专利名称：一种定量检测轮状病毒的方法及其专用标准品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测轮状病毒的方法及其专用标准品。
背景技术：
轮状病毒是全世界范围内人和动物急性腹泻的主要致病微生物之一。其中A组轮状病毒是导致世界范围内严重的儿童急性胃肠炎最重要的原因，每年达到600,000-800,000的致死率(Umesh，D.P.，Joseph，S.B.，Jon，R.G.，Roger，I.G.，1998.Rotavirus.Emerg.Infect.Dis.4(4)，561-570)；近年的研究资料表明，我国秋冬季节50％～60％的婴幼儿腹泻由轮状病毒引起(常汝需，何翠娟.腹泻患儿粪便标本中轮状病毒检测方法比较[J].中华儿科杂志，2000，38(11)703～704)。轮状病毒是一种双链RNA病毒，由11个基因组片段组成，它的核心部分是由70nm直径的双层衣壳组成。该病毒的内壳具有四个结构蛋白(VP1，VP2，VP3和VP6)，而外壳具有两个结构蛋白(VP4和VP7)。其中VP4和VP7是两个主要的结构蛋白，它们决定了轮状病毒的血清型和病毒中和作用(neutralization)(Estes，M.K.，Palmer，E.L.，Obijeski，J.F.，1983.Rotaviruses.Curr.Top.Microbiol.Immunol.105，123-184)。轮状病毒主要是通过粪-口途径传播，在生活污水和受污染的地表水中轮状病毒存在十分常见，其主要是通过生长在污染水中的甲壳类动物和污染的饮用水传播(parashar，U.D；R.C Holman；M.J.Clarke；J.S.Bresee；and R.I.Glass.Hospitalizations associated with rotavirus diarrhea in the United States，1993through 1995surveillance based on the new ICD-9-CM rotavirus-specificdiagnostic code.1998.J.Infect.Dis.17713-17；Le Guyader，F；L.Haugarrean；L.Miossec；E.Dubois；and M.Pommepuy.Three-year study to assess human entericviruses in shellfish.Appli.Environ.Microbiol.2000.663241-3248)。
目前国内外主要利用替代指标来估计水体中病毒的含量(D.Hot.，O.Legeay，J.Jacquesa，C.Gantzerc，Y.Caudrelierb，K.Guyardb，M.Langeb，L.Andreolettia.Detection of somatic phages，infectious enteroviruses andenterovirus genomes as indicators of human enteric viral pollution in surfacewater，Water Research 2003374703-4710)。替代指标主要利用细菌排泄物指示剂(粪大肠杆菌和链球菌)和人类粪便中特殊类型的噬菌体，如嗜肉性大肠杆菌噬菌体，F-特异性RNA噬菌体及bacteriophage fragilis噬菌体作为质量标准(A.Arraj1，，J.Bohatier，H.Laveran and O.Traore.Comparison ofbacteriophage and enteric virus removal in pilot scale activated sludgeplants.Journal of Applied Microbiology 2005.98516-524)。但是，研究表明在大肠杆菌和大肠杆菌噬菌体没有超标的情况下，病毒仍然存在，而且水体中大肠杆菌噬菌体和病毒相关性不理想，也不能反应病毒的感染性。近年来，世界各国针对水环境中轮状病毒的快速检测展开了大量研究工作，其中基于实时定量PCR(real-time PCR)的检测方法呈现了良好的应用前景。
实时定量PCR(real-time PCR)是通过实时监控PCR反应过程中荧光信号的积累，对样品进行检测和定量分析。Real-time PCR整个过程是在全封闭的状态下进行片段扩增及产物分析的，这样有效地减少了污染及对人体的危害，同时能够快速大量地进行定量检测。Real-time PCR技术是快速简便的定量检测技术，它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测。其中绝对定量是目前采用最多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现绝对定量(Lan.M.Mackay et al.Real-time PCRin Virology.Nucleic Acids Research.2006 301292-1305)。在Real-time PCR定量检测中，这些外标准品的制备成为其能否准确定量的关键。
文献报道分子生物学RT-PCR技术，具有敏感性高、特异性强、快速等优点，可以检测受污染水体中的肠道致病病毒的每一个基因组RNA；其中肠道病毒基因组的检测，对预测水体中病毒存在具有重要的意义(D.Hot.，O.Legeay，J.Jacquesa，C.Gantzerc，Y.Caudrelierb，K.Guyardb，M.Langeb，L.Andreolettia.Detectionof somatic phages.infectious enteroviruses and enterovirus genomes asindicators of human enteric viral pollution in surface water，Water Research2003 374703-4710)。同时L.Andreoletti等提出利用实时定量RT-PCR定量检测肠道病毒基因组是一种适合检测水环境中病毒污染指标的方法(D.Hot.，O.Legeay，J.Jacquesa，C.Gantzerc，Y.Caudrelierb，K.Guyardb，M.Langeb，L.Andreolettia.Detection of somatic phages，infectious enteroviruses andenterovirus genomes as indicators of human enteric viral pollution in surfacewater，Water Research 2003 374703-4710)。He and.Jiang等利用real-timePCR定量检测环境样品中的人类腺病毒和肠道球菌素，证明这种方法比病毒蚀斑分析或细菌培养方法具有更高的敏感性。随后Jim Gray等将酶联免疫分析(EIA)和real-time RT-PCR技术两者相比较，结果表明real-time RT-PCR更快速经济(GagandeepKang，Miren Iturriza-Gomara，Jeremy G.Wheeler，Premila Crystal，BindhuMonica，Sasirekha Ramani，Beryl Primrose，Prabhakar D.Moses，Chris I.Gallimore，David W.Brown，and Jim Gray。Quantitation of Group A Rotavirusby Real-Time Reverse-Transcription-Polymerase Chain ReactionCorrelationWith Clinical Severity in Children in South India。Journal of Medical Virology.2004.73118-122)。Charlotte C.Yu Ip等报道应用real-time PCR、nested-PCR和电子显微镜(electron microsopy)这三种技术检测来自腹泻儿童的粪便标本中轮状病毒，结果表明real-time RT-PCR分析具有简单快速，敏感性高和减少外源性污染等优点；并确定real-time RT-PCR可检测多种情况包括随机腹泻、爆发流行、环境样品等中的轮状病毒(Xiaoli L.Pang，Bonita Lee，Nasim Boroumand，BarbaraLeblanc，Jutta K.Preiksaitis，and Charlotte C.Yu Ip。Increased Detectionof Rotavirus Using a Real Time Reverse transcription-Polymerase ChainReaction(RT-PCR)Assay in Stool Specimens From Children With Diarrhea。Journal of Medical Virology.2004.72496-501)。Pang等利用实时定量RT-PCR检测了123例儿童腹泻标本的轮状病毒感染，检测灵敏度较传统的RT-PCR和巢式PCR提高了102-104倍，耗时则是后者的一半，且证明该方法还可以监控水环境样品中的病毒污染情况(Pang XL，Lee B，Boroumand N，et al.Increased detection ofrotavirus using a real time reserve transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)assay in stool specimens from children with diarrhea.J Med Virol.2004.72(3)496-501)。综上所述，近年一些研究者已经采用real-time PCR技术检测来自腹泻标本的轮状病毒，但是水环境样品中的轮状病毒及其感染性的检测还在探索过程中。这些研究者在样就过程中考虑到real-time PCR技术的关键是定量，所以他们采用TaqMan探针技术或者外标准品的构建来实现绝对定量。其中不同外标准品的构建成为研究的关键技术。
就水质控制标准而言，USEPA很重视水介病原微生物对人体健康的影响，在其水质标准中微生物标准为8项，其中包括病毒指标，而我国的水质标准中对水介传播的病毒还没有明确规定，仅规定耐热大肠菌群每100mL水样中不得检出(CJ/T206-2005城市供水水质标准)。而在修订水质标准过程中，相应的检测方法的建立尤为重要。目前，国内外尚无检测水环境中轮状病毒的标准方法，Real-time PCR被认为是最有前景的快速敏感定量的检测方法。因此在Real-time PCR定量检测中，外标准品的制备是其定量的关键技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测轮状病毒的方法及其专用标准品。
本发明所提供的定量检测轮状病毒的标准品，是含有序列表中序列1的核苷酸序列的重组载体，或是含有所述重组载体的转基因宿主细胞。
序列表中的序列1由318个脱氧核糖核苷酸组成。
序列1与GenBank中猴轮状病毒株SA-11的所有VP7的序列具有99％以上的同源性，与GenBank中人轮状病毒株的VP7序列具有75％以上的同源性。利用序列1所制备的标准品除可作为检测猴轮状病毒株的外标准品外，还可作为检测其他轮状病毒株的外标准品，该标准品具有广谱性。
所述标准品可用于定量PCR检测中。
所述定量PCR可为常规PCR或实时定量PCR。
任何可将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子均可用于构建所述重组载体，如质粒、噬菌体载体、粘质粒载体(cosmid)等基因工程载体。
所述重组载体可按照常规方法，将核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段插入载体的多克隆位点得到。
所述转基因宿主细胞可为细菌、真菌、植物或动物细胞。
本发明所提供的定量检测轮状病毒的方法，是分别以待检测样品和上述任一种标准品的基因组DNA为模板，或以分别由所述待检测样品和上述任一种标准品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用由核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段组成的引物对进行PCR，对待检测样品进行轮状病毒定量。
序列表中序列2的核苷酸序列是5′-CCTCACTTATACACTTTGCC-3′；序列表中序列3的核苷酸序列是5′-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3′。
本发明的一个实施例中，提供了一个定量检测轮状病毒的标准品，该标准品是将核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和pGEM-T Easy载体连接得到的重组载体pGEM-T Easy-VP7。它是按照下述方法制备的1)从MA-104细胞中分离并培养猴轮状病毒标准株；2)利用Trizol裂解法进行细胞总的RNA的提取，获得总RNA；3)采用SuperscriptIII逆转录酶进行逆转录获得cDNA，利用特异性引物(序列2和序列3)，PCR扩增序列是序列表中序列1的核苷酸片段；采用T-A克隆技术，将该核苷酸片段连入pGEM-T Easy载体，得到重组载体pGEM-T Easy-VP7。
上述外标准品pGEM-T Easy-VP7的制备方法中，轮状病毒RNA是从MA-104细胞中培养制备，因此是感染性轮状病毒典型的代表。基于此得到的外标准品属于感染性轮状病毒特异性的，在此基础上建立的real-time PCR方法除在精确性、灵敏性方面具有优势外，同时在评价病毒的感染性方面具有更大的优势；由序列表中的序列2和序列3组成的引物包含了具有特异性的部分和结构蛋白的部分，因此基于此建立的方法可检测广泛的、具有感染性的轮状病毒，提高了检测范围和精度。
本发明的定量检测轮状病毒的标准品具有广谱识别和感染性特异相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可长期保存，纯度好，检测线性范围较宽，可以普遍用于各种样品，特别是水环境中轮状病毒的快速定量检测。
图1A是重组载体的酶切鉴定图谱图1B为pGEM-T Easy-VP7重组质粒的部分测序结果图2为不同稀释滴度的pGEM-T Easy-VP7的常规PCR图3A是实时定量PCR的标准曲线图3B是实时定量PCR的熔解曲线图4为常规PCR检测感染了猴轮状病毒标准株SA-11的Caco-2细胞的cDNA样品结果图5为实时定量PCR检测质粒标准品pGEM-T Easy-VP7的扩增曲线图6A为检测未知样品(Caco-2细胞的cDNA样品)的实时定量PCR的标准曲线图6B为实时定量PCR检测质粒标准品pGEM-T Easy-VP7和未知样品(Caco-2细胞的cDNA样品)的扩增曲线具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下面仅以含有序列表中序列1的核苷酸序列的重组质粒为例，阐明定量检测轮状病毒的标准品定量检测轮状病毒的效果，其它含有序列表中序列1的核苷酸序列的重组载体或含有该重组载体的转基因宿主细胞定量检测轮状病毒的效果都与该标准品相同。
实施例1、定量检测轮状病毒的标准品pGEM-T Easy-VP7的制备A.轮状病毒的培养利用DMEM+10％胎牛血清，在5％CO2培养箱中37℃培养恒河猴细胞系MA-104细胞(ATCC号为HTB-37TM)，当该细胞系在25cm2的培养瓶中生长为单层时，利用1×PBS清洗细胞两次，以去除死细胞；接种500mL猴轮状病毒标准株SA-11(ATCC号为VR-1565TM)到培养MA-104细胞的培养瓶中，5％CO2培养箱中37℃孵育1-2h，加入含有5mL2％胎牛血清的DMEM病毒维持液，培养5天后，观察细胞状态，当有明显病毒蚀斑单位形成时，收集细胞，并收集细胞上清液，获得扩增猴轮状病毒标准株SA-11。
B.轮状病毒RNA的提取采用Trizol裂解法对收集感染猴轮状病毒标准株SA-11的MA-104细胞进行细胞总RNA的提取。具体步骤如下1)在25cm2培养瓶约3×105个细胞中立即加入1mL Trizol，室温下摇床上均匀摇动5min，利用1mL吸管轻轻吹打细胞，使细胞裂解；2)加0.2mL氯仿，振荡混匀，室温放置2min；3)4℃2000g离心15min；4)取上清，加入0.5mL异丙醇混匀，室温下放置10min；5)4℃12000g离心10min；6)弃上清，在RNA沉淀中加入1mL 75％的乙醇混匀；7)4℃7500g离心5min；8)弃上清，室温或55℃干燥沉淀，用20μL DEPC水溶，于55℃-65℃置5min溶解。
9)使用紫外分光光度计鉴定RNA浓度和纯度之后立即使用或置于-80℃保存，整个操作过程中，注意佩戴口罩，手套要经常换防止RNA的降解。
C.cDNA的合成和特异性引物的设计cDNA的合成取4ug的总RNA使用逆转录酶SuperScriptIII通过逆转录进行cDNA的合成，操作过程如下20uL的cDNA的合成体系包括1uLOligo(dT)12-18(200-500ng)，5uL的mRNA(0.8ug/ul)，1uL的10mMdNTP，6uL的无RNA酶双蒸水；该体系在65℃水浴反应5min，在冰上孵育2min，进行短暂离心后，立即加入如下几种试剂到该管中4uL的5×第一条链反应缓冲液，1uL的0.1M DTT，1uL的RNA酶抑制剂(40u/uL)，1uL的SuperScriptIII RT(200u/ul)；轻柔混合，在50℃水浴培养60min，在70℃水浴15min灭活。-20℃保存，备用。
特异性引物的设计在GenBank中下载猴轮状病毒标准株SA-11的所有VP7的序列和人轮状病毒株部分VP7序列(见表1)。将这些序列输入Clastla W软件中进行多序列比较分析其同源性，进行引物设计和合成，引物的GC含量在40-60％之间，引物之间距离大于30bp。引物序列如下SA-11-Sense5′-CCTCACTTATACACTTTGCC-3′(序列2)；SA-11-Antisense5′-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3′(序列3)。用无菌双蒸水将引物配制成200umol/uL的储存液，分装，-20度保存。
表1.所有GenBank中猴轮状病毒标准株SA-11 VP7和人轮状病毒VP7的序列信息
D.质粒标准品的制备具体步骤为1)目的片段的制备和纯化取8ul cDNA作为PCR反应的模板，PCR反应体系为100uL2uL 20uM上游引物(序列2)，2uL 20uM下游引物(序列3)，2uL 10mM dNTP，1.2uL TaqDNA聚合酶(5u/uL)，6.4uL 25mM MgCl2，10uL10×PCR缓冲液，76.4ul无菌双蒸水。PCR反应程序为先94℃4min；然后94℃1min，59℃40秒，72℃1min30秒，进行35个循环；再72℃延伸10min。取10uL PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳，结果表明扩增产物大小为318bp，证明扩增产物为目的片段。取90ul PCR产物行2％琼脂糖回收胶，利用胶回收试剂盒进行目的片段的回收纯化。回收纯化后取2ul进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果表明回收纯化的效果较好，可用于T-A和其他双酶切克隆。
2)T-A克隆技术a.连接反应将回收纯化的目的片段和pGEM-T Easy载体连接，具体过程如下根据回收后进行2％琼脂糖凝胶电泳所见条带的亮度，调节载体和目的片段的量分别进行1∶1，1∶2和1∶3的连接反应，最终确定为1∶3的连接比例较好，其连接体系为10uL3uL目的片段，1uL pGEM-T Easy载体，5uL 2×连接酶缓冲液，1uL T4DNA连接酶，4℃连接12h。
b.感受态细菌的制备利用CaCl2法制备DH5α感受态细菌，将连接产物转化入该感受态细胞中，具体过程如下I.从37℃培养12～16h的平皿中挑取单菌落，转移到含有3mL LB的试管内，37℃过夜，次日取出1mL接种至100mL LB的500mL瓶中，37℃剧烈摇振培养2～3h(200～300r/min)，待OD600值达到0.3～0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10～15min。
II.菌液转移到一个冰冷的灭菌的50mL离心管中，4℃ 4000g离心10min回收细菌。
III.弃培养液，用冰预冷的10mL 0.1M CaCl2重悬菌体，置冰浴30min。4℃ 4000g离心10min，弃去上清。
IV.再加2mL用冰浴预冷的0.1M CaCl2重悬菌体(要轻)。置4℃冰箱12～24h，即可用于转化。
V.按每份100uL分装细胞，立刻进行转化。
c.细菌的转化新鲜制备的感受态菌，每100uL感受态菌加10uL连接产物，冰浴30h。42℃热休克90s，立即插入冰中，放置2min。加入500uL LB，37℃，225rpm培养1h。8000rpm室温离心，去掉部分上清，混匀后取适量涂含100ug/mLAmp+的LB培养皿，37℃孵育过夜(12～16h)，不能超过16h。
3)阳性克隆的鉴定利用改进的碱裂解法提取质粒的DNA。具体过程如下将转化后涂盘已经出现菌落的培养皿拿出，挑12个单菌落于含有5mL LB(Amp+)培养液中，在37℃培养10～12h；取1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，室温，12000rpm离心5min；弃去上层液体，加入120uL含有RNA酶的溶液I(50mM葡萄糖，25mM pH8.0的Tris-HCl，10mM pH8.0的EDTA和10ug/mL RNaseA)剧烈振荡，室温放置10-15min；加240uL新配置的溶液II(1％SDS，200mM NaOH)，轻轻混匀，室温不超过5min；加入180uL溶液III(60mL 5M乙酸钾，11.5mL冰醋酸，加水到100mL)，颠倒混匀，室温1-5min；室温12000rpm离心10min，小心将上清液移入另一1.5mL离心管中；加事先混合好的等体积Tris饱和酚∶氯仿(1∶1)混匀，室温12000rpm离心5min；吸上层水相于另一离心管中，加0.6-0.8倍体积的异丙醇，混匀，室温12000rpm离心15-20min，弃上清；加入70％乙醇1mL，室温12000rpm离心5min；弃上清，55℃干燥，加30uL TE溶解。-20℃保存，备酶切鉴定用。
利用Cutter2.0软件在线分析目的片段中酶切图谱，确定没有EcoRI酶切位点，采用EcoRI对所提质粒进行酶切，将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，选用100bp的Marker，在凝胶成像仪上观察并记录实验结果，结果表明初步鉴定几株阳性克隆。将酶切证明为阳性克隆的菌液送测序，测序结果进行blast比对后，结果证明为阳性重组体，且该重组体和GenBank中下载猴轮状病毒株SA-11的所有VP7的序列具有99％以上的同源性，该重组体中所承载的轮状病毒DNA的核苷酸序列是序列表中的序列1，将含有核苷酸序列是序列表中的序列1的核苷酸片段的重组载体命名为pGEM-T Easy-VP7。质粒标准品pGEM-T Easy-VP7构建成功，进行pGEM-T Easy-VP7的大量提取和纯化。重组载体的酶切鉴定结果如图1A所示，表明获得了含有318bp外源DNA片段的重组载体。图1A中，MDNA Marker；阴性没有载体的酶切体系；1-12酶切重组载体的编号。pGEM-T Easy-VP7的部分测序图谱如图1B所示。
E.重组质粒标准品pGEM-T Easy-VP7的检测步骤为1)重组质粒浓度的测定和拷贝数的计算取纯化的质粒标准品1ul到200ul的TE中，利用紫外分光光度测量260nm的OD值，确定质粒标准品的纯度较好。利用DNA质量浓度＝A260×核酸稀释倍数×50/1000的公式计算出质粒标准品的浓度为3.22ug/uL。获得质粒标准品的浓度后需要计算质粒标准品的拷贝数，其中DNA的拷贝数＝(DNA的质量/DNA的摩尔质量)×6.02×1023。其中双链DNA中1bp＝649Da；DNA的摩尔质量＝649Da×(3000+318)bp；带入公式中计算获得为9×1011拷贝/uL。
2)重组质粒pGEM-T Easy-VP7稳定性的确定取5批浓度为9×108-4拷贝数/uL的质粒提取物，进行分批冻存于-20度，冻存时间分别为1，20，60天。取这3个时间点的5批浓度进行实时定量PCR反应，该实时定量PCR中所用的荧光剂为SYBRgreen I，是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。进行平行孔重复实验。实时定量PCR反应体系经优化如下20uM上游引物(序列2)，20uM下游引物(序列3)和10mM dNTP分别为0.5ul；Taq DNA聚合酶为0.3uL；10×PCR反应缓冲液为2uL；25mM MgCl2为1.6uL；20×SYBR green I染料为1.2uL，1uL 9×108-4拷贝数/uL为模板，用12.4ul的双蒸水补足体积到20uL。实时定量PCR反应过程经优化为先94℃2min预变性，然后按照94℃20秒，59℃30秒，72℃20秒，进行50个循环。融解曲线的过程为95℃1min，55℃1min，至55℃30秒开始进行81个循环，温度变化范围为0.5℃，结束温度为95℃。经过融解曲线的分析确定特异性反应的Tm值为81℃。结果表明平行样的Ct值之间的差＜0.5，说明组内重复性较好；三次独立实验结果的CV值＜0.9％，表明该质粒标准品具有良好的重复性和稳定性。
表2.质粒标准品稳定性检测
4)实时定量PCR检测重组质粒标准品pGEM-T Easy-VP7线性范围将重组质粒pGEM-T Easy-VP7进行10倍的倍比稀释，稀释滴度分别为9×109，9×108……9×100拷贝数/uL，进行实时定量PCR检测，反应参数和过程同步骤3)，实验结果确定利用上述优化的实时定量PCR反应参数和程序可以检测质粒标准品的线性范围为9×100-9×1011拷贝数/uL。结果如图5所示，实时定量PCR检测质粒标准品的线性范围为9×100-9×1011拷贝数/uL。
5)常规PCR检测重组质粒标准品pGEM-T Easy-VP7的范围将轮状病毒质粒标准品pGEM-T Easy-VP7进行10倍的倍比稀释，稀释滴度分别为9×1011，9×1010，9×109，9×108……9×10-2拷贝数/uL，进行常规PCR检测20uM上游引物(序列2)，20uM下游引物(序列3)和10mM dNTP分别为0.5ul，Taq DNA聚合酶为0.3uL，10×PCR反应缓冲液为2uL，25mM MgCl2为1.6uL，1uL 10倍倍比稀释的质粒标准品为模板，用13.6ul的双蒸水补足体积到20uL。按下列条件进行扩增94℃4min预变性，然后按照94℃1min，59℃40秒，72℃1min 30秒，进行35个循环，最后72℃延伸10min。将PCR产物进行2％琼脂糖电泳，结果如图2所示，表明常规PCR的检测范围为9×103～9×1011拷贝数/uL，该结果为三次重复的结果。图2中，MDNA Marker(100bp DNA ladder)；1～15分别代表以9×1011，9×1010，9×109，9×108……、9×10-2拷贝数/uL和阴性对照(双蒸水)为模板进行常规PCR检测所扩增出的目的片段，目的片段的大小为318bp，在图中显示为300bp和400bp之间的碱基对大小；100bp处的条带为扩增过程中形成的引物二聚体。
F.实时定量PCR检测标准曲线的制备取已知5个倍比稀释的重组质粒标准品pGEM-T Easy-VP7分别为9×108，9×107，9×106，9×105，9×104拷贝数/uL，进行实时定量PCR检测的标准曲线的绘制。同时每个稀释度做3个平行样，进行实时定量PCR反应。所有反应参数和过程同步骤E的3)。结果如图3A所示，横坐标代表质粒标准品的起始稀释滴度的Log10值，纵坐标Threshold Cycle代表系列稀释滴度的质粒标准品的临界循环数。轮状病毒质粒标准品从9×104～9×107/uL拷贝数的范围内R2＝0.9995，说明该体系线性相关性较好；斜率为-3.207说明该体系扩增效率较高。图中结果为三次独立重复实验的结果。
G、实时定量PCR检测标准曲线的熔解曲线pGEM-T Easy-VP7融解曲线的测定方法同步骤E的3)，结果表明特异性反应的Tm值为81±0.5℃(图3B)。
实施例2、利用pGEM-T Easy-VP7在Caco-2细胞进行感染性轮状病毒的荧光定量PCR检测利用含有15％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃5％CO2培养箱中培养人结肠癌细胞系Coco-2细胞(ATCC号为CRL-2378.1TM)；当这种细胞系生长为单层时，分别接种四种滴度(103.5TCID50、101.5TCID50、10-0.5TCID50、10-1.5TCID50)的猴轮状病毒标准株SA-11(ATCC号为VR-1565TM)，同时各浓度设三个平行样和未感染的细胞对照。感染120小时后，收集细胞利用Trizol裂解法，进行细胞总RNA的提取。利用实施例1中C的方法进行cDNA的合成，分别获得Coco-2细胞三个感染滴度的cDNA，作为待测样品。分别以Coco-2细胞三个感染滴度的cDNA和pGEM-T Easy-VP7(外标准品)为模板，进行常规PCR和实时定量PCR扩增。常规PCR和实时定量PCR扩增的反应体系和反应温度条件分别与实施例1中相同。所用的引物除β-actin外均相同。
猴轮状病毒SA-11的引物SA-11-Sense5′-CCTCACTTATACACTTTGCC-3′20个碱基(序列2)SA-11-Antisense5′-TTCGCTTCGTCAGTTTGCT-3′19个碱基(序列3)细胞内管家基因β-actin特异性引物β-actin-sense5′-GGAGAAAATCTGGCACCACAC-3′；21个碱基β-actin-antisense5′-CGTACAGGTCTTTGCGGATGT-3′；21个碱基常规PCR检测结果如图4所示，Caco-2细胞在120小时检测轮状病毒的感染滴度为103.5TCID50。其中A为常规PCR在Caco-2细胞检测轮状病毒的感染滴度，所用引物为猴轮状病毒株特异性引物。M，为DNA Marker(DL 2000)；C，为未感染轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；N，为PCR反应体系的阴性对照(双蒸水)。Lane1～3为感染了10-1.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；Lane4～6为感染了10-0.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；Lane7～9为感染了101.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；Lane10～12为感染了103.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；B为常规PCR在Caco-2细胞检测轮状病毒的感染滴度，所用引物为细胞内管家基因β-actin特异性引物。M，为DNA Marker(DL 2000)；C，为未感染轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；N，为PCR反应体系的阴性对照(双蒸水)。Lane1～3为感染了10-1.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；Lane4～6为感染了10-0.5TCID50轮状病毒的caco-2细胞的cDNA；Lane7～9为感染了101.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA；Lane10～12为感染了103.5TCID50轮状病毒的Caco-2细胞的cDNA。
利用pGEM-T Easy-VP7作为外标准品在caco-2细胞进行感染性轮状病毒的荧光定量PCR检测结果总结如下根据本次实验如图6A所制备的标准曲线，计算得出103.5TCID50轮状病毒感染的Caco-2细胞的cDNA样品中，轮状病毒的拷贝数为4.467×106个/uL，101.5TCID50轮状病毒感染的Caco-2细胞的cDNA样品中，轮状病毒的拷贝数为1.354×105个/uL。由图6B可知实时扩增曲线呈典型的“S”形，具有很好的扩增平台期；由熔解曲线分析表明扩增是轮状病毒特异性的。图6B中，曲线1是阴性对照(双蒸水)，曲线2是感染了10-0.5TCID50轮状病毒的caco-2细胞的cDNA，曲线3是感染了101.5TCID50轮状病毒的caco-2细胞的cDNA，曲线4是感染了103.5TCID50轮状病毒的caco-2细胞的cDNA，曲线5-8分别是pGEM-T Easy-VP7的9×104，9×105，9×106，9×107拷贝数/uL。这些结果表明实时定量PCR的检测的结果较可靠，且敏感性较常规PCR的检测敏感性高100倍；同时这些结果也表明本发明中所制备的质粒标准品具有较好的线性关系和检测范围。
序列表<160>3<210>1<211>318<212>DNA<213>猴轮状病毒SA-11(Simian rotavirus)<400>1cctcacttct acactttgcc tatattatcc gactgaggct gcgactgaaa taaacgataa60ttcatggaaa gacacactgt cacaactatt tcttacgaaa gagtggccaa ctggatccgt120atattttaaa gaatatacta acattgcatc gttttctgtt gatccgcagt tgtattgtga180ttataacgta gtactaatga aatatgacgc gacgttgcaa ttggatatgt cagaacttgc240ggatctaata ttaaacgaat ggttgtgtaa tccaatggat attactctgt attattatca300gcaaactgac gaagcgaa 318<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cctcacttat acactttgcc20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ttcgcttcgt cagtttgct 19
权利要求
1.定量检测轮状病毒的标准品，是含有序列表中序列1的核苷酸序列的重组载体，或是含有所述重组载体的转基因宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于定量检测为定量PCR检测。
3.根据权利要求2所述的标准品，其特征在于所述定量PCR为常规PCR或实时定量PCR。
4.根据权利要求1、2或3所述的标准品，其特征在于所述重组载体为质粒、噬菌体载体或粘质粒载体。
5.根据权利要求1、2或3所述的标准品，其特征在于所述转基因宿主细胞为细菌、真菌、植物或动物细胞。
6.根据权利要求1、2或3所述的标准品，其特征在于所述标准品是将核苷酸序列是序列表中序列1的核苷酸片段和pGEM-T Easy载体连接得到的重组载体。
7.权利要求1至5中任一权利要求所述的标准品在定量PCR检测轮状病毒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述定量PCR为常规PCR或实时定量PCR。
9.一种定量检测轮状病毒的方法，是分别以待检测样品和权利要求1至6中任一权利要求所述的标准品的基因组DNA为模板，或以分别由所述待检测样品和权利要求1至6中任一权利要求所述的标准品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用由核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段组成的引物对进行PCR，对待检测样品进行轮状病毒定量。
10.含有权利要求1至6中任一权利要求所述标准品的试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测轮状病毒的方法及其专用标准品。本发明的定量检测轮状病毒的标准品，是含有序列表中序列1的核苷酸序列的重组载体，或是含有所述重组载体的转基因宿主细胞。本发明的定量检测轮状病毒的方法，是分别以待检测样品和该标准品的基因组DNA为模板，或以分别由所述待检测样品和该标准品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用由核苷酸序列是序列表中序列2的核苷酸片段和核苷酸序列是序列表中序列3的核苷酸片段组成的引物对进行PCR，对待检测样品进行轮状病毒定量。该标准品具有广谱识别和感染性特异相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可长期保存，纯度好，检测线性范围较宽，可以普遍用于各种样品，中轮状病毒的快速定量检测。
文档编号C12Q1/68GK101058834SQ20071009958
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者何苗, 胡秀华, 刘丽, 施汉昌, 李丹 申请人:清华大学