利文件1)，包括用2-取代的丙酰卤化物为原料，合成N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物作为中间体的方法(参见专利文件2)。
但是，由于所有这些方法需要引入和脱去保护基或使用光学活性中间体，故这些方法不能充分满足工业上有利的要求。
另一方面，使用酶的典型肽生产方法的众所周知的实例包括使用N保护的和C无保护的羧基成分和N无保护的、C保护的胺成分的缩合反应(以下称为“反应1”)，和使用N保护的和C保护的羧基成分和N无保护的、C保护的胺成分的置换反应(以下称为“反应2”)。反应1的实例是由Z-天门冬氨酸和丙氨酸甲酯生产Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(参见专利文件3)，而反应2的实例是由乙酰苯丙氨酸乙酯和亮氨酰胺生产乙酰苯丙氨酰亮氨酰胺(参见Biochemical J.，163，531(1977))。有关使用N无保护的、C保护的羧基成分的方法的研究报告例非常少。在国际专利出版物WO 90/01555(专利文件4)中，描述了使用N无保护的、C保护的羧基成分和N无保护的、C保护的胺成分的置换反应(以下称为“反应3”)的实例。例如，其中描述了由精氨酸乙酯和亮氨酰胺生产精氨酰亮氨酰胺的方法。在欧洲专利出版物EP 278787A1(专利文件5)和欧洲专利出版物EP 359399B1(专利文件6)中，描述了使用N无保护的、C保护的羧基成分和N无保护的、C无保护的胺成分的置换反应(以下称为“反应4”)的实例。例如，其中描述了酪氨酸乙酯和丙氨酸生产酪氨酰丙氨酸的方法。
专利文件1；日本专利申请H1-96194号公报。
专利文件2；专利申请H6-234715号公报。
专利文件3；日本专利申请S53-92729号公报。
专利文件4；国际专利出版物WO 90/01555公报专利文件5；欧洲专利出版物EP 278787A1公报专利文件6；欧洲专利出版物EP 359399B1公报非专利文件1；Biochemical J.，163，531(1977)发明概述在上述反应1-4的方法中，最廉价的生产方法自然属于保护基最少的反应4。
但是，现有技术中反应4的实例(参见欧洲专利出版物EP278787A1)存在如下主要问题(1)肽生产速度非常低，(2)肽产率低，(3)可生产的肽限于包含疏水性相对高的氨基酸的肽，(4)酶的加入量非常大，和(5)需要源于霉菌、酵母或植物的相对昂贵的羧肽酶制剂。在反应4中，未见有使用酵母菌属以外的细菌或酵母来源的酶的方法，且未见有生产丙氨酰谷氨酰胺和其它具有高亲水性的肽的方法。在此背景下，需要开发一种生产这些肽的廉价的工业方法。
本发明的目的是提供不必通过复杂的合成方法即可容易地、高产率地和廉价地生成肽的新型酶。更具体地，本发明的目的是提供催化由羧基成分和胺成分的肽生成反应的新型酶，产生该酶的微生物，和采用该酶或微生物廉价地生产二肽的方法。
本发明人根据上述目的进行了大量研究，结果发现了来自新近发现的属于稳杆菌属等的细菌的，能有效生成肽的新型酶，并确定了该酶基因的序列，由此完成了本发明。
亦即，本发明如以下所述[1]编码以下(A)或(B)所示蛋白质的DNA(A)具有由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(C)或(D)所示蛋白质的DNA(C)具有由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(D)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(E)或(F)所示蛋白质的DNA(E)具有由序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(G)或(H)所示蛋白质的DNA(G)具有由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(H)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(I)或(J)所示蛋白质的DNA(I)具有由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，
(J)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(K)或(L)所示蛋白质的DNA(K)具有由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(L)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(M)或(N)所示蛋白质的DNA(M)具有序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白质，(N)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO6中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(O)或(P)所示蛋白质的DNA(O)具有序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白质，(P)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO12中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(Q)或(R)所示蛋白质的DNA(Q)具有序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白质，(R)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO18中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(S)或(T)所示蛋白质的DNA(S)具有序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的蛋白质，(T)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO23中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(U)或(V)所示蛋白质的DNA(U)具有序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的蛋白质，(V)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO25中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
编码以下(W)或(X)所示蛋白质的DNA(W)具有序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的蛋白质，(X)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO27中所示氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列。
以下(a)或(b)所示的DNA(a)具有序列表中的SEQ ID NO5中所示碱基序列的127-1908位碱基的碱基序列的DNA，(b)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO5中所示碱基序列的127-1908位碱基组成的碱基序列互补。
以下(c)或(d)所示的DNA(c)具有序列表中的SEQ ID NO11中所示碱基序列的121-1917位碱基的碱基序列的DNA，(d)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO11中所示碱基序列的121-1917位碱基组成的碱基序列互补。
以下(e)或(f)所示的DNA(e)具有序列表中的SEQ ID NO17中所示碱基序列的127-1935位碱基的碱基序列的DNA，
(f)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO17中所示碱基序列的127-1935位碱基组成的碱基序列互补。
以下(g)或(h)所示的DNA(g)具有序列表中的SEQ ID NO22中所示碱基序列的127-1995位碱基的碱基序列的DNA，(h)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO12中所示碱基序列的127-1995位碱基组成的碱基序列互补。
以下(i)或(j)所示的DNA(i)具有序列表中的SEQ ID NO24中所示碱基序列的104-1888位碱基的碱基序列的DNA，(j)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO24中所示碱基序列的104-1888位碱基组成的碱基序列互补。
以下(k)或(l)所示的DNA(k)具有序列表中的SEQ ID NO26中所示碱基序列的112-1992位碱基的碱基序列的DNA，(l)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO26中所示碱基序列的112-1992位碱基组成的碱基序列互补。
以下(m)或(n)所示的DNA(m)具有序列表中的SEQ ID NO5中所示碱基序列的61-1908位碱基的碱基序列的DNA，(n)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO5中所示碱基序列的61-1908位碱基组成的碱基序列互补。
以下(o)或(p)所示的DNA(o)具有序列表中的SEQ ID NO11中所示碱基序列的61-917位碱基的碱基序列的DNA，(p)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO11中所示碱基序列的61-1917位碱基组成的碱基序列互补。
以下(q)或(r)所示的DNA(q)具有序列表中的SEQ ID NO17中所示碱基序列的61-1935位碱基的碱基序列的DNA，(r)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO17中所示碱基序列的61-1935位碱基组成的碱基序列互补。
以下(s)或(t)所示的DNA(s)具有序列表中的SEQ ID NO22中所示碱基序列的127-1995位碱基序列的DNA，(t)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO22中所示碱基序列的127-1995位碱基组成的碱基序列互补。
以下(u)或(v)所示的DNA(u)具有序列表中的SEQ ID NO24中所示碱基序列的29-1888位碱基序列的DNA，(v)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO24中所示碱基序列的29-1888位碱基组成的碱基序列互补。
以下(w)或(x)所示的DNA(w)具有序列表中的SEQ ID NO26中所示碱基序列的61-1992位碱基序列的DNA，(x)在严紧条件下，与具有下述碱基序列的DNA杂交并编码包含成熟蛋白质区且具有肽生成活性的蛋白质的DNA，所述碱基序列与由序列表中的SEQ ID NO26中所示碱基序列的61-1992位碱基组成的碱基序列互补。
根据[13]-[24]任一项的DNA，其中严紧条件是在相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下，于60℃进行洗涤的条件。
一种包含根据[1]-[25]任一项的DNA的重组DNA。
一种导入了根据[26]的重组DNA的转化细胞。
一种生产肽生成酶的方法，包括在培养基中培养根据[27]的转化细胞，使肽生成酶在培养基和/或转化细胞中累积。
一种生产二肽的方法，包括在培养基中培养根据[28]的转化细胞以获得培养物，将该培养物与羧基成分和胺成分混合以合成二肽。
一种生产二肽的方法，包括通过使用属于鞘氨醇杆菌属并具有由羧基成分和胺成分生成二肽的活性的微生物的培养物，从该培养物中分离的微生物细胞，该微生物的微生物细胞处理产物或源于该微生物的肽生成酶，由羧基成分和胺成分生成二肽。
此外，SEQ ID NO6中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO5中所述DNA确定。SEQ ID NO12中所示氨基酸序列由序列表中的SEQID NO11中所述DNA确定。SEQ ID NO18中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO17中所述DNA确定。SEQ ID NO23中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO22中所述DNA确定。SEQ ID NO25中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO24中所述DNA确定。SEQ ID NO27中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO26中所述DNA确定。
附图简述

图1是举例说明本发明的稳杆菌的酶的最适pH的图；图2是举例说明本发明的稳杆菌的酶的最适温度的图；图3是举例说明由L-丙氨酸甲酯和L-谷氨酰胺制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的时程图；和图4是举例说明胞质部分(Cy)和周质部分(Pe)中存在的酶量的条形图。
发明的最佳实施方案以下为本发明的新型二肽生成酶基因和该基因的产物二肽生成酶。
(1)含有本发明的DNA的微生物本发明的DNA编码具有由羧基成分和胺成分生成肽的活性的蛋白质。在本说明书中，羧基成分是指提供肽键(-CONH-)中羰基位点(CO)的成分，而胺成分是指提供肽键中氨基位点(NH)的成分。此外，在本说明书中，除非另有特指，术语“肽”在单独使用时是指具有至少一个肽键的多聚体。此外，在本说明书中，“二肽”是指具有一个肽键的肽。
含有本发明的DNA的微生物的实例包括属于稳杆菌属、鞘氨醇杆菌属、土地杆菌(Pedobacter)属、整形杆菌属、圆杆菌属或Psycloserpens属的细菌，而其更具体的实例包括短稳杆菌菌株ATCC14234(菌株FERM P-18545、菌株FERM BP-8113)、鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124、解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)菌株IFO 12017、Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116、海圆杆菌菌株ATCC 25205和Psycloserpens burtonensis菌株ATCC700359。短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545、菌株FERMBP-8113)、鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124、解肝磷脂土地杆菌菌株IFO 12017、Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116、海圆杆菌菌株ATCC 25205和Psycloserpens burtonensis菌株ATCC700359是本发明人经研究而选择的能高产量地由羧基成分和胺成分生成肽的微生物。
上述微生物菌株中，以FERM号表示的微生物已被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并可参照各号而获得。
上述微生物菌株中，以ATCC号表示的微生物已被保藏于美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)，并可参照各号而获得。
上述微生物菌株中，以IFO号表示的微生物已被保藏于发酵研究所，Osaka(2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)，并可参照各号而获得。
上述微生物菌株中，以NBRC号表示的微生物已被保藏于日本国立技术与评价研究所生物资源中心(NITE)(5-8Kazusa-Kamaashi2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)，并可参照各号而获得。
上述微生物菌株中，以DSMZ号表示的微生物已被保藏于DeutcheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)(Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)，并可参照各号而获得。
短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545，菌株FERM BP-8113)已于2001年10月1日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并指定其保藏号为FERM P-18545。随后，依据布达佩斯条约的规定，于2002年7月8日将该菌株的转移至独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，并指定其保藏号为FERM BP-8113(微生物表现短稳杆菌菌株AJ 13933)。
鞘氨醇杆菌s p.菌株AJ 110003已于2002年7月22日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，并指定其保藏号为FERM BP-8124。通过下述鉴定试验，将菌株AJ 110003(FERM BP-8124)鉴定为上述鞘氨醇杆菌sp.。菌株FERM BP-8124是革兰氏阴性杆菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)，不生成芽孢，无运动性。其菌落为圆形，边缘完全光滑，包含低突起，有光泽，浅黄色。该生物体在30℃生长，过氧化物酶阳性，氧化酶阳性，OF试验(葡萄糖)阴性，根据这些特征而将其鉴定为属于鞘氨醇杆菌属的细菌。此外，因为如下特性硝酸盐还原阴性、吲哚产生阴性、来源于葡萄糖的酸产物阴性、精氨酸二水解酶阴性、脲酶阳性、七叶苷水解阳性、明胶水解阴性、β-半乳糖苷酶阳性、葡萄糖同化阳性、L-阿拉伯糖同化阴性、D-甘露糖同化阳性、D-甘露醇同化阴性、N-乙酰-D-葡萄糖胺同化阳性、麦芽糖同化阳性、葡萄糖酸钾阴性、正癸酸同化阴性、已二酸同化阴性、dl-苹果酸同化阴性、枸橼酸钠同化阴性、苯乙酸同化阴性和细胞色素氧化酶阳性，可确定其具有与多食鞘氨醇杆菌或食神鞘氨醇杆菌相似的特性。此外，虽然16S rRNA基因的碱基序列的同源性分析结果显示其具有与多食鞘氨醇杆菌高度的同源性(98.8％)，但没有与该细菌菌株完全匹配的细菌菌株。因此，该细菌菌株可被鉴定为鞘氨醇杆菌sp。
(2)微生物培养为了得到含有本发明的DNA的微生物的微生物细胞，可将该微生物在适宜的培养基上培养和生长。对用于该目的的培养基无特别限制，只要能使该微生物生长即可。该培养基可以是含有普通的碳源、氮源、磷源、硫源、无机离子、以及根据需要的有机营养源的普通培养基。
例如，只要可被上述微生物利用，可使用任何碳源。可使用的碳源的具体实例包括糖诸如葡萄糖、果糖、麦芽糖和直链淀粉，醇诸如山梨糖醇、乙醇和甘油，有机酸诸如富马酸、柠檬酸、乙酸和丙酸及其盐，诸如石蜡的碳氢化合物以及它们的混合物。
可使用的氮源的实例包括诸如硫酸铵和氯化铵的无机酸的铵盐，诸如富马酸铵和柠檬酸铵的有机酸的铵盐，诸如硝酸钠和硝酸钾的硝酸盐，诸如胨、酵母提取物、肉提取物和玉米浆的有机氮化合物以及它们的混合物。
此外，还可将用于普通培养基的诸如无机盐、微量金属盐和维生素的营养源适当地混合使用。
在培养条件上也没有特别的限制，例如，可在好气条件下，使pH和温度适当地控制在pH为5-8的范围，温度为15-40℃的范围内，培养约12-约48小时。
酶的纯化本发明的DNA编码肽生成酶。例如，该肽生成酶可从属于稳杆菌属的细菌中纯化。从短稳杆菌中分离和纯化肽生成酶的方法将作为纯化酶的实例进行描述。
首先，通过采用物理方法诸如超声破碎或使用溶细胞壁性酶的酶法破碎细胞以及通过离心等方法除去不溶部分，从而从短稳杆菌，例如菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的微生物细胞中制备微生物细胞提取物。然后通过联合普通的蛋白质纯化方法诸如阴离子交换层析、阳离子交换层析或凝胶过滤层析，经过对获自上述方法的微生物细胞提取物溶液进行分馏来纯化肽生成酶。
用作阴离子交换层析的载体的实例是Q-Sepharose HP(Amersham生产)。当将包含酶的细胞提取物经过填充了载体的柱时，在pH 8.5的条件下可从非吸附部分中回收酶。
用作阳离子交换层析的载体的实例是MonoS HR(Amersham生产)。在通过将包含酶的细胞提取物经过填充了载体的柱从而使酶吸附在柱上以及随后洗涤柱之后，用具有高盐浓度的缓冲溶液洗脱酶。此时，可连续增加盐浓度或可采用浓度梯度。例如，在使用MonoS HR的情况下，用约0.2-约0.5M的NaCl洗脱吸附在柱上的酶。
然后可将用上述方法纯化的酶进一步通过凝胶过滤层析等进行均匀纯化。用于凝胶过滤层析的载体的实例是Sephadex 200pg(Amersham生产)。
在上述纯化方法中，可根据下述实施例所描述的方法，通过检测各部分的肽生成活性，从而确认包含酶的部分。序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中显示了用上述方法纯化的酶的内部氨基酸序列。
(4)本发明的DNA和转化体(4-1)本发明的DNA从短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)中，分离出具有在SEQ ID NO5中所述61-1908位碱基的碱基序列的本发明的DNA。含有SEQ ID NO5中所述61-1908位碱基的DNA是编码区序列(以下称为“CDS”)部分。61-1908位碱基的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白质区。信号序列区由61-126位碱基组成，而成熟蛋白质区由127-1908位碱基组成。亦即，本发明提供了包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和成熟蛋白质形式的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO5中所述序列中包含的信号序列是一种前导序列类型，推测该前导序列所编码的前导肽的主要功能是从细胞膜内侧至细胞膜外侧的分泌。由127-1908位碱基(即除前导肽以外的位点)所编码的蛋白质是成熟蛋白质，推测其可表现高度的肽生成活性。
从鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)中，分离出具有SEQ ID NO11中所述61-1917位碱基的碱基序列的DNA，其也是本发明的DNA。具有由61-1917位碱基组成的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。由61-1917位碱基组成的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白质区。信号序列区是61-120位碱基的区域，而成熟蛋白质区是121-1917位碱基的区域。亦即，本发明提供了包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和成熟蛋白质形式的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO11中所述序列中包含的信号序列是前导序列类型。推测该前导序列所编码的前导肽的主要功能是从细胞膜内侧至细胞膜外侧的分泌。由121-1917位碱基(即除前导肽以外的部分)所编码的蛋白质是成熟蛋白质，推测其可表现高度的肽生成活性。
从解肝磷脂土地杆菌菌株IFO 12017(保藏机构发酵研究所，Osaka，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)中，分离出具有SEQ ID NO17所述61-1935位碱基的碱基序列的本发明的DNA。SEQ ID NO17中由所述61-1935位碱基组成的DNA是CDS部分。由61-1935位碱基组成的碱基序列中包含信号序列区和成熟蛋白质区。信号序列区由61-126位碱基组成，而成熟蛋白质区由127-1935位碱基组成。亦即，本发明提供了包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和成熟蛋白质形式的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO17中所述序列中包含的信号序列是前导序列类型，推测该前导序列所编码的前导肽的主要功能是从细胞膜内侧至细胞膜外侧的分泌。127-1935位碱基(即除前导肽以外的位点)所编码的蛋白质是成熟蛋白质，推测其可表现高度的肽生成活性。
从Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏机构Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg1b，38124Braunschweig，Germany)中分离出具有SEQ ID NO22中所述61-1995位碱基的碱基序列的本发明的DNA。由SEQ ID NO22中所述61-1995位碱基组成的DNA是CDS部分。由61-1995位碱基的碱基序列中包含信号序列区和成熟蛋白质区。信号序列区由61-126位碱基组成，而成熟蛋白质区由127-1995位碱基组成。亦即，本发明提供了包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和成熟蛋白质形式的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO22中所述序列中包含的信号序列是前导序列类型，推测该前导序列所编码的前导肽的主要功能是从细胞膜内侧至细胞膜外侧的分泌。由127-1995位碱基(即除前导肽以外的位点)所编码的蛋白质是成熟蛋白质，推测其可表现高度的肽生成活性。
从海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)中，分离出具有SEQ ID NO24中所述29-1888位碱基的碱基序列的本发明的DNA。由SEQ ID NO24中所述29-1888位碱基组成的DNA是CDS部分。含有29-1888位碱基的碱基序列中包含信号序列区和成熟蛋白质区。信号序列区由29-103位碱基组成，而成熟蛋白质区由104-1888位碱基组成的。亦即，本发明提供了包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和成熟蛋白质形式的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO24所述序列中所包含的信号序列是前导序列类型，推测该前导序列所编码的前导肽的主要功能是从细胞膜内侧至细胞膜外侧的分泌。由104-1888位碱基(即除前导肽以外的位点)所编码的蛋白质是成熟蛋白质，推测其可表现高度的肽生成活性。
从Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)中，分离出具有SEQ ID NO26所述61-1992位碱基的碱基序列的本发明的DNA。由SEQ ID NO26中所述61-1992位碱基组成的DNA是CDS部分。含有61-1992位碱基的碱基序列中包含信号序列区和成熟蛋白质区。信号序列区由61-111位碱基，而成熟蛋白质区由112-1992位碱基组成。亦即，本发明提供了包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和成熟蛋白质形式的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO26中所述序列中包含的信号序列是前导序列类型，推测该前导序列所编码的前导肽的主要功能是从细胞膜内侧至细胞膜外侧的分泌。112-1992位碱基所编码的蛋白质(即除前导肽以外的位点)是成熟蛋白质，推测其可表现高度的肽生成活性。
此外，根据诸如Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)的出版物中的描述，可实施下述多种基因重组技术。
本发明的DNA可通过聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)(参见PCR；White T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))或通过短稳杆菌、鞘氨醇杆菌sp.、解肝磷脂土地杆菌、Taxeobactergelupurpurascens、海圆杆菌或Psycloserpens burtonensis的染色体DNA或DNA文库的杂交而获得。PCR引物可根据基于按上述(3)节中所述进行纯化的肽生成酶所确定的内部氨基酸序列进行设计。此外，因为本发明已经清楚地确定了肽生成酶基因的碱基序列(SEQ IDNO5、SEQ ID NO11、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26)，故可根据这些碱基序列设计用于杂交的引物或探针，还可采用探针分离该基因。如果将具有与5′非翻译区和3′非翻译区相应的序列的引物用作PCR引物，则可扩增本发明的酶的编码区的全长。例如，在扩增包含SEQ ID NO5中所述前导序列和成熟蛋白质编码区的区域时，具体来说，5′侧引物的实例是具有SEQ ID NO5中61位碱基的上游区域的碱基序列的引物，而3′侧引物的实例是具有与1908位碱基下游区域的碱基序列互补的序列的引物。
例如，可按常规方法采用Applied Biosystems生产的380B型DNA合成仪，通过phosphoamidite法(参见Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)合成引物。例如，可根据由提供方例如制造商所说明的方法，采用Gene Amp PCR System 9600(Perkin-Elmer生产)和TakaraLA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo生产)实施PCR反应。
无论是否包含前导序列，本发明的DNA中还包含与序列表中的SEQID NO5中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通过从编码具有突变的本发明的酶的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有与序列表中的SEQ ID NO5中所述CDS互补的碱基序列的DNA杂交，或与从相同碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA而获得与本发明的DNA基本上同一的DNA。
无论是否包含前导序列，本发明的DNA中还包含与序列表中的SEQID NO11中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通过从编码具有突变的本发明的酶的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有与序列表中的SEQ ID NO11中所述CDS互补的碱基序列的DNA杂交，或与从相同碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA而获得与本发明的DNA基本上同一的DNA。
无论是否包含前导序列，本发明的DNA中还包含与序列表中的SEQID NO17中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通过从编码具有突变的本发明的酶的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有与序列表中的SEQ ID NO17中所述CDS互补的碱基序列的DNA杂交，或与从相同碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA而获得与本发明的DNA基本上同一的DNA无论是否包含前导序列，本发明的DNA中还包含与序列表中的SEQID NO22中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通过从编码具有突变的本发明的酶的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有与序列表中的SEQ ID NO22中所述CDS互补的碱基序列的DNA杂交，或与从相同碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA而获得与本发明的DNA基本上同一的DNA。
无论是否包含前导序列，本发明的DNA中还包含与序列表中的SEQID NO24中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通过从编码具有突变的本发明的酶的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有与序列表中的SEQ ID NO24中所述CDS互补的碱基序列的DNA杂交，或与从相同碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA而获得与本发明的DNA基本上同一的DNA。
无论是否包含前导序列，本发明的DNA中还包含与序列表中的SEQID NO26中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通过从编码具有突变的本发明的酶的DNA或含有该DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有与序列表中的SEQ ID NO26中所述CDS互补的碱基序列的DNA杂交，或与从相同碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA而获得与本发明的DNA基本上同一的DNA例如，可以按照已确定的方法，根据例如序列表中的SEQ ID NO5中所述的碱基序列来制备探针。此外，还可按照已确定的方法，实施通过使用探针来发现与探针杂交的DNA，从而用于分离靶DNA的方法。例如，DNA探针可通过扩增在质粒或噬菌体载体中克隆的碱基序列，用限制性酶剪切需要用作探针的碱基序列，然后提取所需碱基序列来制备。要剪切掉的部分可根据靶DNA进行调整。
此处所用的术语“在严紧条件下”是指在该条件下形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交。用数值精确表示该条件是困难的。例如，这些条件可以是，同源性高的DNA(例如，50％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高)可彼此杂交且同源性比这些低的DNA不能彼此杂交的条件，或Southern杂交中洗涤的普通条件，其中杂交在与1×SSC和0.1％SDS，优选0.1×SSC和0.1％SDS相应的盐浓度下，于60℃进行。虽然在所述条件下杂交的基因包括序列中特定位置上出现终止子或由于活性中心中的突变而丧失活性的那些基因，但可通过将其连接至商业上可获得的表达载体，将其在适宜的宿主中表达，和采用下述方法检测表达产物的酶活性从而将其很容易地除去。
但是，当碱基序列在上述严紧条件下杂交时，由该碱基序列编码的蛋白质优选在50℃和pH8的条件下，保留具有由作为保留的原始碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质的约一半或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高的酶活性。例如，当说明如下情况，例如说明在严紧条件下与具有与SEQ ID NO5中所示碱基序列的127-1908位碱基的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的碱基序列时，由该碱基序列编码的蛋白质优选在50℃和pH8的条件下，保留具有SEQ IDNO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质的约一半或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高的酶活性。
序列表中的SEQ ID NO6中显示了由序列表中的SEQ ID NO5所述CDS所编码的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO12中显示了由序列表中的SEQ ID NO11所述CDS所编码的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO18中显示了由序列表中的SEQ ID NO17所述CDS所编码的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO23中显示了由序列表中的SEQ ID NO22所述CDS所编码的氨基酸序列。序列表中的SEQ IDNO25中显示了由序列表中的SEQ ID NO24所述CDS所编码的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO27中显示了由序列表中的SEQ ID NO26所述CDS所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO6中所述完整氨基酸序列包括前导肽和成熟蛋白质区，其中1-22位氨基酸残基构成前导肽，而23-616位氨基酸残基构成成熟蛋白质区。此外，SEQ ID NO11中所述完整氨基酸序列包括前导肽和成熟蛋白质区，其中1-20位氨基酸残基构成前导肽，而21-619位氨基酸残基构成成熟蛋白质区。
SEQ ID NO18中所述完整氨基酸序列包括前导肽和成熟蛋白质区，其中1-22位氨基酸残基构成前导肽，而23-625位氨基酸残基构成成熟蛋白质区。
SEQ ID NO23中所述的完整氨基酸序列包括前导肽和成熟蛋白质区，其中1-22位氨基酸残基构成前导肽，而23-645位氨基酸残基构成成熟蛋白质区。
SEQ ID NO25中所述的完整氨基酸序列包括前导肽和成熟蛋白质区，其中1-25位氨基酸残基构成前导肽，而26-620位氨基酸残基构成成熟蛋白质区。
SEQ ID NO27中所述的完整氨基酸序列包括前导肽和成熟蛋白质区，其中1-17位氨基酸残基构成前导肽，而18-644位氨基酸残基构成成熟蛋白质区。
本发明的DNA所编码的蛋白质是其中成熟蛋白质具有肽生成活性的蛋白质，本发明的DNA中还包括编码与具有序列表中的SEQ ID NO6、SEQ ID NO12、SEQ ID NO18、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27所示氨基酸序列的蛋白质基本上同一的蛋白质的DNA，无论其是否包含前导肽(注意，根据通用密码子，碱基序列由氨基酸序列确定)。亦即，本发明提供了编码以下(A)-(X)所示蛋白质的DNA(A)具有由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(C)具有由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(D)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(E)具有序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(G)具有由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(H)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(I)具有由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(J)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(K)具有由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸残基组成的氨基酸序列的蛋白质，(L)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸残基组成的氨基酸序列中置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(M)含有序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白质，(N)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO6中所示氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(O)具有序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白质，
(P)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO12中所示氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(Q)具有序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白质，(R)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO18中所示氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(S)具有序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的蛋白质，(T)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO23中所示氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(U)具有序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的蛋白质，(V)含有成熟蛋白质区，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO25中所示氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，(W)具有序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的蛋白质，和(X)含有成熟蛋白质区，具有序列表中的SEQ ID NO27中所示氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白质。
此处，虽然术语“多个”的含义根据蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置和类型而变化，但其范围包括不会显著损害三维结构和蛋白质活性的氨基酸残基的个数，具体为2-50，优选为2-30，更优选为2-10。但是，在(B)、(D)、(F)、(H)、(J)、(L)、(N)、(P)、(R)、(T)、(V)或(X)的蛋白质的氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列的情况下，蛋白质优选在50℃和pH8的条件下，保留处于不包含突变的状态下的蛋白质的约一半或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高的酶活性。例如，对(B)的情况给出说明；当氨基酸序列(B)为在序列表中的SEQ ID NO6中所示氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸的情况下，该蛋白质优选在50℃和pH8的条件下，保留具有序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白质的约一半或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高的酶活性。
类似上述(B)等所示的氨基酸突变可通过以下方法获得，例如通过定点诱变法，使该酶基因的特定部位的氨基酸发生置换、缺失、插入、添加的碱基序列改变。此外，上述改变的DNA也可通过已知的诱变处理而得到。诱变处理是指，例如，用羟胺等在体外处理编码该酶的DNA的方法，以及用通常用于人工诱变的诱变剂，诸如紫外线照射、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理包含编码该酶的DNA的埃希氏杆菌属细菌的方法。
此外，上述碱基的置换、缺失、插入、添加和/或倒位还包括天然存在的突变诸如由于微生物物种或菌株导致的差异。通过在适宜的细胞中表达具有所述突变的DNA和检测表达产物的酶活性，可获得编码与序列表中的SEQ ID NO6或12中所述蛋白质基本上同一的蛋白质的DNA。
(4-2)转化体的制备和肽生成酶的生产肽生成酶可通过将本发明的DNA导入适宜的宿主以及在该宿主中表达DNA来生产。
可用于表达由本发明的DNA所确定的蛋白质的宿主的实例包括多种原核细胞诸如属于埃希氏菌属诸如大肠杆菌，稳杆菌，鞘氨醇杆菌属，黄杆菌属和杆菌属诸如枯草杆菌的细菌，以及多种真核诸如酿酒酵母，毕赤氏酵母和米曲霉。
用于将DNA导入宿主的重组DNA可通过将需要导入的DNA插入与要表达该DNA的宿主的类型相应的载体中来制备，以该方式由该DNA所编码的蛋白质可被表达。在启动子对短稳杆菌等的肽生成酶基因在宿主细胞中的功能是唯一的情况下，该启动子可被用作表达本发明的DNA的启动子。此外，可将在宿主细胞中起作用的另一启动子与本发明的DNA连接，然后可按需要在该启动子的控制下表达该DNA。
将重组DNA导入宿主细胞的转化方法的实例包括D.M.Morrison的方法(参见Methods in Enzymology，68，326(1979))或通过用氯化钙处理受体微生物细胞而增加DNA通透性的方法(参见Mandel，H.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。
在使用重组DNA技术大量生产蛋白质的情况下，将产生蛋白质的转化体中的蛋白质结合以形成蛋白质包含体也是实施本发明的优选实施方式。该表达和生产方法的优势包括保护靶蛋白质免受微生物细胞中存在的蛋白酶的消化，以及通过裂解微生物细胞，然后离心即可简单而容易地纯化靶蛋白质等。
以该方式获得的蛋白质包含体用蛋白质变性剂溶解，通过活性再生步骤将溶解的蛋白质转化为适当折叠的、生理活性蛋白质，所述活性再生步骤主要包括用蛋白质变性剂裂解蛋白质，然后除去变性剂。该过程具有很多实例，包括人白细胞介素-2的活性再生(参见日本专利特开昭S61-257931)。
为了从蛋白质包含体中获得活性蛋白质，需要进行一系列操作，包括溶解和活性再生，该方法步骤要比直接制备活性蛋白质复杂得多。但是，在生产在微生物细胞中对微生物生长具有有害作用的大体积蛋白质的情况下，可通过在微生物细胞中累积以无活性蛋白质的包含体形式的蛋白质而抑制所述作用。
大量生产包含体形式的大体积靶蛋白质的方法的实例包括在强效启动子的控制下独立表达靶蛋白质的方法，以及靶蛋白质以与已知大体积表达的蛋白质的融合蛋白质的形式进行表达的方法。
以下，将以制备转化的大肠杆菌和使用转化的微生物来生产肽生成酶的方法为例更具体地解释本发明。此外，在微生物诸如大肠杆菌中制备肽生成酶时，可掺入编码前体蛋白质(包含前导序列)的DNA，或可掺入由不包含前导序列的成熟蛋白质区组成的DNA，且可根据要生产的酶的生产条件、形式、使用条件等选择适于蛋白质编码序列的DNA。
通常用于在大肠杆菌中生产异源蛋白质的启动子可被用作表达编码肽生成酶的DNA的启动子。所述启动子的实例包括T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ-噬菌体PR启动子、PL启动子和其它强启动子。此外，可使用的载体的实例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。此外，还可以使用噬菌体DNA的载体。而且，可使用包含启动子且能表达插入的DNA序列(包含可用的启动子)的表达载体。
为了生产融合蛋白质包含体形式的肽生成酶，将编码另一蛋白质(优选亲水性肽)的基因连接至肽生成酶基因的上游或下游从而得到融合蛋白质基因。在该方式中，编码另一蛋白质的基因可以是能增加累积的融合蛋白质的量，并增强融合蛋白质在变性和再生步骤后的溶解性的任何基因。所述基因的候选实例包括T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、γ-干扰素基因、白细胞介素-2基因和凝乳酶原基因。
当这些基因与编码肽生成酶的基因连接时，将全部基因连接以便使其密码子的阅读框一致。该基因可被连接至适宜的限制酶位点，或可以使用含有适宜序列的合成DNA。
此外，为了增加肽生成酶的产量，优选在某些情况下将终止子(转录终止序列)连接至融合蛋白质基因的下游。该终止子包括，例如，T7终止子，fd噬菌体终止子，T4终止子，四环素抗性基因终止子，和大肠杆菌trpA基因终止子。
在大肠杆菌中导入编码肽生成酶或肽生成酶与其它蛋白质之间的融合蛋白质的基因的载体优选所谓多拷贝型载体，其实例包括具有源于Co1E1的复制起点的的质粒，例如，基于pUC的质粒，以及基于pBR322的质粒或其衍生物。此处所使用的“衍生物”是指通过碱基的置换、缺失、插入、添加和/或倒位而进行修饰的那些质粒。应当注意，此处所使用的修饰包括通过用诱变剂或UV照射的诱变处理的修饰，或通过自发突变的修饰。
为筛选转化体，载体优选含有诸如氨苄西林抗性基因的标记物。所述质粒包括可商业获得的含有有效启动子的表达载体(基于pUC的载体(Takara Shuzo公司生产)，基于pRROK的载体(ClonetechLaboratories公司生产)，pKK233-2(Clonetech Laboratories公司生产)等。
通过将DNA片段连接至载体DNA获得重组DNA；在所述DNA片段中，以下述顺序连接启动子，编码L-氨基酸酰胺水解酶或包含L-氨基酸酰胺水解酶与另一蛋白质的融合蛋白质的基因(根据情况)，终止子。
当用重组DNA转化大肠杆菌然后培养所得大肠杆菌时，肽生成酶或包含肽生成酶和另一蛋白质的融合蛋白质得以表达并生产。虽然通常用于表达异源基因的菌株可被用作转化宿主，但优选，例如大肠杆菌菌株JM109。实施转化的方法和用于筛选出转化体的方法描述于Molecular Cloning，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press(1989)和其它出版物中。
在表达融合蛋白质形式的肽生成酶时，可使用以肽生成酶，诸如凝血因子Xa或激肽释放酶中不存在的序列作为识别序列的限制性蛋白酶来裂解肽生成酶。
可将通常用于培养大肠杆菌的培养基，诸如M9-酪蛋白氨基酸培养基或LB培养基，用作生产培养基。此外，根据所用载体的标记物、启动子、宿主微生物类型等来选择适宜的培养条件和生产诱导条件。
可将下述方法用于回收肽生成酶和包含肽生成酶与另一蛋白质的融合蛋白质。如果该肽生成酶或其融合蛋白质在微生物细胞中已被溶解，则回收该微生物细胞，然后将其破碎或裂解以便将其用作粗酶液。而且，使用前可按需通过普通技术诸如沉淀、过滤或柱色谱法对该肽生成酶或其融合蛋白质进行纯化。此时，还可使用采用肽生成酶或其融合蛋白质的抗体的纯化方法。
在形成蛋白质包含体的情况下，用变性剂溶解该包含体。虽然其可与微生物细胞蛋白质一起溶解，但考虑到随后的纯化步骤，故优选取出包含体然后溶解。可采用常规的已知方法从微生物细胞中回收包含体。例如，可通过裂解微生物细胞然后离心从而回收包含体。能够溶解包含体的变性剂的实例包括盐酸胍(例如，6M，pH5-8)和脲(例如，8M)等。
具有活性的蛋白质通过透析等除去这些变性剂而得以再生。Tris-HCl缓冲液，磷酸缓冲溶液等可被用作透析中所用的透析液，其浓度可以是，例如，20mM-0.5M，而其pH可以是，例如，5-8。
再生步骤期间的蛋白质浓度优选被保持在约500μg/ml或更低。透析温度优选为5℃或更低以便防止再生的肽生成酶发生自交联。此外，除了透析外，除去变性剂的方法包括稀释或超滤，并预期无论使用何种变性剂活性均可被再生。
(5)本发明的DNA所编码的酶的特性例如，可通过使酶在包含氨基酸酯和胺作为底物的硼酸盐缓冲液中反应，然后定量生成的肽来检测本发明的DNA所编码的酶的活性。在更具体的实施例中，采用包含100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的硼酸盐缓冲液(pH 9.0)，在25℃实施反应若干分钟。
本发明中所用酶的活性单位的定义是，1单位(U)是在使用包含100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，25℃的反应条件下，1分钟内产生1微摩尔(μmole)肽的酶量。
本发明的DNA所编码的蛋白质是肽生成酶蛋白质。肽生成活性是指由羧基成分和胺成分生成肽的活性。以下，将描述本发明的DNA所编码的酶的优选实施方式的特性。
本发明的DNA所编码的酶的一种优选实施方式包括具有下述活性的酶，二肽生产率用作其指示物。亦即，本发明的酶的一种优选实施方式包括具有由羧基成分和胺成分生成肽的活性，且在以下(i)-(iv)的条件下，在二肽生成反应中，具有优选为0.03mM/min或更高，更优选0.3mM/分钟或更高，特别优选1.0mM/min或更高的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产率的酶。二肽生成反应的条件如下(i)羧基成分是L-丙氨酸甲酯盐酸盐(100mM)；(ii)胺成分是L-谷氨酰胺(200mM)；(iii)pH为9.0；和，(iv)按照蛋白质量，均匀纯化的酶的加入量低于0.61mg/ml。
上述生产率远高于使用酶合成肽的常规生产率，本发明的酶具有催化肽以非常快的速度合成的能力。
酶的上述加入量指示加入反应系统的酶的最终量，按所需酶蛋白质量，酶加入量为0.01mg/ml或更高，优选0.02mg/ml或更高。术语“蛋白质量”是指通过采用蛋白质测定CBB溶液(Nakarai生产)和牛血清白蛋白作为标准物质，由考马斯亮蓝比色法所显示的值。
在测定酶活性的方法的具体实例中，可通过使酶在包含氨基酸酯和胺作为底物的硼酸盐缓冲液中反应，以及定量得到的肽来检测酶活性。在更具体的实例中，方法包括使用包含100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)，于25℃使酶反应若干分钟。
此外，本发明的DNA所编码的酶的优选实施方式包括具有可将氨基酸酯和氨基酸酰胺均用作羧基成分的底物的能力的酶。词语“将氨基酸酯和氨基酸酰胺均用作底物”是指至少一类或更多类氨基酸酯和至少一类或更多类氨基酸酰胺可被用作底物。此外，本发明的酶的一种优选实施方式具有将所有氨基酸、C保护的氨基酸和胺用作胺成分的底物的能力的酶。词语“氨基酸、C保护的氨基酸和胺用作底物”是指至少一类或更多类氨基酸，至少一类或更多类C保护的氨基酸，和至少一类或更多类胺可被用作底物。由于具有羧基成分或胺成分的广泛的底物特异性，本发明的酶是优选的，其中可选择广泛的原料，其依次利于工业生产中对费用和生产设备的需要。
羧基成分的具体实例包括L-氨基酸酯，D-氨基酸酯，L-氨基酸酰胺和D-氨基酸酰胺。此外，氨基酸酯不仅包括与天然存在的氨基酸相应的氨基酸酯，还包括与非天然存在的氨基酸或其衍生物相应的氨基酸酯。此外，氨基酸酯的实例包括α-氨基酸酯以及β-，γ-，和ω-氨基酸酯等，其具有不同的氨基结合位点。氨基酸酯的典型实例包括氨基酸的甲酯，乙酯，正丙酯，异丙酯，正丁酯，异丁酯和叔丁酯。
胺成分的具体实例包括L-氨基酸，C保护的L-氨基酸，D-氨基酸，C保护的D-氨基酸和胺。此外，胺的实例不仅包括天然存在的胺，还包括非天然存在的胺或其衍生物。此外，氨基酸的实例不仅包括天然存在的氨基酸，还包括非天然存在的氨基酸或其衍生物。其包括α-氨基酸以及β-，γ-，和ω-氨基酸等，其具有不同的氨基结合位点。
此外，另一方面，本发明的DNA所编码的酶的一种优选实施方式包括催化肽生成反应的pH范围为6.5-10.5的酶。优选能够在上述宽泛的pH范围内催化反应的本发明的酶，其能灵活地适应可能会出现多种限制的工业生产。但是在肽实际生成中，在使用酶时，优选进一步调整至与所得酶相应的最适pH以便将酶的催化作用最大化。
而且，另一方面，本发明的DNA所编码的酶的一种优选实施方式包括催化肽生成反应的温度范围为0-60℃的酶。因为本发明的酶能够在上述宽泛的温度范围内催化反应，故其是优选的，其能灵活地适应可能会出现多种限制的工业生产。但是在肽实际生成中，在使用酶时，优选进一步调整至与所得酶相应的最适温度以便将酶的催化作用最大化。
(6)二肽生产方法本发明的二肽生产方法包括在存在上述酶时，羧基成分和胺成分之间的反应。本发明的二肽生产方法包括使具有由羧基成分和胺成分生成肽的能力的酶，或含酶物作用于羧基成分和胺成分从而合成二肽。
使本发明所用的酶或含酶物作用于羧基成分和胺成分的方法可以是彼此混合酶或含酶物，羧基成分和胺成分。更具体地，可以采用将酶或含酶物加入含有羧基成分和胺成分的溶液然后使其反应的方法。可选地，在使用产生该酶的微生物的情况下，可使用包括培养产生该酶的微生物，在微生物或微生物培养液中产生和累积酶，然后将羧基成分和胺成分加入培养液的方法。然后通过已确定的方法收集产生的二肽，并根据需要进行纯化。
术语“含酶物”是指包含酶的任何物质，其具体形式的实例包括能产生酶的微生物的培养物，来自培养物的分离的微生物细胞，和通过处理微生物细胞得到的产物(下文称为，“微生物细胞处理产物”)。微生物的培养物是指通过培养微生物所得到的，更具体地，是指微生物细胞，用于培养微生物的培养基，和由培养的微生物产生的物质等的混合物。此外，可洗涤微生物细胞，并以洗涤的微生物细胞的形式进行使用。此外，微生物细胞处理产物包括裂解、溶解或冻干的微生物细胞等，还包括通过处理微生物细胞而回收的粗酶等，以及通过纯化粗酶得到的纯化的酶等。通过多种纯化方法得到的部分纯化的酶可被用作纯化的酶，或可使用已经通过共价结合方法、吸附法、包埋法等方法固定的固定化酶。此外，因为某些微生物在培养期间会发生部分裂解(依赖于所使用的微生物)，此时培养上清液也可被用作含酶物。
此外，野生菌株可被用作包含酶的微生物，或还可使用表达该酶的基因重组菌株。微生物不局限于完整微生物细胞，还可以使用丙酮处理的微生物细胞、冷冻干燥的微生物细胞或其它经处理的微生物细胞。还可以使用通过共价结合方法、吸附法、包埋法或其它方法固定微生物细胞和微生物细胞处理产物而得到的固定化微生物细胞和固定化微生物细胞处理产物，以及处理的固定化微生物细胞。
此外，当使用培养物、培养的微生物细胞、洗涤的微生物细胞或通过破碎或裂解微生物细胞而得到的微生物细胞处理产物时，其中通常会出现不参与肽生成的酶分解生成的肽。此时，某些情况下优选加入金属蛋白酶抑制剂如乙二胺四乙酸(EDTA)。加入量为0.1毫摩尔(mM)-300mM，优选1mM-100mM。
本发明的二肽生产方法的优选实施方式是如下方法，在培养基中培养上述(4-2)所述的转化细胞，使肽生成酶在培养基和/或转化细胞中累积。由于通过使用转化体可容易地大量产生肽生成酶，故可大量且快速地生产二肽。
如果酶或含酶物的使用量显示出达到靶效应，则该量即为足够的(有效量)，本领域普通技术人员通过简单的预实验即可容易地确定该有效量。例如，在使用酶的情况下，使用量为大约0.01U-约100U，而在使用洗涤的微生物细胞的情况下，使用量为大约1g/L-约500g/L。
任何羧基成分均为可使用的，只要其能通过与胺成分形式的其它物质的缩合而生成肽即可。羧基成分的实例包括L-氨基酸酯，D-氨基酸酯，L-氨基酸酰胺和D-氨基酸酰胺以及不含氨基的有机酸酯。此外，氨基酸酯的实例不仅包括与天然存在的氨基酸相应的氨基酸酯，还包括与非天然存在的氨基酸或其衍生物相应的氨基酸酯。此外，氨基酸酯的实例包括α-氨基酸酯以及β-，γ-，和ω-氨基酸酯等，其具有不同的氨基结合位点。氨基酸酯的典型实例包括氨基酸的甲酯，乙酯，正丙酯，异丙酯，正丁酯，异丁酯和叔丁酯。
任何胺成分均为可使用的，只要其能通过与胺成分形式的其它物质的缩合而生成肽即可。胺成分的实例包括L-氨基酸，C保护的L-氨基酸，D-氨基酸，C保护的D-氨基酸和胺。此外，胺的实例不仅包括天然存在的胺，还包括非天然存在的胺或其衍生物。此外，氨基酸的实例不仅包括天然存在的氨基酸，还包括非天然存在的氨基酸或其衍生物。其包括α-氨基酸以及β-，γ-，和ω-氨基酸等，其具有不同的氨基结合位点。
用作原料的羧基成分和胺成分的浓度分别为1mM至10M，优选为0.05M至2M；但是，在某些情况下，优选以与羧基成分等摩尔或过量摩尔的量加入胺成分。此外，在高浓度的物质抑制反应的情况下，可在将其调整至不导致抑制的浓度后，在反应期间将其分步加入。
容许肽合成的反应温度为0-60℃，优选5-40℃。此外，容许肽合成的反应pH为6.5-10.5，优选7.0-10.0。
实施例以下，通过实施例解释本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。除了用薄膜层析的茚三酮染色(定性)进行证实外，通过下述高效液相色谱法实施定量检测以便测定产物。柱Inertsil ODS-2(GLScience公司生产)，洗脱液磷酸水溶液，其中包含5.0mM 1-辛烷磺酸钠(pH 2.1)甲醇＝10015-50，流速1.0mL/分钟，检测210纳米(以下称为“nm”)。
(实施例1)微生物培养(短稳杆菌菌株FERM BP-8113)在500ml坂口氏瓶中，加入50mL每升(L)含有5克(g)葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g胨的培养基(pH 6.2)，在115℃灭菌15分钟。然后在该培养基上接种1铂环已在含有同样的培养基上，30℃培养了16小时的短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的细胞，然后在30℃，120往复/分钟下震荡培养16小时。
(实施例2)用微生物细胞生产肽对实施例1中得到的培养液离心(10,000转/分钟(rpm)，15分钟)，收集微生物细胞，然后将其在含有10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中混悬至浓度为100g/L。在各1mL含有10mM EDTA、200mM下述羧基成分和400mM下述氨基酸的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，分别加入1ml该悬浮液，使总量至2mL，在18℃反应2小时。表1中显示了该反应结果所生成的肽。
表1

(对所有羧基成分均使用盐酸盐。)(实施例3)酶的纯化离心后的步骤在冰上或4℃实施。按照与实施例1相同的方法培养短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)，通过离心(10,000rpm，15分钟)收集微生物细胞。在用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤16g微生物细胞后，将其悬浮在40毫升(ml或mL)相同缓冲液中，然后以195瓦特进行超声裂解处理45分钟。然后离心该超声裂解液(10,000rpm，30分钟)以除去细胞碎片，得到超声裂解液上清。用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对该超声裂解液上清透析过夜，然后通过超速离心(50,000rpm，30分钟)除去不溶部分，从而得到上清液形式的可溶部分。将得到的可溶部分加入预先用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生产)中，然后从非吸附部分中收集活性部分。用50mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)对该活性部分透析过夜，然后通过离心(10,000rpm，30分钟)除去不溶部分从而得到上清液形式的透析的部分。然后将该透析的部分加入预先用50mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的Mono S柱(Amersham生产)中，以含有0-1M NaCl的相同缓冲液的线性浓度梯度洗脱酶。将活性部分中含有最低水平污染蛋白质的部分加入预先用含有1M NaCl的50mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的Superdex 200pg柱(Amersham产)中，通过使含有1M NaCl的相同缓冲液(pH 4.5)流经柱来实施凝胶过滤，得到活性部分溶液。上述操作的结果证实了，根据电泳的实验结果，本发明中所用的肽生成酶已被均匀地纯化。上述纯化步骤中的酶回收率为12.2％，纯化度为707倍。
(实施例4)检测酶的分子量(SDS-凝胶电泳)对通过实施例3的方法所得纯化的酶部分的0.3微克(μg)等效物进行聚丙烯酰胺电泳。将0.3％(w/v)Tris，1.44％(w/v)甘氨酸和0.1％(w/v)月桂硫酸钠用作电泳缓冲液，将具有10-20％凝胶浓度的浓度梯度的凝胶(Multigel 10-20，Daiichi Pure Chemicals生产)用作聚丙烯酰胺凝胶，将Pharmacia分子量标记物用作分子量标记物。电泳完成后，用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色，在约75千道尔顿(kDa)的分子量位置发现均一条带。
(凝胶过滤)将通过实施例3的方法所得纯化的酶部分加入预先用含有1M NaCl的50mM醋酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的Superdex 200pg柱(Amersham产)中，通过使含有1M NaCl的相同缓冲液(pH 4.5)流经柱来实施凝胶过滤从而检测分子量。将Pharmacia分子量标记物用作已知分子量的分子量标记物以制作校准曲线。结果，该酶的分子量为大约150kDa。
根据SDS-凝胶电泳和凝胶过滤的结果，提示该酶为具有约75kDa的分子量的同型二聚体。
(实施例5)酶反应的最适pH在由L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的反应中，检测pH的影响。将醋酸盐缓冲液(pH 3.9-5.4)，MES缓冲液(pH 5.4-6.4)，磷酸盐缓冲液(pH 6.0-7.9)，硼酸盐缓冲液(pH 7.8-9.3)，CAPS缓冲液(pH 9.3-10.7)，和K2HPO4-NaOH缓冲液(pH 10.8-11.6)用作缓冲液。将实施例3中得到的1微升(μl)Mono S酶部分(约180U/ml)加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的各缓冲液(100mM)中，使其在18℃反应5分钟，检测pH对反应的影响。图1中显示了通过将使用硼酸盐缓冲液(pH 9.3)时的值定为100％来表示的结果。结果，发现最适pH为8-9.5。
(实施例6)酶反应的最适温度在由L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的反应中，检测温度的影响。将1μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在各个温度下反应5分钟，检测温度对反应的影响。图2中显示了通过将在34℃下的活性值定为100％来表示的结果。结果，最适温度为30-40℃。
(实施例7)酶抑制剂采用L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺作为底物，来检测抑制剂对生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的影响。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入50μl含有10mM表2中所示的各个酶抑制剂的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应5分钟。注意，在使用前，将邻二氮杂菲，苯甲基磺酰氟和p-硝基苯基-p′-胍基苯甲酸酯溶于甲醇中，浓度为50mM。将不存在肽抑制剂时的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成值定为100，各条件下的酶活性以相对活性给出。结果如表2所示。结果，在所检测的丝氨酸酶抑制剂中，酶未被苯甲基磺酰氟化物抑制，但其被p-硝基苯基-p′-胍基苯甲酸酯抑制。
表2

(实施例8)由L-丙氨酸甲酯和L-谷氨酰胺生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺将3μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在18℃反应。结果如图3所示，在加入酶区中生成83mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)，副产物L-Ala-L-Ala-L-Gln的浓度为1.3mM。另一方面，在未加入酶区中几乎未观察到L-Ala-L-Gln的任何生成，而反应120分钟后酶浓度仅为大约0.07mM。
(实施例9)L-谷氨酰胺浓度对生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的影响将1μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐，表3中所示浓度的L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在18℃反应2小时。结果如表3所示。
表3

(实施例10)酶的底物特异性(1)在L-氨基酸酯用作羧基成分的情况下，检测酯特异性。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表4所示的羧基成分，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应2小时。表4中显示了该反应中L-Ala-L-Gln的生成量(表4中HCl代表盐酸)。
表4

(实施例11)酶的底物特异性(2)在L-丙氨酸甲酯用作羧基成分和多种L-氨基酸用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐，150mM表5所示L-氨基酸和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表5中显示了该反应中多种肽的生成量。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量，而“tr”表示痕量)。
表5

(实施例12)酶的底物特异性(3)在多种L-氨基酸甲酯用作羧基成分和L-谷氨酰胺用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表6中所示的L-氨基酸甲酯盐酸盐(AA-OMe·HCl)，150mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表6中显示了该反应中多种肽的生成量。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量，而“tr”表示痕量)。此外，在使用L-Trp-OMe和L-Tyr-Ome时，在反应系统中加入Tween-80至终浓度为0.1％。
表6

(对所有羧基成分均使用盐酸盐。)(实施例13)酶底物特异性(4)在多种L-氨基酸甲酯用作羧基成分和多种L-氨基酸用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表7中所示的L-氨基酸甲酯盐酸盐(AA-OMe·HCl)，150mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表7中显示了该反应中所生成的各肽的生成量。(“tr”表示痕量)。此外，在使用L-Trp-OMe时，在反应系统中加入Tween-80至终浓度为0.1％。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量)。
表7

(对所有羧基成分均使用盐酸盐。)
(实施例14)酶底物特异性(5)在L或D型多种氨基酸甲酯用作羧基成分以及L或D型多种氨基酸用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表8中所示的L-氨基酸甲酯盐酸盐(AA-OMe·HCl)，150mM表8中所示的多种氨基酸和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表8中显示了该反应中多种肽的生成量。(“tr”表示痕量)。
表8

(对所有羧基成分均使用盐酸盐。)
(实施例15)酶的底物特异性(6)在多种L-氨基酸酰胺用作羧基成分，和多种L-氨基酸用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表9中所示的L-氨基酸酰胺盐酸盐(AA-NH2·HCl)，150mM表9中所示的L-氨基酸和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表9中显示了该反应中多种肽的生成量。
表9

(实施例16)酶的底物特异性(7)在多种L-丙氨酸甲酯用作羧基成分和C保护的L-氨基酸用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表10中所示的L-丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)，150mM表10中所示的L-氨基酸酰胺盐酸盐和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表10中显示了该反应中多种肽的生成量。
表10

(实施例17)酶的底物特异性(8)在多种氨基酸甲酯用作羧基成分和甲胺用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μ1含有100mM表11中所示的L-氨基酸甲酯盐酸盐(AA-OMe·HCl)，150mM表11中所示的甲胺和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表11中显示了该反应中多种肽的生成量。
表11

(实施例18)酶的底物特异性(9)在β-氨基酸酯用作羧基成分和β-氨基酸用作胺成分的情况下，检测肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表12中所示的羧基成分，150mM表12中所示的胺成分和10mMEDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表12中显示了该反应中多种肽的生成量。(“tr”表示痕量)。
表12

对所有羧基成分均使用盐酸盐。
(实施例19)酶的底物特异性(10)在L-氨基酸酯用作羧基成分和肽用作胺成分的情况下，检测寡肽生成。将2μl与实施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表13中所示的羧基成分，150mM表13中所示的胺成分和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应3小时。表13中显示了该反应中多种肽的生成量。结果清楚地显示出本发明的酶不仅能生成二肽，还能通过将肽用作胺成分而生成长链肽。
如上述实施例9-20所示，由短稳杆菌菌株FERM BP-18545得到的本发明的酶被确定具有非常广泛的底物特异性。
表13

(*由于L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala的溶解度低，故在该反应系统中使用的羧基成分的浓度为10mM，使用的胺成分的浓度为15mM。其它条件与上述实施例中所描述的相同。对所有羧基成分均使用盐酸盐)(实施例20)与已知酶比较催化肽生成的能力将本发明的酶与已知酶比较催化肽生成的能力。EP 278787A1中所述羧肽酶Y和EP 359399B1中所述巯基内肽酶(无花果蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶)被用作已知酶，其以纯化的酶的形式进行使用(Sigma生产)。实施例3中均匀纯化的酶被用作本发明的酶的来源。将这些酶以表14所示的蛋白质的量加入反应系统中。将酶加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐和200mM L-谷氨酰胺的硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使所得物在25℃反应。注意，将所用的羧肽酶溶于含有1mM EDTA的10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中，而将所用的巯基内肽酶溶于含有2mM EDTA，0.1M KCl和5mM二硫苏糖醇的10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中。表14中显示了这些酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产率的比值。
结果，即使在没有酶的情况下也观察到极痕量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成，而与未加入酶的区相比，在加入羧肽酶或巯基内肽酶的区中观测到生产率的轻微增加。相反，在加入本发明的酶的区中观测到相对极高的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产率，该生产率比羧肽酶Y和巯基内肽酶的生产率高大约5,000-100,000倍。如上所述，本发明的酶被证实具有与先前技术中已知的酶不同的极高的肽生产率。此外，本发明的酶是具有约75,000的分子量的二聚体。相反，羧肽酶Y的分子量已被报道为大约61,000，而巯基内肽酶的分子量已被报道为大约23,000-36,000。因此，如实施例所示，与羧肽酶Y和巯基内肽酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产率相比，本发明的酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生存率即使在生产率用每摩尔重量表示时也高于其以每单位重量表示时的情况。
表14

(实施例21)用鞘氨醇杆菌sp.的微生物细胞生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在500ml坂口氏瓶中，加入50mL每升(L)含有5g葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g胨的培养基(pH 6.2)，在115℃灭菌15分钟用于培养鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)。然后在该培养基上接种1铂环细胞的已在每升(L)含有5g葡萄糖、10g酵母提取物、10g胨和5g NaCl的斜面琼脂培养基(琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养了24小时的鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)，然后在30℃，120往复/分钟下震荡培养20小时。然后将1ml该培养液加入上述培养基(50mL/500ml坂口氏瓶)，于30℃培养18小时。培养完成后，通过离心从培养液中分离微生物细胞，然后将其悬浮于含有10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，其浓度为100g/L，以湿微生物细胞计。然后在0.1ml该微生物细胞悬浮液中加入0.1ml含有10mM EDTA，200mM L-丙氨酰甲酯盐酸盐和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中。将0.2mL所得混合物在25℃反应120分钟。此时产生的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为62mM。
(实施例22)来自鞘氨醇杆菌sp.的酶的纯化离心后的以下步骤在冰上或4℃实施。按照与实施例21相同的方法培养鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)，通过离心(10,000rpm，15分钟)收集微生物细胞。用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)洗涤2g微生物细胞后，将其悬浮在8ml相同缓冲液中，然后以195W进行超声裂解处理45分钟。然后离心该超声裂解液(10,000rpm，30分钟)以除去细胞碎片，得到超声裂解液上清。用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)对该超声裂解液上清透析过夜，然后通过超速离心(50,000rpm，30分钟)除去不溶部分从而得到上清液形式的可溶部分。将得到的可溶部分加入预先用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生产)中，从非吸附部分中收集活性部分。用20mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)对该活性部分透析过夜，然后通过离心(10,000rpm，30分钟)除去不溶部分从而得到上清液形式的透析的部分。将该透析的部分加入预先用20mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)平衡的SP-Sepharose HP柱(Amersham生产)中，以含有0-1M NaCl的相同缓冲液的线性浓度梯度洗脱酶。
(实施例23)用酶部分生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺将10μl实施例22中纯化的SP-Sepharose HP部分(约27U/ml)加入90μl含有111nM L-丙氨酸甲酯盐酸盐，222mM L-谷氨酰胺和11mMEDTA的的111mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应120分钟。结果，在加入酶的区中生成73mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。另-方面，在未加入酶的区中几乎未观察到L-Ala-L-Gln的任何生成，而反应120分钟后酶浓度仅为大约0.07mM。
(实施例24)酶的底物特异性(11)检测源于鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)的酶的底物特异性。将100μl包含终浓度为100mM的表15-1至15-4所示多种羧基成分和终浓度为150mM的多种胺成分，实施例22中纯化的SP-Sepharose HP酶部分(反应液中加入0.33单位)和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)在25℃反应1.5小时。表15中显示了该反应中多种肽的生成量。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量，而“tr”表示痕量)。此外，在使用L-Tyr-Ome时，在反应系统中加入Tween-80至终浓度为0.1％。此外，对于所有羧基成分均使用盐酸盐。
表15-1

表15-2

表15-3

表15-4

对所有氨基酸酰胺均使用盐酸盐。
(实施例25)酶的底物特异性(12)检测源于鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)的酶的关于寡肽生成的底物特异性。将100μl包含终浓度为100mM的多种羧基成分和终浓度为150mM的表16中所示的多种胺成分，实施例22中纯化的SP-Sepharose HP酶部分(反应液中加入0.33单位)和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)在25℃反应1.5小时。表16中显示了该反应中各寡肽的生成量。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量，而“tr”表示痕量)。此外，对于所有羧基成分均使用盐酸盐。
表16

(实施例26)酶的底物特异性(13)采用与实施例5所使用的相同的酶部分进一步评价底物特异性。
表17

将100μl包含以表17所示终浓度的各羧基成分和胺成分以及10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)的反应溶液在25℃反应表17所示的反应时间。表17中显示了该反应中多种肽的生成量。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量，而“tr”表示痕量)。
(缩写)H-Ala-OmeL-丙氨酸甲酯盐酸盐H-p-F-Phe-Omep-氟-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐H-Cl-F-Phe-Omep-氯-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐H-p-NO2-Phe-Omep-硝基-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐H-t-Leu-Ome叔-L-亮氨酸甲酯盐酸盐H-2-Nal-OMe3-(2-萘基)-L-丙氨酸甲酯盐酸盐H-Aib-Omeα-氨基异丁酸甲酯盐酸盐H-N-Me-Ala-OMeN-甲基-L-丙氨酸甲酯盐酸盐H-CHA-Omeβ-环己基-L-丙氨酸甲酯盐酸盐H-Ser(tBu)-OmeO-叔丁基-L-丝氨酸甲酯盐酸盐H-Asp(OtBu)-OmeL-门冬氨酸β-叔丁基酯α-甲酯盐酸盐H-Lys(Boc)-OmeN-ε-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸甲酯盐酸盐H-p-F-Phe-OHp-氟-L-苯丙氨酸H-Cl-F-Phe-OHp-氯-L-苯丙氨酸H-p-NO2-Phe-OHp-硝基-L-苯丙氨酸H-t-Leu-OHtert-L-亮氨酸H-2-Nal-OH3-(2-萘基)-L-丙氨酸H-Gln-OHL-谷氨酰胺H-Phe-OHL-苯丙氨酸H-Ser(tBu)-OHO-叔丁基-L-丝氨酸H-Asp(OtBu)-OHL-门冬氨酸β-叔丁基酯H-Lys(Boc)-OHN-ε-叔-丁氧基羰基-L-赖氨酸(实施例27)酶的底物特异性(14)
采用与实施例5相同的酶部分(源于短稳杆菌)评估关于寡肽生成的底物特异性。将包含终浓度如表18中所示的各羧基成分和胺成分，酶(加入反应溶液中的单位数量如表18所示)和10mM EDTA的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)的100μl反应溶液在25℃反应3小时。表18中显示了该反应中多种寡肽的生成量。(标记“+”表示肽的生成得到证实但由于缺少标准而不能被定量，而“tr”表示痕量)。应当注意，对于所有羧基成分均使用盐酸盐。
表18

(实施例28)源于短稳杆菌的肽生成酶基因的分离以下，将描述了肽生成酶基因的分离。短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)被用作微生物。在基因的分离中，大肠杆菌JM-109被用作宿主，pUC118被用作载体。
(1)根据确定的氨基酸序列制备PCR引物基于，根据Edman氏分解法由赖氨酰内肽酶消化源于短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的肽生成酶得到的赖氨酰内肽酶消化产物所确定的氨基酸序列(SEQ ID NOs1和2)，分别制备具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中所示碱基序列的混合引物。
(2)微生物细胞的制备将短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)在CM2G琼脂培养基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化钠和20g/l琼脂，pH 7.0)上，于30℃培养24小时。在含有50ml CM2G液体培养基(除琼脂以外的上述培养基)的500ml坂口氏瓶中接种1铂环所得微生物细胞，然后在30℃振荡培养。
(3)从微生物细胞中制备染色体DNA首先，将50mL培养液离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集微生物细胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根据其说明书中所述步骤，从微生物细胞中获得染色体DNA。
(4)通过PCR制备含有肽生成酶基因的一部分的DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR方法，获得含有源于短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs3和4的碱基序列的引物，对源于短稳杆菌菌株FERMBP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的染色体DNA进行PCR。
采用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(Takara Shuzo生产)，按下述条件实施30个循环的PCR反应。
94℃30秒52℃1分钟72℃1分钟反应后，用3μl反应液进行0.8％琼脂糖电泳。结果，证实扩增的DNA片段为大约1.5千碱基(kb)。
(5)由基因文库克隆肽生成酶基因为了获得全长肽生成酶基因，采用在PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行Southern杂交。Molecular Cloning，2nd edition，ColdSpring Harbor Press(1989)中描述了Southern杂交的步骤。
由PCR步骤扩增的大约1.5kb DNA片段通过0.8％琼脂糖电泳进行分离。然后切下靶条带，纯化DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤，用探针地高辛(digoxinigen)标记DNA片段。
在用限制性酶HindIII在37℃反应16小时而完全消化本实施例28(3)的步骤(3)中所获得的短稳杆菌的染色体DNA后，将所得DNA在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA从琼脂糖凝胶上印迹在带正电的尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于50℃，对滤器预杂交1小时后，加入按上述制备的用地高辛标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用含有0.1％SDS的2×SSC于室温下洗涤滤器20分钟。此外，再通过0.1×SSC，65℃，15分钟，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤对与探针杂交的条带进行检测。结果，能够检测到与探针杂交的大约3kb的条带。
然后，用HindIII完全消化本实施例28(3)的步骤(3)中制备的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳，分离出大约4kb的DNA，然后采用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，然后将DNA溶于10μl TE中。然后将4μl该产物与pUC118 HindIII/BAP(Takara Shuzo生产)混合，采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl连接反应混合物和100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(Toyobo生产)从而转化大肠杆菌。然后将由此得到的转化体置于适宜的固体培养基上来产生染色体DNA文库。
为了获得全长的肽生成酶基因，采用上述探针，通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落杂交的步骤。
将染色体DNA文库的克隆转至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，(Roche Diagnostics生产))，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入上述用地高辛标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用含有0.1％SDS的2×SSC于室温下洗涤滤器20分钟。此外，再通过0.1×SSC，65℃，15分钟，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所描述的解释，对与标记的探针杂交的克隆进行检测。结果证实有两个克隆与标记的探针杂交。
(6)源于短稳杆菌的肽生成酶基因的碱基序列大肠杆菌JM109所含有的质粒由上述被证实与标记的探针杂交的两个克隆通过采用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega生产)制备，确定与探针发生杂交的部分和邻近部分的碱基序列。采用CEQ DTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤实施测序反应。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)实施电泳。
结果证实，编码包含肽生成酶的内部氨基酸序列(SEQ ID NOs1和2)的蛋白质的开放读码框确实存在。因此，开放读码框被确认为编码肽生成酶的基因。SEQ ID NO5中显示了全长肽生成酶基因的碱基序列以及相应的氨基酸序列。用BLASTP对所得开放读码框的同源性分析的结果显示，两种酶之间存在同源性；其显示出在氨基酸序列水平上与巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)的α-氨基酸酯水解酶具有34％的同源性(参见Appl.Environ.Microbiol.，68(1)，211-218(2002))，以及在氨基酸序列水平上与侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporum)的戊二酰-7ACA酰基转移酶具有26％的同源性(参见J.Bacteriol.，173(24)，7848-7855(1991))。
(实施例29)源于短稳杆菌的肽生成酶基因在大肠杆菌中的表达用SEQ ID NOs7和8中所述寡核苷酸作为引物，通过实施PCR来扩增大肠杆菌W3110的染色体DNA上色氨酸操纵子的启动子区上的靶基因区，将所得DNA片段连接至pGEM-Teasy载体(Promega生产)。然后在该连接液中转化大肠杆菌JM109，从氨苄西林抗性株中选择含有靶质粒的菌株，所述靶质粒中插入的trp启动子的插入方向与lac启动子的方向相反。然后，将通过用EcoO109I/EcoRI处理该质粒而得到的包含trp启动子的DNA片段与pUC19的Ec0O109I/EcoRI处理产物(Takara生产)连接。然后用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄西林抗性株中选择含有靶质粒的菌株。然后，将用HindIII/PvuII处理该质粒而得到的DNA片段与用HindIII/HincII处pKK223-3(Amersham Pharmacia生产)而得到的包含rrnB终止子的DNA片段相连接。然后用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄西林抗性菌株中选择含有靶质粒的菌株，将该质粒命名为pTrpT。
使用短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo No ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的染色体DNA作为模板，SEQ IDNO9和10中所示的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增靶基因。然后用NdeI/PstI处理该DNA片段，然后将所得DNA片段与pTrpT的NdeI/PstI处理产物连接。然后用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄西林抗性菌株中选择含有靶质粒的菌株，将该质粒命名为pTrpT_Gtg2。
将含有pTrpT_Gtg2的大肠杆菌JM109在含有100mg/l氨苄西林的LB培养基中，于30℃预培养24小时。将1ml所得培养液接种在含有50ml培养基(2g/l D葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁，和100mg/l氨苄西林)的500ml坂口氏瓶中，然后在25℃培养24小时。培养液的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性为0.44U/1ml培养液，证实大肠杆菌表达克隆的基因。此外，在作为对照的仅导入pTrpT的转化体中未发现活性。
(预测信号序列)当用Signal P v 1.1程序分析序列表中所述SEQ ID NO6的氨基酸序列时(参见Protein Engineering，Vol.12，No.1，pp.3-9，1999)，预测1-22位氨基酸发挥将肽分泌至周质中的信号功能，而估计成熟蛋白质位于23位氨基酸的下游。
(分泌的验证)
含有pTrpT_Gtg2的大肠杆菌JM109在含有100mg/l氨苄西林的LB培养基中，于30℃预培养24小时。将1ml所得培养液接种在含有50ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁，和100mg/l氨苄西林)的500ml坂口氏瓶中，然后在25℃最终培养24小时以获得微生物细胞。
在用20克/分升(g/dl)蔗糖溶液，通过渗透压冲击法裂解细胞后，将培养的微生物细胞分为周质部分和胞质部分。将浸20g/dl蔗糖溶液中的裂解的微生物细胞浸入5mM MgSO4水溶液中。将离心的上清命名为周质部分(“Pe”)。此外，将离心的沉淀物重悬，然后进行超声裂解。将该生成物命名为胞质部分(“Cy”)。将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(已知存在于胞质中)的活性用作证实胞质已被分开的指示物。通过，在包含1mM葡萄糖-6-磷酸，0.4mM NADP，10mM MgSO4，和50mMTris-Cl(pH 8)的反应液中加入适量的酶，在30℃下进行该检测，然后检测340nm吸光度从而检测NADPH的生成。
图4显示了当将分离制备的无细胞提取物的活性值定为100％时，周质部分和胞质部分中酶的量。在周质中未发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。这提示周质部分未混入胞质部分中。在周质中恢复了大约60％的Ala-Gln生成活性，正如采用Signal P v 1.1程序从氨基酸序列所预测出的，Ala-Gln生成酶被证实分泌至周质中。
(实施例30)用鞘氨醇杆菌sp.的微生物细胞生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在500ml坂口氏瓶中，加入50mL每升(L)含有5g葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g胨的培养基(pH 6.2)，在115℃灭菌15分钟用以培养鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)。然后在该培养基上接种1铂环已在每升(L)含有5g葡萄糖、10g酵母提取物、10g胨和5g NaCl的斜面琼脂培养基(琼脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培养了24小时的鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)的细胞，然后在30℃，120往复/分钟下震荡培养20小时。然后将1ml该培养液加入上述培养基(50mL/500ml坂口氏瓶)中，于30℃培养18小时。培养完成后，通过离心从培养液中分离微生物细胞，然后将其悬浮于含有10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，浓度为100g/L，以湿微生物细胞计。然后在0.1ml该微生物细胞悬浮液中加入0.1ml含有10mM EDTA、200mM L-丙氨酰甲酯盐酸盐和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)。将0.2mL所得混合物在25℃反应120分钟。此时产生的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为62mM。
(实施例31)来自鞘氨醇杆菌sp.的酶的纯化离心后的以下步骤在冰上或4℃实施。按照与实施例21相同的方法培养鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)，通过离心(10,000rpm，15分钟)收集微生物细胞。在用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)洗涤2g微生物细胞后，将其悬浮在8ml相同缓冲液中，然后以195W进行超声裂解处理45分钟。然后离心该超声裂解液(10,000rpm，30分钟)以除去细胞碎片，得到超声裂解液上清。用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)对该超声裂解液上清透析过夜，然后通过超速离心(50,000rpm，30分钟)除去不溶部分，从而得到上清液形式的可溶部分。将得到的可溶部分加入预先用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生产)中，然后从非吸附部分中收集活性部分。用20mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)对该活性部分透析过夜，然后通过离心(10,000rpm，30分钟)除去不溶部分，从而得到上清液形式的透析的部分。将该透析的部分加入预先用20mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)平衡的SP-Sepharose HP柱(Amersham生产)中，用含有0-1M NaCl的相同缓冲液的线性浓度梯度洗脱酶。
(实施例32)用活性部分生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺将10μl实施例31中纯化的SP-Sepharose HP部分(约27U/ml)加入90μl含有111mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐，222mM L-谷氨酰胺和11mMEDTA的的111mM硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，使其在25℃反应120分钟。结果，在加入酶的区中生成73mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。另一方面，在未加入酶的区中几乎未观察到L-Ala-L-Gln的任何生成，而反应120分钟后酶浓度仅为大约0.07mM。
(实施例33)源于鞘氨醇杆菌sp.的肽生成酶基因的分离下面描述了肽生成酶基因的分离，将鞘氨醇杆菌sp.菌株FERMBP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)用作微生物。采用大肠杆菌DH5α作为宿主，pUC118作为载体实施基因分离。
(1)微生物的制备将鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)在CM2G琼脂培养基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化钠和20g/l琼脂，pH7.0)上于25℃培养24小时。在含有50ml CM2G液体培养基(除琼脂以外的上述培养基)的500ml坂口氏瓶中接种1铂环所得微生物细胞，然后在25℃震荡培养。
(2)从微生物细胞中制备染色体DNA对50ml培养液进行离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集微生物细胞。然后采用Qiagen Genomic-Tip System(Qiagen)从微生物细胞中获得染色体DNA。
(3)通过PCR制备探针DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR方法得到包含源于短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的肽生成酶基因一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs3和4的碱基序列的引物，对获自短稳杆菌菌株FERMBP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 1-Chome，Japan，国际保藏转送日期2002年7月8日)的染色体DNA实施PCR反应。
采用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(Takara Shuzo生产)，按下述条件实施30个循环的PCR反应。
94℃30秒52℃1分钟72℃1分钟反应后，用3μl反应混合物进行0.8％琼脂糖电泳。结果证实扩增的DNA片段为大约1.5kb。
(4)由基因文库克隆肽生成酶基因为了获得全长肽生成酶基因，采用在PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行Southern杂交。Molecular Cloning，2nd edition，ColdSpring Harbor Press(1989)中描述了Southern杂交的步骤。
由PCR步骤扩增的大约1.5kb DNA片段通过0.8％琼脂糖电泳进行分离。然后切下靶条带，纯化DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤，用探针地高辛标记DNA片段。
在用限制性酶SacI在37℃反应16小时而完全消化本实施例33的步骤(2)中所获得的鞘氨醇杆菌sp.的染色体DNA后，对其进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA从琼脂糖凝胶上印迹在带正电的尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入按上述制备的用地高辛标记的探针，于37℃杂交16小时。随后，用含有0.1％SDS的2×SSC于室温下洗涤滤器20分钟。此外，再用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤对与探针杂交的条带进行检测。结果，能够检测到与探针杂交的大约3kb的条带。
然后，用Sac I完全消化本实施例33的步骤(2)中制备的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离大约3kb的DNA，然后采用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，然后将DNA溶于10μl TE中。然后将4μl该产物与SacI在37℃下，反应16小时，以便完全消化，将其与已用碱性磷酸酶(大肠杆菌C75)处理的pUC118混合，37℃，30分钟和50℃，30分钟，采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Shuzo生产)从而转化大肠杆菌。然后将由此得到的转化体置于适宜的固体培养基上来产生染色体DNA文库。
为了获得全长的肽生成酶基因，采用上述探针，通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落杂交的步骤。
将染色体DNA文库的克隆转至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，(Roche Diagnostics生产))，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入上述用地高辛标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所描述的解释，对与标记的探针杂交的克隆进行检测。结果，证实有6株克隆与标记的探针杂交。
(5)源于鞘氨醇杆菌sp.的肽生成酶基因的碱基序列采用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega生产)从已被证实与标记的探针杂交的上述六株微生物细胞中制备大肠杆菌DH5α所含有的质粒，从而确定与探针杂交的邻近碱基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤实施测序反应。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)实施电泳。
结果，发现存在编码肽生成酶的开放读码框。SEQ ID NO11中显示了源于鞘氨醇杆菌sp.的全长肽生成酶基因的碱基序列以及相应的氨基酸序列。源于鞘氨醇杆菌sp.的肽生成酶在氨基酸序列水平上与源于上述短稳杆菌的肽生成酶具有63.5％的同源性(如BLASTP程序检测所示)。
(实施例34)源于鞘氨醇杆菌sp.的肽生成酶基因在大肠杆菌的表达采用鞘氨醇杆菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日期2002年7月22日)的染色体DNA作为模板，SEQ ID NOs13和14中所述寡核苷酸作为引物实施PCR，扩增靶基因。用NdeI/XbaI处理该DNA片段，将得到的DNA片段与pTrpT的NdeI/XbaI处理产物连接。然后用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄西林抗性株中选择含有靶质粒的菌株，将该质粒命名为pTrpT_Sm_aet。
通过将一铂环的菌株细胞接种在含有3ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁，和100mg/l氨苄西林)的普通试管中的方式，将含有pTrpT_Sm_aet的大肠杆菌JM109在25℃培养20小时。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性为2.1U/1ml培养液的克隆的基因被证实由大肠杆菌表达。此外，在作为对照的仅导入pTrpT的转化体中未发现活性。
(预测信号序列)当用Signal P v 1.1程序分析序列表中所述SEQ ID NO12的氨基酸序列时(参见Protein Engineering，Vol.12，No.1，pp.3-9，1999)，预测1-20位氨基酸发挥将肽分泌至周质中的信号功能，而估计成熟蛋白质位于21位氨基酸的下游。
(信号序列的证实)通过将一铂环的菌株细胞接种在含有50ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁，和100mg/l氨苄西林)的普通试管中的方式，将含有pTrpT_Sm_aet的大肠杆菌JM109在25℃培养20小时。
离心后的以下步骤在冰上或4℃实施。培养完成后，通过离心从培养液中分离微生物细胞，用100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)洗涤后，将其悬浮于相同的缓冲液中。然后对该微生物细胞以195W进行超声裂解处理20分钟，然后离心该超声裂解液(12,000rpm，30分钟)以除去细胞碎片，得到可溶部分。将得到的可溶部分加入预先用100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)平衡的CHT-II柱(Biorad生产)中，用500mM磷酸缓冲液以线性浓度梯度洗脱酶。将混合活性部分和5倍体积的2M硫酸铵以及100mM磷酸盐缓冲液而得到的溶液，加入预先用2M硫酸铵和100mM磷酸缓冲液平衡的Resource-PHE柱(Amersham)中，用0-2M硫酸铵以线性浓度梯度洗脱酶，从而得到活性部分溶液。根据这些步骤的结果，证实了通过电泳的方式将肽生成酶均匀地纯化。
当通过Edman氏分解法确定上述肽生成酶的氨基酸序列时，得到SEQ ID NO15的氨基酸序列，如通过Signal P v 1.1程序所预测的，成熟蛋白质被证实位于21位氨基酸的下游。
(实施例35)源于解肝磷脂土地杆菌IFO 12017的肽生成酶基因的分离以下，将描述肽生成酶基因的分离。所用微生物为解肝磷脂土地杆菌菌株IFO 12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)。在基因分离中，将大肠杆菌JM-109用作宿主，而将pUC118用作载体。
(1)微生物的制备将解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)在CM2G琼脂培养基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化钠和20g/l琼脂，pH 7.0)上，于25℃培养24小时。在含有50ml CM2G液体培养基(除琼脂以外的上述培养基)的500ml坂口氏瓶中接种1铂环所得微生物细胞，然后在25℃震荡培养。
(2)从微生物细胞中制备染色体DNA
将50mL培养液离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集微生物细胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip Sys tem(Qiagen)，根据其说明书中所述步骤，从微生物细胞中获得染色体DNA。
(3)通过PCR制备探针DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR方法，获得含有源于解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs15和16的碱基序列的引物，对获自解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色体DNA进行PCR。由PCR扩增的大约1kb DNA片段通过0.8％琼脂糖电泳进行分离。然后切下靶条带，纯化得到的DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤，用探针地高辛标记该DNA片段。
(4)由基因文库克隆肽生成酶基因为了获得全长肽生成酶基因，采用上述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行Southern杂交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern杂交的步骤。
通过用限制性酶HindIII于37℃反应16小时而完全消化解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色体DNA后，对其进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA从琼脂糖凝胶上印迹在带正电的尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。于50℃，对滤器预杂交1小时后，加入按上述制备的用地高辛标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤对与探针杂交的条带进行检测。结果，能够检测到与探针杂交的大约5kb的条带。
然后，用HindIII完全消化解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离大约5kb的DNA，然后采用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，然后将其溶于10μl TE中。然后将4μl该产物与pUC118 HindIII/BAP(Takara Shuzo生产)混合，采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109(Takara Shuzo生产)，从而转化大肠杆菌。然后将由此得到的转化体置于适宜的固体培养基上来产生染色体DNA文库。
为了获得全长的肽生成酶基因，采用上述探针，通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落杂交的步骤。
将染色体DNA文库的克隆转至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，(Roche Diagnostics生产))，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入上述用地高辛标记的探针，于37℃杂交16小时。随后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所描述的解释对与标记的探针杂交的克隆进行检测。结果，证实有1株克隆与标记的探针杂交。
(5)源于解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017的肽生成酶基因的碱基序列大肠杆菌JM109所含有的质粒由上述被证实与标记的探针杂交的微生物细胞菌株制备，确定与探针发生杂交的邻近碱基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤实施测序反应。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)实施电泳。
结果，发现存在编码肽生成酶的开放读码框。序列表中的SEQ IDNO17中显示了源于解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的全长肽生成酶基因的碱基序列，以及相应的氨基酸序列。
(实施例36)源于解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017的肽生成酶基因在大肠杆菌中的表达使用解肝磷脂土地杆菌菌株IFO-12017(保藏机构发酵研究所，Osaka，保藏机构地址2-17-85Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO19和20中所示的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增靶基因。然后用NdeI/HindIII处理该DNA片段，然后将所得DNA片段与pTrpT的NdeI/HindIII处理产物连接。然后用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄西林抗性菌株中选择含有靶质粒的菌株，将该质粒命名为pTrpT_Ph_aet。
通过将一铂环的菌株细胞接种在含有3ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁，和100mg/l氨苄西林)的普通试管中的方式，将含有pTrpT_Ph_aet的大肠杆菌JM109在25℃培养20小时。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性为0.3U/1ml培养液的克隆的基因被证实由大肠杆菌表达。此外，在作为对照的仅导入pTrpT的转化体中未发现活性。
(实施例37)来自Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ11116的肽生成酶基因的分离以下，将描述肽生成酶基因的分离。所使用的微生物是Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏机构DeutcheSammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)。在基因分离中，将大肠杆菌JM-109用作宿主，而将pUC118用作载体。
(1)微生物的制备将Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏机构Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg1b，38124Braunschweig，Germany)在CM2G琼脂培养基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化钠和20g/l琼脂，pH 7.0)上于25℃培养24小时。在含有50ml CM2G液体培养基(除琼脂外的上述培养基)的500ml坂口氏瓶中接种1铂环所得微生物细胞，然后在25℃震荡培养。
(2)从微生物细胞中制备染色体DNA对50mL培养液进行离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集微生物细胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根据其说明书中所述步骤，从微生物细胞中获得染色体DNA。
(3)通过PCR制备探针DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR方法，获得含有源于Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏机构Deutche Sammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg1b，38124Braunschweig，Germany)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs21和16的碱基序列的引物，对获自Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏机构Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg1b，38124Braunschweig，Germany)的染色体DNA进行PCR。将由PCR扩增的大约1kb DNA片段通过0.8％琼脂糖电泳进行分离。然后切下靶条带，纯化得到的DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤，用探针地高辛标记该DNA片段。
(4)从基因文库克隆肽生成酶基因为了获得全长肽生成酶基因，采用上述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行Southern杂交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern杂交的步骤。
在用限制性酶PstI在37℃反应16小时而完全消化Taxeobactergelupurpurascens菌株DSMZ11116(保藏机构Deutche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)的染色体DNA后，对其进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA从琼脂糖凝胶上印迹在带正电的尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。于50℃，对滤器预杂交1小时后，加入按上述制备的用地高辛标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤对与探针杂交的条带进行检测。结果，能够检测到与探针杂交的大约5kb的条带。
用HindIII完全消化Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ11116(保藏机构Deutche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离大约5kb的DNA，然后采用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将其溶于10μl TE中。然后将4μl该产物与pUC118 PstI/BAP(Takara Shuzo生产)混合，采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109(Takara Shuzo生产)而转化大肠杆菌。然后将由此得到的转化体置于适宜的固体培养基上来产生染色体DNA文库。
为了获得全长的肽生成酶基因，采用上述探针，通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落杂交的步骤。
将染色体DNA文库的克隆转至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，(Roche Diagnostics生产))，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入上述用地高辛标记的探针，于37℃杂交16小时。随后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗涤滤器两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所描述的解释对与标记的探针杂交的克隆进行检测。结果，证实有1株克隆与标记的探针杂交。
(5)源于Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116的肽生成酶基因的碱基序列大肠杆菌JM109所含有的质粒由上述被证实与标记的探针杂交的微生物细胞菌株制备，确定与探针发生杂交的邻近碱基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤实施测序反应。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)实施电泳。
结果，发现存在编码肽生成酶的开放读码框。序列表中的SEQ IDNO22中显示了源于Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏机构Deutche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)的全长肽生成酶基因的碱基序列，以及相应的氨基酸序列。
(实施例38)源于海圆杆菌菌株ATCC 25205的肽生成酶基因的分离以下，将描述肽生成酶基因的分离。所用的微生物为海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)。在基因分离中，将大肠杆菌JM-109用作宿主，而将pUC118用作载体。
(1)微生物细胞的制备将海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)在CM2G琼脂培养基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化钠和20g/l琼脂，pH 7.0)上，于25℃培养24小时。在含有50ml CM2G液体培养基(除琼脂以外的上述培养基)的500ml坂口氏瓶中接种1铂环所得微生物细胞，然后在25℃震荡培养。
(2)从微生物细胞中制备染色体DNA对50mL培养液进行离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集微生物细胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根据其说明书中所述步骤，从微生物细胞中获得染色体DNA。
(3)通过PCR制备探针DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR方法，获得含有源于海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United Statesof America)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQID NOs15和16的碱基序列的引物，对获自海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色体DNA进行PCR。由PCR扩增的大约1kb DNA片段通过0.8％琼脂糖电泳进行分离。然后切下靶条带，纯化得到的DNA片段。采用DIG HighPrime(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤，用探针地高辛标记该DNA片段。
(4)由基因文库克隆肽生成酶基因为了获得全长肽生成酶基因，采用上述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行Southern杂交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern杂交的步骤。
在用限制性酶HincII在37℃反应16小时而完全消化海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色体DNA后，对其分别实施0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA从琼脂糖凝胶上印迹在带正电的尼龙滤膜(RocheDiagnostics生产)，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。于50℃，对滤器预杂交1小时后，加入按上述制备的用地高辛标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤对与探针杂交的条带进行检测。结果，在PstI消化产物中检测到与探针杂交的大约7k的条带，而在HincII消化产物中检测到与探针杂交的大约2k的条带。
用PstI或HincII完全消化海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离出大约7kb或2kb的DNA，然后采用Gene CleanII试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将其溶于10μl TE中。然后将4μl该产物与pUC118 PstI/BAP(Takara Shuzo生产)或pUC118HincII/BAP(Takara Shuzo生产)混合，采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。分别混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109(Takara Shuzo生产)而转化大肠杆菌。然后将由此得到的转化体置于适宜的固体培养基上来产生染色体DNA文库。
为了获得全长的肽生成酶基因，采用上述探针，通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落杂交的步骤。
将染色体DNA文库的克隆转至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，(Roche Diagnostics生产))，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入上述用地高辛标记的探针，于37℃杂交16小时。随后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所描述的解释对与标记的探针杂交的克隆进行检测。结果，证实有1株克隆与标记的探针杂交。
(5)源于海圆杆菌菌株ATCC 25205的肽生成酶基因的碱基序列大肠杆菌JM109所含有的质粒由上述被证实与标记的探针杂交的微生物细胞菌株制备，确定与探针发生杂交的邻近碱基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤实施测序反应。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)实施电泳。
结果，发现存在编码肽生成酶的开放读码框。序列表中的SEQ IDNO24中显示了源于海圆杆菌菌株ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)的全长肽生成酶基因的碱基序列，以及相应的氨基酸序列。
(实施例39)源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359的肽生成酶基因的分离以下，将描述肽生成酶基因的分离。所用微生物为Psycloserpensburtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)。在分离基因中，将大肠杆菌JM-109用作宿主，而pUC118用作载体。
(1)微生物的制备将Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)在CM2G琼脂培养基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化钠和20g/l琼脂，pH 7.0)上于10℃培养24小时。在含有50ml CM2G液体培养基(除琼脂以外的上述培养基)的500ml坂口氏瓶中接种1铂环所得微生物细胞，然后在10℃震荡培养。
(2)从微生物细胞中制备染色体DNA对50mL培养液进行离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集微生物细胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根据其说明书中所述步骤，从微生物细胞中获得染色体DNA。
(3)通过PCR制备探针DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR方法，获得含有源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs15和16的碱基序列的引物，对获自Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色体DNA进行PCR。由PCR扩增的大约1kb DNA片段通过0.8％琼脂糖电泳进行分离。然后切下靶条带，纯化得到的DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤，用探针地高辛标记该DNA片段。
(4)由基因文库克隆肽生成酶基因为了获得全长肽生成酶基因，采用在上述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行Southern杂交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern杂交的步骤。
在用限制性酶EcoRI在37℃反应16小时而完全消化Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)的染色体DNA后，对其进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA从琼脂糖凝胶上印迹在带正电的尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。于50℃，对滤器预杂交1小时后，加入按上述制备的用标记的探针，于50℃杂交16小时。随后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗涤两次。
采用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据试剂盒的说明书中所述步骤对与探针杂交的条带进行检测。结果，能够检测到与探针杂交的大约7kb的条带。
用EcoRI完全消化Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离大约7kb的DNA，然后采用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将其溶于10μl TE中。然后将4μl该产物与pUC118 EcoRI/BAP(Takara Shuzo生产)混合，采用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109(Takara Shuzo生产)而转化大肠杆菌。然后将由此得到的转化体置于适宜的固体培养基上来产生染色体DNA文库。
为了获得全长的肽生成酶基因，采用上述探针，通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落杂交的步骤。
将染色体DNA文库的克隆转至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，(Roche Diagnostics生产))，然后进行包括碱变性、中和和固定的处理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)实施杂交。于37℃，对滤器预杂交1小时后，加入上述用地高辛标记的探针，于37℃杂交16小时。随后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗涤两次。
采用DIG Nucleotide Detection Kit(Boehringer-Mannheim生产)，根据说明书检测与标记的探针杂交的克隆。结果，证实1株克隆与标记的探针杂交。
(5)源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359的肽生成酶基因的碱基序列大肠杆菌JM109所含有的质粒由上述被证实与标记的探针杂交的微生物细胞菌株制备，确定与探针发生杂交的邻近碱基序列。根据说明书所述步骤，采用CEQ DTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生产)进行测序反应。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)实施电泳。
结果，发现存在编码肽生成酶的开放读码框。序列表中的SEQ IDNO26中显示了源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的全长肽生成酶基因的碱基序列，以及相应的氨基酸序列。
工业上的可应用性根据本发明，提供了通过减少诸如引入和消除保护基的复杂合成方法，而能够容易地、高产率地和廉价地生产肽的新型酶。使用本发明的酶能够实现肽的有效率的工业生产。
序列表<110>AJINOMOTO CO.，LTD.
<120>新型肽生成酶基因<130>PAMA-15377，PAMA-03030<150>JP2002-218957<151>2002-07-26<150>JP2003-016765<151>2003-01-24<160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>短稳秆菌<220>
<223>InventorHARA，SeiichiInventorYOKOZEKI，KenzoInventorABE，IsaoInventorTONOUCHI，NaotoInventorJOJIMA，Yasuko<400>1Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>短稳秆菌<400>2Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp1 5
<210>3<211>20<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述合成引物1<400>3ttyacngcna thtaycarcc 20<210>4<211>23<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述合成引物2<400>4tcnggcatng trtangtnac rtt 23<210>5<211>2024<212>DNA<213>短稳秆菌<220>
<221>CDS<222>(61)..(1908)<223>编码肽合成酶的基因<400>5atttcttaat aaaaactgaa atcttaatac atttatacta tcgtaaaatt tattgaacac 60gtg aaa aaa tta aca tta aaa gta act cta ctt aca ctt ttg ttg gga 108Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15
agt aca gtt gga ttt gcg caa gat gca aaa gca gat tct gct tat gtg156Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30cgc gac aat tac gaa aaa ata gaa caa gta att ccg atg cgc gat ggt204Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45aca aag tta ttt aca gct att tat cag cca aaa gat aaa aca aaa caa252Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60tat ccc gtt ttg tta aat cgt acg cct tat aca gtt gcg cct tat ggt300Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly65 70 75 80gta aat gaa tac aag aaa tcg tta gga aat ttt cct aca gaa atg cgc348Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95gaa ggt ttt att ttt gtt tac caa gat gtg aga gga aaa tgg atg agc396Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser100 105 110gaa ggc gaa ttt gaa gat gtt cga cct ata aat cct tca aaa agt aaa444Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys115 120 125aag gca att gac gaa agc aca gat aca ttt gat acg cta gaa tgg ctt492Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu130 135 140gct aaa aac ttg aag aat tac acg aaa aaa gct gga att tat gga att540Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile145 150 155 160tcg tat cct ggt ttt tat tcg aca atg agt ttg gtt aat tcg cat cca588Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro165 170 175act cta aaa gcc gtt tcg cca caa gcg ccc gtt acc aat tgg ttt tta636Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu180 185 190
ggt gac gat ttt cat cat aat gga gtt tta ttc ttg aat gat tct ttc684Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe195 200 205tca ttt atg act ttt ttt ggt gta aaa cgt ccg caa cca att acg cca732Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Val Lys Arg Pro Gln Pro Ile Thr Pro210 215 220gat aaa ggt ccg aaa cgt ttt gaa tat cca ata aaa gat aat tat aga780Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg225 230 235 240ttt tat gca agt ggc tct gta aaa gag ttg aaa gat aaa tat ttg caa828Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gln245 250 255gat aat atc aag ttt tac aat gat tta ttt gcg cat cca gat tac gat876Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp260 265 270caa ttt tgg caa gat cgt aat gtt tta cca cat tta act aac gtg caa924Gln Phe Trp Gln Asp Arg Asn Val Leu Pro His Leu Thr Asn Val Gln275 280 285cct gct gta atg acg gtt gga ggt ttt ttt gat gca gaa gat gtc tac972Pro Ala Val Met Thr Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr290 295 300ggc gct ttc gaa acg tat aaa gca att gag aaa caa aat ccg aaa gca1020Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gln Asn Pro Lys Ala305 310 315 320aca aat att atg gtt gcc gga cct tgg ttt cat ggt ggt tgg gtt cgt1068Thr Asn Ile Met Val Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Val Arg325 330 335agc aac gga agt act ttt gga gat atg caa ttt gca tcg aat aca agt1116Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gln Phe Ala Ser Asn Thr Ser340 345 350gag cat tat cag caa gaa ata gaa ttg cct ttt ttt aat tat tac tta1164Glu His Tyr Gln Gln Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu355 360 365
aaa gat aaa ggt aat ttt aaa cca acc gaa gct aca att ttt att acg1212Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr370 375 380gga tct aac gaa tgg aaa caa ttt gat gct tgg cca cca aaa aat gta1260Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gln Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Val385 390 395 400aca aca caa aaa att tat ttg caa caa aat ggt aaa ata gct ttt aat1308Thr Thr Gln Lys Ile Tyr Leu Gln Gln Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn405 410 415aaa acc aat aca aca act act ttt gac gaa tat gtt gca gat cca aat1356Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn420 425 430tct cca gtt cct tat tca gga gga gtt tta gaa act cgt tca aga gaa1404Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu435 440 445tat atg gtc gat gat caa cgc ttt gct tct act cgt cct gat gtt atg1452Tyr Met Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met450 455 460gtg tat caa tct gat att ttg aca gaa gat att acg ctt gct ggt cct1500Val Tyr Gln Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro465 470 475 480gtt atc aat cat tta gtg gtt tct act acg gga aca gac gct gat tat1548Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr485 490 495gtt gta aaa ttg att gat gtt tat cct gaa aac acg cca aaa ttt aat1596Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn500 505 510aac aaa tta atg gct gga tat caa aat ttg att cgt gca gaa att atg1644Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gln Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met515 520 525cgc gga aaa tat aga aat agt ttc tct aac ccc gaa gct atg gtt ccg1692Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro530 535 540
aat aaa gaa aca aat gta acg tac acg atg cca gat gtt gga cat aca 1740Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr545 550 555 560ttt aag aaa gga cat cgc att atg att caa gtt cag aac agt tgg ttt 1788Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe565 570 575cct tta gca gat cgc aat ccg caa caa ttt atg aat gtt tac gaa gca 1836Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gln Gln Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala580 585 590act tct aaa gat tat tta aaa caa acg caa cga att tat cat act tct 1884Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Thr Gln Arg Ile Tyr His Thr Ser595 600 605tat atc gaa att ccg gta ttg aaa taacaaaaaa atccagctaa ttagctggat 1938Tyr Ile Glu Ile Pro Val Leu Lys610 615tttttttata atgttacttt tcctattttt cctttatttc caactaaaat tacatatttt 1998ttatcgggcg aaaccgtaca agtatg 2024<210>6<211>616<212>PRT<213>短稳秆菌<400>6Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly
65 70 75 80Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser100 105 110Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys115 120 125Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu130 135 140Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile145 150 155 160Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro165 170 175Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu180 185 190Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe195 200 205Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Val Lys Arg Pro Gln Pro Ile Thr Pro210 215 220Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg225 230 235 240Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gln245 250 255Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp260 265 270Gln Phe Trp Gln Asp Arg Asn Val Leu Pro His Leu Thr Asn Val Gln275 280 285Pro Ala Val Met Thr Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr290 295 300
Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gln Asn Pro Lys Ala305 310 315 320Thr Asn Ile Met Val Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Val Arg325 330 335Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gln Phe Ala Ser Asn Thr Ser340 345 350Glu His Tyr Gln Gln Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu355 360 365Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr370 375 380Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gln Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Val385 390 395 400Thr Thr Gln Lys Ile Tyr Leu Gln Gln Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn405 410 415Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn420 425 430Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu435 440 445Tyr Met Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met450 455 460Val Tyr Gln Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro465 470 475 480Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr485 490 495Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn500 505 510Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gln Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met515 520 525Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro530 535 540
Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr545 550 555 560Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe565 570 575Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gln Gln Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala580 585 590Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Thr Gln Arg Ile Tyr His Thr Ser595 600 605Tyr Ile Glu Ile Pro Val Leu Lys610 615<210>7<211>40<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述为制备pTrpT的合成引物<400>7gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40<210>8<211>40<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述为制备pTrpT的合成引物<400>8ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40
<210>9<21l>38<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述为制备pTrpT_Gtg2的合成引物<400>9gggaattcca tatgaaaaaa ttaacattaa aagtaact 38<210>l0<211>36<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述为制备pTrpT_Gtg2的合成引物<400>10gggggctgca gtacttgtac ggtttcgccc gataaa 36<210>11<211>1935<212>DNA<213>鞘氨醇杆菌sp.
<220>
<221>CDS<222>(61)..(1917)<223>肽合成酶基因<400>11gaaaccaagt gtaaaattat aatttacacc aaagaatgta ctgaacaaat aattatctga 60atg aaa aat aca att tcg tgc cta act tta gcg ctt tta agc gca agc 108Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1 5 10 15cag tta cat gct caa aca gct gcc gac tcg gct tat gtt aga gat cat 156
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权利要求
1.编码选自(A)和(M)的蛋白质的DNA，其中所述蛋白质具有如下定义的氨基酸序列(A)由SEQ ID NO6的23-616位氨基酸残基组成的氨基酸序列，或(M)由SEQ ID NO6组成的氨基酸序列。
2.一种包含根据权利要求1的DNA的重组DNA。
3.一种包含根据权利要求2的重组DNA的转化细胞。
4.一种生产肽生成酶的方法，包括在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求3的转化细胞一段时期，和在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
5.一种生产二肽的方法，包括在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求3的转化细胞一段时期，和将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
6.根据权利要求5的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
7.根据权利要求5或6的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的。
8.根据权利要求5或6的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
9.编码选自(B)和(N)的蛋白质的DNA，其中所述蛋白质具有如下定义的氨基酸序列(B)在SEQ ID NO6的23-616位氨基酸残基中，置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的，且在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO6的23-616位无突变的氨基酸残基所对应的蛋白质的至少50％的肽生成活性的氨基酸序列，或(N)成熟蛋白质区，其具有在SEQ ID NO6的氨基酸序列中，包括置换、缺失、插入、添加，和/或倒位一个或多个氨基酸所得的的氨基酸序列，且其在50℃和pH 8下，具有无突变的SEQ ID NO6所对应的蛋白质的至少50％的肽生成活性。
10.根据权利要求9的DNA，其中所述多个是2-50个氨基酸残基。
11.一种包含根据权利要求9的DNA的重组DNA。
12.一种包含根据权利要求11的重组DNA的转化细胞。
13.一种生产肽生成酶的方法，包括在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求12的转化细胞一段时期，和在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
14.一种生产二肽的方法，包括在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求12的转化细胞一段时期，和将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
15.根据权利要求14的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
16.根据权利要求14或15的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的。
17.根据权利要求14或15的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
18.选自(a)和(m)的DNA，其中所述DNA具有如下定义的碱基序列(a)由SEQ ID NO5的127-1908位碱基组成的碱基序列，或(m)由SEQ ID NO5的61-1908位碱基组成的碱基序列。
19.一种包含根据权利要求18的DNA的重组DNA。
20.一种包含根据权利要求19的重组DNA的转化细胞。
21.一种生产肽生成酶的方法，包括在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求20的转化细胞一段时期，和在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
22.一种生产二肽的方法，包括在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求20的转化细胞一段时期，和将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
23.根据权利要求22的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
24.根据权利要求22或23的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的.
25.根据权利要求22或23的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
26.选自(b)和(n)的DNA，其中所述DNA具有如下定义的碱基序列(b)在严紧条件下，与具有与SEQ ID NO5的127-1908位碱基的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的，且编码在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO5的127-1908位无突变的碱基所编码的蛋白质的至少50％的肽生成活性的蛋白质的碱基序列，或(n)在严紧条件下，与具有与SEQ ID NO5的61-1908位碱基的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的，且编码在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO5的61-1908位无突变的碱基所编码的蛋白质的至少50％的肽生成活性的蛋白质的碱基序列。
27.一种包含根据权利要求26的DNA的重组DNA。
28.一种包含根据权利要求27的重组DNA的转化细胞。
29.一种生产肽生成酶的方法，包括在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求28的转化细胞一段时期，和在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
30.制备二肽的方法，包括在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求28的转化细胞一段时期，和将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化作用，来合成二肽。
31.根据权利要求30的生产二肽的方法，其中所述细胞是属于鞘氨醇杆菌属的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
32.根据权利要求30或31的生产二肽的方法，其中所述细胞是从所述培养物中分离的。
33.根据权利要求30或31的生产二肽的方法，其中所述细胞是经处理的微生物细胞产物。
34.根据权利要求26的DNA，其中严紧条件是在相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下，于60℃进行洗涤的条件。
35.一种包含根据权利要求34的DNA的重组DNA。
36.一种包含根据权利要求35的重组DNA的转化细胞。
37.一种生产肽生成酶的方法，包括在培养基中，在适于生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求36的转化细胞一段时期，和在培养基和/或转化细胞中累积肽生成酶。
38.制备二肽的方法，包括在培养基中，在适于在培养物中生产肽生成酶的条件下，培养根据权利要求36的转化细胞一段时期，和将培养物与羧基成分和胺成分混合，通过由所述DNA所编码的肽生成酶所促进的酶催化，来合成二肽。
全文摘要
本发明涉及不必通过复杂的合成方法即可容易地、廉价地和高产率地生产肽的新型酶。更具体地，本发明提供了催化由羧基成分和胺成分的肽合成反应的新型酶，产生该酶的微生物，和采用该酶或该微生物的廉价的二肽生产方法。本发明揭示了能从稳杆菌属新发现的细菌中有效合成肽的新型酶，且揭示了简易且廉价的生产二肽的方法。
文档编号C12N1/21GK101067124SQ200710093669
公开日2007年11月7日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年7月26日
发明者原诚一, 横关健三, 阿部巧, 外内尚人, 城岛恭子 申请人:味之素株式会社