Hla-a24限制性癌抗原肽的制作方法

专利名称：：Hla-a24限制性癌抗原肽的制作方法
技术领域：
：本发明属于癌症疫苗治疗领域。本发明涉及HLA-A24限制性癌抗原肽，更具体地，涉及来源于WT1的具有体内诱导CTLs活性的HLA-A24限制性癌抗原肽、编码所述肽的多核苷酸、包括上述物质的癌症疫苗、及其作为癌症疫苗的用途、以及基于它们的癌症的治疗和预防方法。
背景技术：
：细胞免疫，特别是细胞毒性T细胞(以下称为CTLs)，在消除活体内的癌细胞或病毒感染的细胞中起着重要的作用。CTLs可识别来源于癌细胞上癌抗原蛋白的抗原肽(癌抗原肽)和MHC(主要组织相容性复合物)I类抗原(在人类称作HLA抗原)之间形成的复合物，并因此攻击和破坏癌细胞。在Immunity,vol.10:281，1999中记载的表1中列举了癌抗原蛋白的代表性的实例。具体的实例包括黑素小体抗原，如黑素细胞组织特异蛋白、gplOO(J.Exp.Med.，179:1005，1994)、MART-l(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515，1994)、和酪氨酸酶(J.Exp.Med.，178:489，1993);以及HER2-neu(J.Exp.Med.，181:2109，1995)和癌症标i己物如CEA(J.Natl.CancerInst.，87:982，1995)和PSA(J.Natl.CancerInst.，89:293，1997)作为不同于那些来自黑素瘤的癌抗原蛋白。癌抗原肽是由约8到11个氨基酸残基构成的肽，是经细胞内蛋白酶加工癌抗原蛋白而产生的(Cur.Opin，Immunol.,5:709，1993;Cur.Opin，Immunol.,5:719，1993;Cell,82:13，1995;Immunol.Rev.，146:167，1995)。这样产生的癌抗原肽结合MHCI类抗原(HLA抗原)形成复合物，接着该复合物被呈递至细胞表面，并被上述CTLs识别。因此，在基于通过CTLs破坏癌症细胞的癌症免疫治疗药物(癌症疫苗)的研发中，从癌抗原蛋白中鉴定出能有效诱导CTLs的癌抗原肽是非常重要。在MHCI类分子中存在多种亚型，结合到各自亚型上的抗原肽的氨基酸序列(结合基序)遵循一定的规律。对于HLA-A2的结合基序来说，例如，第2位上的氨基酸是亮氨酸、曱硫氨酸、或异亮氨酸，第9位上的氨基酸是缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸。对于HLA-A24的结合基序来说，笫2位上的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、或色氨酸，第9位上的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸，或甲硫氨酸。近来，可在数据库中搜索(例如，BIMAS软件；http:〃bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/)那些包括上文所示基序、并预期能与HLA抗原结合的任何肽序列。因此，为了从癌抗原蛋白中鉴定出能够诱导CTLs的癌抗原肽，首先从癌抗原蛋白的氨基酸序列中鉴定出与结合基序或相应于预期HLA型的肽序列相匹配的，由长度在约8到11个氨基酸构成的肽区域。然而，在结合基序或预期肽序列的基础上鉴定出的肽不一定有免疫原性。由于抗原肽是通过癌抗原蛋白的细胞内加工所产生，因此没有通过加工产生的肽不可能是抗原肽。此外，由于许多癌抗原蛋白最初存在于活体中，因此即使是细胞内产生的具有结合基序或期望肽序列的肽作为癌抗原肽，CTLs也可能对这样的癌抗原产生耐受。这些事实表明，为了鉴定具有诱导CTLs活性的癌抗原肽，仅仅基于预期HLA型的基序或期望的肽序列的预测是不够的，体内免疫原性(诱导CTLs的活性)的评价非常重要。在对并发Wilms癌、无虹膜、泌尿生殖器异常、精神发育迟緩等并发症的WAGR综合症的分析的基础上，从染色体11pl3中分离得到了作为Wilms癌致病基因之一的Wilms癌抑制基因WT1(WT1基因)(Nature,343:774，1990)。WT1的基因组DNA约50Kb,由10个外显子组成，其cDNA约3kb。从cDNA推导出的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示(Cell.,60:509,1990)。WT1基因在人白血病中高度表达，同时通过采用WT1反义寡聚体处理白血病细胞可抑制白血病细胞的细胞生长，上述事实表明WT1基因能够促进白血病细胞的生长(日本专利公开(Kokai)No.104627/1997)。接着，从WTl也在实体癌如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎性癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌以及卵巢癌中高度表达的事实中(日本专利公开(Kokai)No.104627/1997，日本专利公开(Kokai)No.35484/1999)，也可证实WT1基因是白血病和实体癌的新癌抗原蛋白(J.Immunol.,164:1873-80，2000、J.Clin.Immunol.,20，195-202，2000)。优选将癌症免疫治疗的药物(癌症疫苗)用于尽可能多的癌症患者，因此从WT1中鉴定出在许多类型的癌中均高度表达的癌抗原肽以及开发基于这些癌抗原肽的癌症疫苗非常重要。在本发明的上下文中，WOOO/06602和WOOO/18795描述了由WTl蛋白的一部分构成的天然存在的癌抗原肽。在开发癌症疫苗的过程中，不能使用通常用作实验动物的纯系小鼠来进行疫苗的体内功效评价，而是需要一种用于人的表达HLA的动物模型。具体地，当呈递到HLA—种人特异的MHCI类分子时，可用作癌疫苗的人抗原肽能诱导特异性免疫反应。非人的实验动物缺乏这种HLA，因而不能用于直接用于人治疗的癌症疫苗的体内评价。因此，用于人的表达HLA的动物模型在上述癌症疫苗功效的评价中是必需的。发明的公开本发明的目的是提供在体内具有免疫原性(诱导CTLs的活性)的来源于WTl的癌抗原肽、包含那些肽的癌症疫苗、及其作为癌症疫苗的用途、以及基于它们的癌症的治疗和预防方法。最近，已经制备了可用于评价体内功效的用于人的表达HLA-A24抗原的动物模型，并且申请了要求该发明的专利申请(wo02/47474，国际申请日2002年6月20日，申请人Sumitomo药物有限公司)。该模型使得评价HLA-A24限制性癌抗原蛋白和癌抗原肽，及其基因的体内功效成为可能。本发明者采用那些用于人的动物模型评价来源于WTl并限制于HLA-A24的天然肽和改变肽。即，我们使用BIMAS软件(http:〃bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/)对从WTl序列中推导出的具有预期结合HLA-A24抗原的肽序列(结合基序)的肽的评价表明，在下列天然肽中肽A:ArgMetPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:8)肽B:ArgValProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:7)肽C:ArgTrpProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:9)肽D:GinTyrArglieHisThrHisGlyValPhe(SEQIDNO:10)和肽E:AlaTyrProGlyCysAsnLysArgTyrPhe(SEQIDNO:11)，仅有肽B(SEQIDNO:7)在体内具有免疫原性(诱导CTLs的活性)。此外，本发明者制备了下列改变的肽肽F:ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:2)肽G:ArgTyrProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:3)和肽H:ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)，所有这些肽都有改变，其中在上述肽A到C的笫2位上的氨基酸变为酪氨酸(Tyr)，并且以相似的方式评价它们的免疫原性。结果，本发明者发现，改变型肽G比其原始的天然型肽B具有更高的免疫原性。同样地，本发明者发现，尽管天然型肽A和C没有免疫原性，但是其改变型肽F和H具有高免疫原性(诱导CTLs的活性)。此外，本发明者也以相似的方式评价了下列来自人WT1的天然肽(肽K和L)的免疫原性，这些肽在通过BIMAS软件的搜索中被鉴定为具有预期结合HLA-A24抗原的肽序列，和下列其改变的肽，其中第2位上的氨基酸变为酪氨酸(肽I和J):肽K:AlaLeuLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:51)肽L:AsnGinMetAsnLeuGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:52)肽I:AlaTyrLeuProAlaValProSerUu(SEQIDNO:5)和肽J:AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:6)。结果，本发明者发现，尽管天然型肽K和L没有免疫原性(诱导CTLs的活性)，但是其改变型肽I和J在体内具有高免疫原性(诱导CTLs的活性)。基于上述那些发现，本发明者深信，如SEQIDNos:2到6和SEQIDNO:7中所示的具有或不具有各种修饰的肽或天然肽均可用作癌症疫苗。本发明是基于上述发现而完成。因此，本发明涉及(I)一种包含选自如下组中的任何一种氨基酸序列的肽ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:2)，ArgTyrProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:3)，ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)，AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)，和AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:6)j或者一种由选自SEQIDNOs:2，3，4，5，和6中的任何一种氨基酸序列构成的肽；或者一种包含改变的氨基酸序列的肽，在选自SEQIDNOs:2，3，4，5，和6中的任何一种氨基酸序列中都含有经改变的氨基酸残基，其都具有以HLA-A24限制性方式诱导CTL的活性，所述肽排除包含SEQIDNO:7氨基酸序列的肽；优选地，如本发明所述的肽，其包含改变的氨基酸序列，其中在选自SEQIDNOs:2，3，5，和6中的任何一种氨基酸序列中，第9位上的亮氨酸被苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、或甲硫氨酸取代；如本发明所述的肽，其包含改变的氨基酸序列，其中在SEQIDNO:4的氨基酸序列中，第9位上的苯丙氨酸被色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、或曱硫氨酸取代；或者如本发明所述的肽，其包含改变的氨基酸序列，其中在SEQIDNO:4的氨基酸序列中，笫5位上的半胱氨酸被丙氨酸、丝氨酸、或oc-氨基丁酸取代(SEQIDNO:66，67，或68);或者如本发明所述的肽，其由改变的氨基酸序列构成，该经改变的氨基酸残基包含于选自SEQIDNOs:2，3，4，5，和6中的任何一种氨基酸序列中。(II)一种编码如本发明所述肽的多核苷酸，优选一种编码选自SEQIDNOs:2到6，以及66到68中的任何一种氨基酸序列的如本发明所述的多核苷酸；或者一种含有如本发明所述的多核苷酸的表达载体；或者一种含有如本发明所述的表达载体的转化细胞；或者一种制备如本发明所述的肽的方法，其包括在适合表达肽的条件下培养如本发明所述的细胞；(III)一种特异性结合如本发明所述肽的抗体；(IV)—种在其表面呈递来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间复合物的抗原呈递细胞，优选地，如本发明所述的抗原呈递细胞，其表面呈递由选自SEQIDNos:2到6和66到68中的任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间的复合物；(V)—种识别来源于如本发明所述的肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL，优选的如本发明所述的CTL，识别由选自SEQIDNos:2到6和66到68中的任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间的复合物；(VI)—种药物组合物，其包含如本发明所述的肽、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的转化细胞、如本发明所述的抗原呈递细胞、或如本发明所述的CTL，连同药学上可接受的载体，特别是癌症疫苗；以及如本发明所述的肽、表达载体、转化细胞、抗原呈递细胞或CTL在生产癌症疫苗中的应用，以及癌症的治疗或预防方法，其包括向需要治疗的HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者施用治疗或预防有效量的如本发明所述的肽、多核苷酸、表达载体、转化细胞、抗原呈递细胞、或CTL。此外，本发明也提供(VII)—种药物组合物，其包括选自如下组的任何一种物质a)包含ArgValProGlyValAlaProThrUu(SEQIDNO:7)序列的肽，b)编码上述a)所示肽的多核苷酸，c)含有上述b)所示多核苷酸的表达载体，d)含有上述c)所示表达载体的细胞，e)在其表面呈递来源于上述a)所示肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间复合物的抗原呈递细胞，和f)识别来源于上述a)所示肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间复合物的CTL，连同药学上可接受的载体；特别是癌症疫苗；以及上述肽、多核苷酸、表达载体、转化细胞、抗原呈递细胞或CTL在生产癌症疫苗中的应用，癌症的治疗或预防方法，其包括向需要治疗的HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者施用治疗或预防有效量的上述肽、多核苷酸、表达载体、转化细胞、抗原呈递细胞、或CTL。简要的图1是显示制备用于构建本发明的嵌合基因(HLA-A2402/Kb基因)的H-2Kb基因组DM过程的示意图。图2是显示制备本发明嵌合基因，HLA-A2402/Kb基因过程的示意图。图3是SEQIDNO:33中所示的HLA-A2402/Kb基因组序列的1到1300位序列和SEQIDNO:34中所示的HLA-A2402/KbcDNA序列的1到407位序列之间的序列比对。图4是SEQIDNO:33中所示的HLA-A2402/Kb基因组序列的1301到2600位序列和SEQIDNO:34中所示的HLA-A2402/KbcDNA序列的408到1015位序列之间的序列比对。图5是SEQIDNO:33中所示的HLA-A2402/Kb基因组序列的2601到3857位序列和SEQIDNO:34中所示的HLA-A2402/KbcDNA序列的1016到1119位序列之间的序列比对。图6是显示当采用来源于HER-2/neu的抗原肽(HER2/neu78。，)免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。纵轴和横轴分别代表细胞毒活性(％特异性细胞溶解)和各转基因小鼠的名称。在图中，"pep+"指采用经肽脉冲(pulsedwithapeptide)处理的耙细胞所获得的结果，"pep-，，指采用没有经任何肽脉冲处理的靶细胞所获得的结果。图7是显示当用来源于MAGE-3的抗原肽(MAGE-3m-2。3)免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图8是显示当用来源于CEA的抗原肽(CEA"2-"。)免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图9是显示当用来源于CEA的抗原肽(CEA26H")免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图10是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽A，WTl"w")免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，不能诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图11是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽B，WTl3。w,。)免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图12是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽C，WT1"7-"s)免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，不诱导出特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图13是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽D，WTl285-2")免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，不诱导出特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图14是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽E，WTlm-川)免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，不诱导出特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图15是显示当采用改变的肽(肽F)，其中来源于人WT1的抗原肽(肽A，WTlm-m)的第2位的氨基酸残基改变为酪氨酸，来免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，能诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图16是显示当用改变的肽(肽G)，其中来源于人WT1的抗原肽(肽B，WT13。2-h。)的第2位的氨基酸残基改变为酪氨酸来免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图17是显示当用改变的肽(肽H)，其中来源于人WT1的抗原肽(肽C，WTlm-m)的第2位的氨基酸残基改变为酪氨酸，来免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图18是显示当用改变的肽(肽I)，其中来源于人WT1的抗原肽(肽K，WTlu-n)的第2位的氨基酸残基改变为酪氨酸，来免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图19是显示当用改变的肽(肽J)，其中来源于人WT1的抗原肽(肽L，WTl川-m)中第2位的氨基酸残基改变为酪氨酸，来免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图20是显示相对于天然肽的经改变的肽肽H诱导的效应细胞的交叉反应检测结果的图。在图中，纵轴表示CTL诱导活性(％特异性细胞溶解)，横轴表示各转基因小鼠的名称。同样地，在图中，空心条表示采用经改变的肽(肽H)脉冲处理的靶细胞所获得的结果，带点的条形表示采用经天然肽(肽C)脉冲处理的靶细胞所获得的结果，实心条表示采用没有经任何肽脉冲处理的靶细胞所获得的结果。图21是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽K，WT1,。-")免疫本发明的表达HLA-A"的转基因小鼠时，没有诱导出特异性CTL的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图22是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽L，WTl"w")免疫本发明的表达HLA-A24的转基因小鼠时，没有诱导出特异性CTL的图。在图中，纵轴、横轴、空心条、实心条的含义与图6的相应描述相同。图23是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽B,WT13。2-31。)，或其改变的肽(肽G)体外刺激来自HLA-A2402阳性的健康供血者的外周血单核细胞时，诱导CTLs的图，其中肽G为肽B中第2位的氨基酸残基变为酪氨酸而获得的。在图中，纵轴表示细胞毒活性，横轴表示效应细胞(E)和耙细胞(T)的比例，E/T。实心圃和实心三角形分别表示用经多重改变的肽和天然肽刺激的效应细胞的细胞毒活性。图24是显示当用来源于人WT1的抗原肽(肽B，WT13。2-31。)，或其改变的肽(肽G)体外刺激来自HLA-A2402阳性的健康供血者的外周血单核细胞时，诱导CTLs的图，其中肽G是为肽B中第2位的氨基酸残基变为酪氨酸而获得的。在图中，纵轴表示细胞毒活性，横轴表示效应细胞(E)和把细胞(T)的比例，E/T。实心圆和实心三角形表示分别经RERF-LC-AI细胞和LK87细胞上的经多重改变的肽刺激的效应细胞的细胞毒活性。空心圆，空心三角形和空心正方形分别表示用RERF-LC-AI细胞、LK87细胞和11—18细胞上的天然肽刺激的效应细胞的细胞毒活性。图25是显示当用肽H免疫表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴表示细胞毒活性(％特异性细胞溶解)，横轴表示E/T比例。实心圆和空心圆分别表示用肽H(免疫原性肽)脉冲处理的靶细胞所获得的结果，以及采用没有用任何肽脉冲处理的细胞所获得的结果。图26是显示当用肽M免疫表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、实心圆和空心圆的含义与图25的相关描述相同。图27是显示当用肽N免疫表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴、实心圆和空心圆的含义与图25的相关描述相同。图28是显示当用肽0免疫表达HLA-A24的转基因小鼠时，诱导特异性CTLs的图。在图中，纵轴、横轴.实心圆和空心圆的含义与图25的相关描述相同.图29是显示经相应于非取代肽肽H的取代肽肽M,诸导的效应细胞的交叉反应实验的结果图。在图中，纵轴表示CTL诱导活性(％特异性细胞溶解)，横轴表示E/T比例。同样地，在图中，实心圆、实心正方形以及空心圆表示采用经肽M(免疫原性肽)、肽H脉冲处理的靶细胞所获得的结果以及使用不用任何肽脉沖处理的细胞所获得的结果。图30是显示用相应于非取代肽肽H的取代肽肽N，诱导的效应细胞的交叉反应实验的结果图。在图中，纵轴、横轴、实心圆、实心正方形和空心圆的含义与图29的相应描述相同。实施本发明的最佳方式(I)如本发明所述的肽本发明的肽来源于人WT1(Cell.，60:509，1990，NCBIdatabaseAccessionNo.XP—034418,SEQIDNO:1)，并且具有在体内以HLA-A24限制性的方式诱导CTLs的活性(免疫原性)。本发明的肽具有能被呈递到抗原呈递细胞上从而以HLA-A24抗原限制性的方式在体内诱导CTLs的特性。可使用在下文参考方案中详细描述的有关HLA-A24的动物模型来检验这种特性。本发明的肽包括选自SEQIDNO:2，3，4，5，和6中的任何一种氨基酸序列，只要来源于该肽的癌抗原肽能被呈递至抗原呈递细胞上从而诱导CTLs即可。所述肽氨基酸残基的典型长度通常是9到100，优选9到50，更优选9到30，更优选9到20，甚至更优选9到11。在本发明的上下文中，将癌抗原肽定义为当被呈递至抗原呈递细胞时能够导致CTL诱导活性的肽。本发明的肽可以根据肽化学中通常使用的方法制备。这些制备方法的实例是那些在下列文献中记栽的方法包括"PeptideSynthesis"，Interscience，NewYork,1966j"TheProteins"，vol.2，AcademicPressInc.，NewYork,1976;"Pepuchido-Gosei，，，MaruzenCo.Ltd.，1975;"Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn，，，MaruzenCo.Ltd.，1985;和"Iyakuhin-no-Kaihatu，Zoku，vol.14，Peputido-Gosei"，HirokawaShoten，1991。本发明的肽也可以在基于编码本发明肽的多核苷酸的序列信息的基础上根据常规的DNA合成和遗传工程方法制备。如DNA合成、各种质粒的构建、将上述质粒转染到宿主细胞、转化体的培养、以及从培养物中回收蛋白的方法，可根据本领域技术人员公知的方法，文献(分子克隆，T.Maniatis等，CSH实验室(1983)，DNA克隆，亂Glover,IRLPRESS(1985))中记栽的方法，或者下文(II)中记载的方法来完成。下面提供如本发明所述肽的具体实例(1)包含选自SEQIDNO:2到6中的任何一种氨基酸序列的肽如上文所述，本发明基于如SEQIDNO:2到6所示的来源于WT1的改变的肽具有体内诱导CTLs活性的新发现。以前一直不知道如SEQIDNO:2到6所示的新肽的确具有体内诱导CTLs的活性。包含那些改变的肽中任何一种的肽可用作诱导CTLs的组合物中或癌症免疫治疗中使用的癌症疫苗中所包含的活性成分。具体地，本发明的肽包含下列序列中的任何一种:ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:2)，ArgTyrProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:3)，ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)，AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)，和AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:6)。在它们中，优选包含ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)序列的肽和包含AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)序列的肽。如本发明所述的肽的更具体的实例包括如下列(1-1)到(1-4)中所示的肽。(1-1)由选自SEQIDN0s:2到6中的任何一种氨基酸序列构成的肽由SEQIDNOs:2到6中任何一种氨基酸序列构成的肽的具体实例包括下列癌抗原肽由ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:2)序列构成的癌抗原肽，由ArgTyrProGlyValAlaProThrUu(SEQIDNO:3)序列构成的癌抗原肽，由ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)序列构成的癌抗原肽，由AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)序列构成的癌抗原肽，和由AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrUu(SEQIDNO:6)序列构成的癌抗原肽。在它们中，优选由ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)序列构成的癌抗原肽和由AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)序列构成的癌抗原肽。这些肽可根据上述肽合成的常规方法来制备。可用在下文中记载的用于人的动物模型检测这些肽在体内诱导CTLs的活性。(1-2)包含SEQIDNOs:2到6中任何一种氨基酸序列，并含有基序结构的肽已知在HLA分子中存在许多亚型，并且结合每种亚型的抗原肽的氨基酸序列遵循一定的规律(结合基序)。也已知，对于HLA-A24的结合基序来说，第2位上的氨基酸是酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、或色氨酸(Trp)，并且在由8到11个氨基酸残基构成的肽中，C-末端的氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)、或甲硫氨酸(Met)(J.Immunol.，152，p3913，1994，Immunogenetics,41，pl78，1995，J.Immunol.,155，p4307，1994)。基于该规律，如本发明所述的肽的实例还包括由io个氨基酸残基构成的狀，其中将Phe、Leu、Ile、Trp、或Met添加到任何一种由9个氨基酸残基构成的癌抗原肽的C末端ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDN(h2)，ArgTyrProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:3)，ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)，AlaTyrLeuProAlaValProSerUu(SEQIDNO:5)，或者AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:6)，以及由11个氨基酸残基构成的肽，其中将Phe，Leu，lie,Trp，或者Met进一步添加到任何一种所述的由IO个氨基酸残基构成的肽的C末端，所有这些肽都具有体内诱导CTLs的活性。这些肽可根据上述肽合成的常规方法合成。可用下文中记载的用于人的动物模型检测这些肽在体内诱导CTLs的活性。(l-3)包含SEQIDNOs:2到6中任何一种氨基酸序列的表位肽近来，已经证明许多CTL表位(抗原肽)相互连接的肽(表位肽)具有体内有效诱导CTLs的活性。例如，JournalofImmunology1998,161:3186-3194记载了其中来源于癌抗原蛋白，PSA的HLA-A2，-A3，-All,B53限制性CTL表位互相连接的约30个氨基酸的肽在体内能诱导特异于相关CTL表位的CTLs。同样地，已经证明CTL表位和辅助表位相互连接的肽(表位肽)能有效地诱导CTLs。辅助表位指能激活CD4阳性T细胞的肽(Immunity.,1:751，1994)，并且已知包括来源于乙型肝炎病毒的HBVcl28-140和来源于破伤风毒素的TT947-967。据信被辅助表位激活的CD4阳性T细胞在对消灭癌症的免疫反应中起重要作用，因为它们发挥例如诱导CTL分化和维持CTLs，以及激活包括巨噬细胞的效应细胞的作用。这种辅助表位和CTL表位互相连接的肽的实例，例如JournalofImmunology1999，162:3915-3925描述了一种编码与6个HLA-A2限制性抗原肽，3个来源于HBV的HLA-All限制性抗原肽，以及辅助表位(小基因)连接形成的肽的DNA在体内能有效诱导针对相关表位产生应答的CTLs。另外，已经在临床实验中检验了CTL表位(由黑素瘤抗原的笫280到288位氨基酸残基构成的癌抗原肽，gpl00)和辅助表位(破伤风毒素来源的T辅助表位)相互连接的肽(ClinicalCancerRes.,2001,7:3012-3024)。基于这些发现，其中癌抗原肽或在上述(1-1)或(1-2)中所示的肽与各种表位连接的，并具有体内诱导CTLs活性的肽(表位肽)，也作为如本发明所述的肽的实例。假使与本发明的癌抗原肽相连的表位是CTL表位，那么可用的CTL表位包括那些来自WT1的表位，其受限于HLA-Al、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-All、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401、-Cw0602、等等。可以是两个或更多的表位相连接，基于对结合各种HLA分子的抗原肽的分析，一CTL表位可以为8到14个氨基酸残基长(Immunogenetics，41:178，1995)。假使与本发明的抗原肽相连的表位是辅助表位，那么辅助表位可以是例如上述来源于乙型肝炎病毒的HBVcl28-140和来源于破伤风毒素的TT947-967。辅助表位的长度可以是约13到约30，优选约13到约17个氨基酸残基。如本发明所述的表位肽的具体实例包括SEQIDNOs:2到6中任何一种的一个或更多氨基酸序列与辅助表位相连的肽。更具体地，例如，SEQIDNOs:2到6中任何一种的一个或多个氨基酸序列与来源于破伤风毒素的辅助表位(例如，PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgValProLysValSerAlaSerHisLeuGlujSEQIDNO:32)相连的肽，以及SEQIDNOs:2到6中任何一种的一个或多个氨基酸序列与AlaGinTyrlieLysAlaAsnSerLysPhelieGlylieThrGluUu(SEQIDNO:50，ClinicalCancerRes.，2001，7:3012-3024)序列相连的肽。那些各种表位相互连接的肽可根据上述肽合成的通常方法制备。也可以基于编码各种表位相互连接而形成的肽的多核苷酸的序列信息，根据常规DNA合成和遗传工程方法制备这些肽。即，这些肽可以通过将多核苷酸插入到公知的表达载体中、用重组表达栽体转化宿主细胞、培养转化体、以及从培养物中回收各种预期表位相互连接的表位肽的方法来制备。可以根据文献(分子克隆，T.Maniatis等，CSH实验室(1983)，DNA克隆，DM.Glover,IRLPRESS(1985))中记载的方法，或者在下文(II)中记载的那些方法来进行。可以用下文参考方案中记栽的用于人的动物模型检测由各种表位相互连接制备的表位肽在体内诱导CTLs的活性。(1-4)包含SEQIDN0s:2到6中任何一种的氨基酸序列的肽，并且其中N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基被修饰如上述(l-l)到(1-3)中所记载的本发明的肽中的N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基可被修饰。在本发明的上下文中，N-末端氨基酸的氨基的修饰基团包括具有l到6个碳原子的烷基、苯基、环烷基、酰基，等等，可选择其中的l到3个基团。酰基的实例包括具有1到6个碳原子的烷酰基、用苯基取代的具有1到6个碳原子的烷酰基、用具有5到7个碳原子的环烷基取代的羰基、具有1到6个碳原子的烷基磺酰基、苯磺酰基、具有2到6个碳原子的烷氧羰基、用苯基取代的烷氧羰基、用具有5到7个碳原子的环烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基、等等。C-末端氨基酸的羧基被修饰的肽包括酯和酰胺。具体的酯包括Cl-C6烷基酯、用苯基取代的C0-C6烷基酯、C5-C7环烷酯、等等，而具体的酰胺包括酰胺、用一个或两个C1-C6烷基取代的酰胺、用被苯基取代的一个或两个C0-C6烷基取代的酰胺、形成编号5到7含有酰胺氮原子的氮杂环烷的酰胺，等等。(2)包含改变的氨基酸序列的肽，其中在选自SEQIDN0s:2到6中的任何一种氨基酸序列中含有经改变的氨基酸残基(多重改变的肽)如上所述，本发明是基于来源于WT1的如SEQIDNOs:2到6中所示的经改变的肽具有体内诱导CTLs活性的新发现。对那些具有在体内诱导CTLs活性的肽的氨基酸的额外改变可能导致产生具有相同或更有效的诱导CTLs的活性的多重改变的肽。基于这种观点，本发明提供包含一种相对于SEQIDNOs:2到6的肽中任何一种氨基酸序列经改变的氨基酸序列的肽(那些肽可在下文称为经多重改变的肽)。具体地，本发明提供包含经改变的氨基酸序列的肽，其中在选自SEQIDNOs:2，3，4，5和6中的任何一种氨基酸序列中含有氨基酸残基的改变，其具有诱导CTLs的活性，条件是从上述的肽的范围中排除包含SEQIDNO:7氨基酸序列的肽。在这里，氨基酸残基的"改变"意思是一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加，优选氨基酸残基的取代。对于包括氨基酸残基取代的改变，只要保留体内诱导CTLs的活性，可任意地决定所要取代的氨基酸残基的数量和位置。这种包含改变氨基酸序列的肽的实例包括下面所示的那些肽。如上所述，已经知道，对于HLA的结合基序来说，笫2位的氨基酸是酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、曱硫氨酸(Met)、或色氨酸(Trp)，在由8到11个氨基酸残基构成的肽的C末端的氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(lie)、色氨酸(Trp)、或曱碗氨酸(Met)(J.Immunol.，152，p3913，1994，Im國ogenetics，41，p178,1995，J.Immunol.，155，p4307，1994)。基于这个规律，如本发明所述的多重改变的肽可包含采用上述基序中的氨基酸残基来取代在SEQIDNOs:2到6中任何一种氨基酸序列中的第2和/或第9位上的氨基酸残基。包含经改变的第2位氨基酸残基的多重改变肽的具体实例包括含有下列氨基酸序列中任何一种的肽，并且其具有体内诱导CTLs的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>那些肽包括由上述SEQIDNOs:53到65中所示的任何一种氨基酸序列构成的肽，其具有体内诱导CTLs的活性。所有如SEQIDNOs:2到6所示的本发明的肽都是通过改变来源于人WT1的天然肽中第2位的氨基酸残基，从而获得具有有效诱导CTLs活性的改变的肽来得到的。在本发明的上下文中，本发明的多重改变的肽的第2位上的氨基酸残基优选为酪氨酸。另一方面，多重改变的肽的C末端的氨基酸残基可改变成上述基序可用的氨基酸残基。如本发明实施方案所述的多重改变的肽的具体实例包括含有下列氨基酸序列中的任何一种的肽，其具有体内诱导CTLs的活性和ArgTyrPheProAsnAlaProTyrPhe(SEQIDNO:12)，ArgTyrPheProAsnAlaProTyrTrp(SEQIDNO:13)，ArgTyrPheProAsnAlaProTyrlie(SEQIDNO:14)，ArgTyrPheProAsnAlaProTyrMet(SEQIDNO:15)，ArgTyrProGlyValAlaProThrPhe(SEQIDNO:16)，ArgTyrProGlyValAlaProThrTrp(SEQIDNO:17)，人rgTyrProGlyValAlaProThrlie(SEQIDNO:18)，人rgTyrProGlyValAlaProThrMet(SEQIDNO:19)，ArgTyrProSerCysGinLysLysTrp(SEQIDNO:20)，ArgTyrProSerCysGinLysLysLeu(SEQIDNO:21)，ArgTyrProSerCysGinLysLyslie(SEQIDNO:22)，ArgTyrProSerCysGinLysLysMet(SEQIDNO-23)AlaTyrLeuProAlaValProSerPhe(SEQIDNO24)，AlaTyrLeuProAlaValProSerTrp(SEQIDNO:25)，AlaTyrLeuProAlaValProSerlie(SEQIDNO:26)，AlaTyrLeuProAlaValProSerMet(SEQIDNO:27)，AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrPhe(SEQIDNO:28)，AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrTrp(SEQIDNO:29)，AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrlie(SEQIDNO二30)，AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrMet(SEQIDNO:31)。那些肽包括由上述SEQIDNOs:12到31中的任何一种氨基酸序列构成的肽，其具有体内诱导CTLs的活性。本发明的另一实例包括一种不仅含有包含第2位氨基酸残基改变的多重改变的肽的第2位氨基酸残基的改变，而且含有上述C末端氨基酸残基的改变的癌抗原肽。SEQIDNO:4氨基酸序列含有半胱氨酸残基，其在溶液中可被氧化形成二硫键。为了避免这种情况，可以采用另一种氨基酸残基如丙氨酸残基、丝氨酸残基等，或者在化学结构上类似于半胱氨酸残基的ot-氨基丁酸来取代半胱氨酸残基以提供多重改变的肽。如本发明具体实施方案所述的多重改变的肽的具体实例包括含有下列任何一种氨基酸序列的肽，其具有体内诱导CTLs的活性ArgTyrProSerSerGinLysLysPhe(SEQIDNO:66)，ArgTyrProSerAlaGinLysLysPhe(SEQIDNO:67)，和ArgTyrProSerAbuGinLysLysPhe(SEQIDNO:68)，其中Abu是a-氨基丁酸。这些肽包括由上述SEQIDNOs:66到68所示的任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽，其具有体内诱导CTLs的活性。那些肽可根据上述肽合成的一般方法来制备。可用下文参考方案中记载的用于人的动物模型检测那些肽在体内诱导CTLs的活性。上述的本发明的多重改变的肽还可通过保持上述(1-2)中所示的基序结构、与上述(l-3)中所示的多个表位相连，或者修饰上述(l-4)中所示的氨基或羧基基团来进行修饰。本发明的肽可用作例如，作为诱导CTLs的组合物或癌症疫苗中含有的活性成分，或者用于制备下文所述的抗原呈递细胞。(II)本发明的多核苷酸、表达载体、和转化体本发明也提供编码上述本发明多肽的多核苷酸。编码本发明肽的多核苷酸可以DNA或RNA的形式。基于本发明肽的氨基酸序列信息以及编码本发明肽的DNAs信息，可以很容易地制备那些多核苷酸。具体地，它们可以根据DNA合成的常规方法或PCR扩增制备。本发明的多核苷酸的实例包括编码含有ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:2)序列的肽的多核苷酸，编码含有ArgTyrProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:3)序列的肽的多核苷酸，编码含有ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)序列的肽的多核苷酸，编码含有AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)序列的肽的多核苷酸，编码含有AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:6)序列的肽的多核苷酸，编码含有ArgTyrProSerSerGinLysLysPhe(SEQIDNO:66)序列的肽的多核苷酸，编码含有ArgTyrProSerAlaGinLysLysPhe(SEQIDNO:67)序列的肽的多核苷酸，编码含有ArgTyrProSerAbuGinLysLysPhe(SEQIDNO:68)序列的肽的多核苷酸，其中Abu是oc-氨基丁酸。多核苷酸的具体实例包括编码含有上述(1-3)中SEQIDNO:2到6和66到68中任何一种氨基酸序列的表位肽的多核苷酸。更具体地，例如编码与辅助表位相连的SEQIDNO:2到6和66到68中任何一个或多个氨基酸序列的肽的多核苷酸，其包括编码SEQIDNO:2到6和66到68中任何一个或多个氨基酸序列与来源于破伤风毒素的辅助表位(例如，PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgValProLysValSerAlaSerHisUuGlu;SEQIDNO:32)相连的肽，以及SEQIDNO:2到6和66到68中任何一个或多个氨基酸序列与AlaGinTyrlieLysAlaAsnSerLysPhelieGlylieThrGluLeu(SEQIDNO:50，ClinicalCancerRes.，2001，7:3012-3024)序列相连的肽的多核苷酸。可将这样制备的本发明的多核苷酸插入到表达载体中制备表达本发明肽的重组表达载体。这里使用的表达载体可根据宿主和使用的目的进行适当地选择，包括质粒、噬菌体载体以及病毒载体。用于大肠杆菌宿主的载体的实例包括质粒如PUC118,pUC119，pBR322，和pCR3，以及噬菌体载体如AZAPII，和Agtll。用于酵母细胞的载体的实例包括pYES2，和pYEUra3。用于昆虫细胞宿主的载体的实例包括pAcSGHisNT-A。用于动物细胞宿主的栽体的实例包括质粒如pKCR、pC廳、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、和pRc/CMV，病毒载体如逆转录病毒栽体、腺病毒栽体以及腺相关病毒载体。如果需要，那些载体可包含如可诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、选择标记基因、终止子等因子。同样地，栽体可包含形成融合蛋白的硫氧还原蛋白、组氨酸标签，或者GST(谷胱甘肽S-转移酶)的附加序列从而便于分离和纯化。在这个实例中，可使用含有适合在宿主细胞中操作的启动子(lac，tac，trc，trp，CMV，SV40早期启动子，等等)的GST融合蛋白表达载体(即，pGEX4T)、含有标签序列如Myc，His的载体(即，pcDNA3.1/Myc-His)、以及表达含有硫氧还原蛋白或组氨酸标签融合蛋白的载体(pET32a)。可用下文参考方案中记栽的用于人的动物模型检测多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体在体内诱导CTLs的活性。本发明的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体可用于，例如制备本发明的肽、下文描述的基因治疗，或者制备下文描述的抗原呈递细胞。可将这样制备的本发明的表达载体转化到宿主中制备含有表达载体的转化体。这里使用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及动物细胞。大肠杆菌包括E.coliK-12系，如HB101林，C600林，JM109林，DH5a林和AD494(DE3)林。酵母包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。动物细胞包括L929细胞、BALB/c3T3细胞、C127细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、和Hela细胞。昆虫细胞包括sf9。可使用适合各自宿主细胞的常规转化方法来转化各种表达载体转化宿主细胞。具体方法包括钓磷酸盐法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔，以及使用用于基因转移的脂质(Lipofectamine，Lipofectin，Gibco-BRL)的方法。转化后，在含有选择标记的常规培养基中培养转化体，从而选择上述表达载体已经转入宿主细胞的转化体。可在适当的条件下培养这样制备的转化体，制备本发明的肽。可根据生物化学纯化的常规方法进一步分离和纯化多肽。纯化方法的实例包括盐沉淀、离子交换层析、吸附层析、亲和层析以及凝胶过滤层析。当本发明的多肽以含有硫氧还原蛋白、组氨酸标签、GST等的融合蛋白形式表达时，可通过基于这种融合蛋白或标签特性的纯化方法来分离和纯化多肽。(III)本发明的抗体本发明提供了能与如本发明所述的肽特异性结合的抗体。本发明的抗体不限于特异性抗体，可以是针对作为免疫原的本发明的肽的多克隆抗体或单克隆抗体。如上所述，本发明的抗体不限于特异性抗体，只要它们能特异性结合本发明的肽，其具体实例包括特异性结合由选自SEQIDN0s:2到6和66到68的任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽的抗体。制备抗体的方法是公知的，本发明的抗体可根据现有技术中一般公知方法来制备(CurrentprotocolsinMolecularBiology.Ausubel等编，(1987)Publish.JohnWileyandSons.Section11.12to11.13，Antibodies;ALaboratoryManual,Lane，H，D.等编,ColdSpringHarberLaboratoryPressPublisher,NewYork1989)。具体地，可使用本发明的肽(例如，由选自SEQIDNOs:2到6和66到68中的任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽)作为免疫原，来免疫非人动物如兔，随后以常规方法从免疫动物的血清中获得抗体的方法来制备抗体。在另一方面，可通过用本发明的肽(例如，由选自SEQIDNOs:2到6和66到68中的任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽)免疫非人动物如小鼠，通过细胞融合从获得的脾细胞和骨髓瘤细胞制备杂交瘤，并随后从杂交瘤中获得抗体(CurrentprotocolsinMolecularBiology,Ausubel等编(1987)Publish.JohnWileyandSons.Section11.4to11.11)的方法来制备单克隆抗体。可以采用适合宿主的各种佐剂增强免疫反应的方式来制备针对本发明肽的抗体。佐剂的实例包括弗氏佐剂、矿物凝胶，如氢氧化铝、表面活性剂，如溶血卵磷脂和多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、和用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium-parvum)。如上所述，通过用本发明的肽以常规方法适当免疫动物可以很容易地制备识别肽的抗体，和中和肽活性的抗体。可在亲和层析、免疫诊断等方法中使用这样的抗体。可从免疫印迹、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测定等方法中选出适当的免疫诊断方法。免疫诊断可用于诊断表达WT1基因的癌症，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎性癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌以及卵巢癌。(IV)本发明的抗原呈递细胞本发明提供在其表面呈递来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA—A24抗原之间形成的复合物的抗原呈递细胞。下文描述的实例证明，施用本发明的肽能够诱导CTLs,这表明在外周血单核细胞中存在能在其表面呈递来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的抗原呈递细胞，接着诱导得到了能够特异性破坏其表面呈递了这种复合物的癌细胞的CTLs。那些在其表面呈递来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的抗原呈递细胞，可用于下文描述的细胞治疗(DC治疗)中。本发明的抗原呈递细胞不限于特定细胞，只要它们能够在其表面呈递来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物，优选包括其表面呈递由SEQIDN0s:2到6和66到68中任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽和HLA-A24之间形成的复合物的树突细胞类抗原呈递细胞。可以通过例如，从癌症患者中分离具有抗原呈递能力的细胞，并在体外用本发明的肽进行脉冲，或者用本发明的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体转化来制备在细胞治疗中使用的抗原呈递细胞，以呈递HLA-A24抗原和来源于本发明肽的癌抗原肽之间形成的复合物。在本发明的上下文中，"具有抗原呈递能力的细胞"不限于特定细胞，只要是它是一种能在其细胞表面表达允许呈递本发明肽的HLA-A24抗原的细胞，例如优选据信具有特别高抗原呈递能力的树突细胞。用于脉冲至具有抗原呈递能力细胞的物质可以是本发明的肽，以及编码本发明肽的多核苷酸和含有该多核苷酸的表达载体。例如可通过从癌症患者中分离具有抗原呈递能力的细胞，在体外采用本发明的肽(例如，由SEQIDN0s:2到6和66到68中任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽)脉沖该细胞，以及制备一种HLA-A24抗原和来源于本发明肽的癌抗原肽(CancerImmunol.Immunother.，46:82，1998，J.Immunol.，158:pl796，1997，CancerRes.，59:p1184，1999)之间形成的复合物的方法来制备本发明的抗原呈递细胞。当使用树突细胞时，例如可通过使用Ficoll法从癌症患者的外周血中分离淋巴细胞，除去非粘附细胞，在存在GM-CSF和IL-4时培养粘附细胞以诱导树突细胞，以及采用本发明的肽培养和脉冲所述的树突细胞等方法来制备本发明的抗原呈递细胞。当通过用编码本发明肽的多核苷酸(例如，编码含有SEQIDNOs:2到6和66到68中任何一种序列的肽的多核苷酸)，或者用含有该多核苷酸的表达载体转化上述具有抗原呈递能力的细胞来制备本发明的抗原呈递细胞时，这种以DM形式制备的多核苷酸，可参考例如CancerRes.，56:p5672，1996,或J.Immunol.,161:p5607，1998的方法。相似地，这种以RNA形式制备的多核苷酸也允许用于制备抗原呈递细胞，可参考例如J.Exp.Med.，184:p465，1996。这样制备的本发明的抗原呈递细胞可用作诱导CTLs的组合物或癌症疫苗中含有的活性成分，或者用于下述细胞治疗(DC治疗)。(V)本发明的CTLs本发明提供识别来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的CTLs下文描述的实施例证明，施用本发明的肽能够诱导CTLs,这表明在外周血单核细胞中存在能在其表面呈递来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的抗原呈递细胞，接着诱导得到了能够特异性破坏其表面呈递了这种复合物的癌细胞的CTLs。那些特异性识别来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的CTLs，可用于下述的免疫治疗。本发明的CTLs不限于特定的CTLs，只要它们特异性识别来源于如本发明所述肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物即可，尤其包括特异性识别由SEQIDNOs:2到6和66到68中任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的CTXs。为了制备在采用的免疫治疗中使用的CTLs,例如，从患者中分离外周淋巴细胞，并采用本发明的肽(例如，由SEQIDNOs:2到6和66到68中任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽)，或者编码本发明肽的多核苷酸(例如，编码含有SEQIDNOs:2到6和66到"中任何一种氨基酸序列的肽的多核苷酸)或含有该多核苷酸的表达载体进行体夕卜刺激(JournalofExperimentalMedicine1999，190:1669)。这样制备的本发明的CTLs可用作癌症疫苗中含有的活性成分，或者用于所采用的免疫治疗。(VI)药物组合物、应用、以及作为癌症疫苗的方法上述本发明的肽、本发明的多核苷酸、本发明的表达载体、本发明的抗原呈递细胞、以及本发明的CTLs可以适当的形态可用作诱导CTLs的组合物或癌症疫苗中含有的活性成分，下面举例说明。(6-1)含有本发明的肽作为活性成分的癌症疫苗具有诱导CTLs活性的本发明的肽诱导的CTLs，可通过其细胞毒活性和淋巴因子产物来破坏癌细胞。因此，本发明的肽可用作治疗或预防癌症的癌症疫苗中的活性成分。在具体实施方案中，本发明提供含有本发明的肽作为有效成分的癌症疫苗(可用作癌症疫苗的药物组合物)。当向HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者施用本发明的癌症疫苗时，肽(例如，由SEQIDN0s:2到6和66到68中任何一种氨基酸序列构成的癌抗原肽)被呈递至抗原呈递细胞的HLA-A24抗原上，随后特异于含有HLA-A24抗原的复合物的CTLs有效地增殖，并且破坏癌细胞。通过这种方式，实现癌症的治疗或预防。本发明的癌症疫苗可用于治疗或预防WT1基因表达水平提高的癌症，包括血癌，如白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤，以及实体癌，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎性癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。在这一点上，同其它实施方案一样，本发明提供如本发明所述的肽在生产癌症疫苗中的应用，以及癌症的治疗或预防方法，其包括向需要治疗的HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者施用有效量的如本发明所述的肽。含有本发明的肽作为活性成分的癌症疫苗可含有单一CTL表位作为活性成分，或者含有与另一个肽(CTL表位或辅助表位)相连的表位肽作为活性成分。最近，已经证明，许多CTL表位肽(抗原肽)相互连接的表位肽具有体内有效诱导CTLs的活性。例如，JournalofImmunology1998，161:3186-3194描述了来源于癌抗原蛋白，PSA的HLA-A2，-A3,-All,B53-限制性CTL表位相互连接构成的约30个氨基酸的表位肽(抗原肽)能够在体内诱导特异于相关CTL表位的CTLs。同样地，已经证明，CTL表位和辅助表位相互连接的表位肽能够有效地i秀导CTLs。当将本发明的肽以这种表位肽的形式施用时，该肽被导入到抗原呈递细胞中，然后经历细胞内降解产生各自的抗原肽，这些抗原肽结合HLA抗原形成复合物。复合物被紧密地呈递在抗原呈递细胞的表面，随后特异于该复合物的CTLs发生有效地增殖，并且破坏癌细胞。通过这种方式，实现了癌症的治疗或预防。含有本发明的肽作为有效成分的癌症疫苗可与药学上可接受的栽体，如适当的佐剂一起施用，或者为了有效地建立细胞免疫，可以颗粒剂量的形式施用。为了实现这种目的，可采用文献(Clin.Microbiol.Rev.，7:277-289，1994)中记栽的那些佐剂，具体地包括细菌来源的成分、细胞因子、植物来源的成分、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卯磷脂和多聚醇、聚阴离子、肽以及油乳剂(乳剂配方)。同样地，也可能是脂质体制剂、其成分与直径几个微米的颗粒相结合的颗粒制剂，或者成分附着到脂质上的制剂。可通过例如真皮内、皮下、肌肉内或静脉内注射给药。尽管制剂中的本发明的肽的剂量可根据治疗的疾病、患者的年龄和体重等因素而变化，但是通常每隔几天到每隔几个月给予0.0001mg到lOOOmg本发明的肽，优选0.OOlmg到1000mg，更优选0.lmg到1Omg。(6-2)含有编码本发明肽的多核苷酸或表达载体作为活性成分的DNA疫苗不仅是上述本发明的肽，而且编码肽的多核苷酸和含有该多核苷酸的表达栽体也可作为用于癌症治疗或预防的DNA疫苗中的活性成分。在具体实施方案中，本发明提供了含有编码本发明的肽的多核苷酸，或者含有该多核苷酸的表达载体作为有效成分的癌症疫苗(可用作癌症疫苗的药物组合物)。在另一个具体实施方案中，本发明提供了癌症的治疗或预防方法，其包括向HLA-A24阳性和WT1阳性的患者施用有效量的如本发明所述的DNA疫苗。最近，已经证明，编码许多CTL表位(抗原肽)相互连接的表位肽的多核苷酸，或编码CTL表位和辅助表位相互连接的表位肽的多核苷酸具有体内有效诱导CTLs的活性。例如，JournalofImmunology1999，162:3915-3925中记载了编码与6个HLA-A24限制性抗原肽和3个来源于HBV的HLA-All限制性抗原肽，以及辅助表位(小基因)连接的表位肽的DNA，具有在体内有效诱导针对相关表位发生应答的CTLs。因此，整合了经一个或多个编码本发明的肽的多核苷酸相互连接而制备的，或经本发明的多核苷酸与编码另一个肽的多核苷酸连接而制备的多核苷酸的适当的表达载体，可作为癌症疫苗中的活性成分。下列方法可被用于允许本发明的多核苷酸作为癌症疫苗(DM疫苗)的活性成分。可使用病毒载体、或根据其它方法(Nikkei-Science，4月，1994，pp.20-45;Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994);Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中引用的参考资料)中的任何一种将本发明的多核苷酸导入到细胞中。使用病毒栽体的方法的实例包括将本发明的DNA整合至DNA或RNA病毒中，以及导入到细胞中的方法，这些病毒如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或新培斯病毒(Sindbisvirus)。在这些方法中，特別优选那些使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、或痘苗病毒的方法。其它方法包括肌肉内直接注射表达质粒的方法(DNA免疫)、脂质体法、Lipofectin法、显微注射、钓磷酸盐法以及电穿孔，特别优选DNA免疫和脂质体法。在实践中，为了允许本发明的多核苷酸用作药物，有将多核苷酸直接导入机体中的体内方法，和从人体中分离某种细胞，体外将DNA导入所述细胞后，再将该细胞重新导入机体中的体外方法(Nikkei-Science,4月，1994，pp.20-45;Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994);Jikkemi-Igaku-Zokan，12(15)，1994;及其引用的参考资料)。更优选体内方法。当采用体内方法时，可根据待治疗的疾病和症状以及其它因素采取任何适当的途径来施用多核苷酸。例如，可通过静脉内、动脉内、皮下、真皮内、肌肉内等途径施用。在采用体内方法时，组合物可以各种剂量形式，如溶液形式施用，并且总是制成，例如含有本发明的多核苷酸作为活性成分的注射剂的形式，其中也可根据需要，添加常规载体。如果在脂质体或膜融合脂质体(如仙台病毒(HVJ)-脂质体)中包含本发明的多核苷酸，那么组合物可以是脂质体制剂的形式，如悬浮液、冷冻药物、经离心浓缩的冷冻药物等。尽管制剂中含有的本发明的多核苷酸的剂量可根据待治疗的疾病、患者的年龄和体重等因素而变化，但是常规的每隔几天到每隔几个月施用0.0001mg到100mg本发明的多核苷酸，优选0.001mg到10mg。当向癌症患者施用本发明的多核苷酸时，相应于多核普酸的多肽在抗原呈递细胞中高效表达。然后，通过细胞内降解产生的各自的癌抗原肽与HLA抗原肽结合形成复合物，该复合物被紧密地呈递在抗原呈递细胞的细胞表面。随后特异于该复合物的CTLs高效增殖，并且破坏癌细胞。通过这种方式，实现了癌症的治疗或预防。含有本发明的多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体作为活性成分的本发明的癌症疫苗可用于治疗或预防WT1基因表达水平增高的癌症，包括血癌，如白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤，以及实体癌，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎性癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。(6-3)含有本发明的抗原呈递细胞作为活性成分的癌症疫苗本发明提供含有本发明的抗原呈递细胞作为活性成分的癌症疫苗。最近，已有细胞治疗(DC治疗)的报道，其中从癌症患者的外周血中分离淋巴细胞，并体外用肽等物质脉冲经淋巴细胞诱导产生的树突细胞从而制备抗原呈递细胞，然后将其通过皮下注射或其它方式输送回患者体内(CancerImmunol.Immunother.，46:82，1998，J.Immunol.,158:p1796，1997，CancerRes.，59:pll84，1999，CancerRes.，56:p5672，1996，J.Immunol.，161:p5607，1998,J.Exp.Med.，184:p465，1996)。因此，含有本发明的抗原呈递细胞作为活性成分的癌症疫苗可用作细胞治疗中所采用的癌症疫苗的活性成分。含有本发明的抗原呈递细胞作为活性成分的癌症疫苗优选含有生理盐水、磷酸緩沖盐(PBS)、培养基、或类似物以稳定地维持抗原呈递细胞。其可通过，例如静脉内、皮下、或真皮内施用。剂量例如是上述文献中记载的那些剂量。通过将癌症疫苗重新导入到患者的机体中，在HLA-A24阳性和WT1阳性的患者中能够有效地诱导特异的CTLs从而实现癌症的治疗或预防。含有本发明的抗原呈递细胞作为活性成分的癌症疫苗可用于治疗或预防WT1基因表达水平增高的癌症，包括血癌，如白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤，以及实体癌，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎性癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。(6-4)含有本发明的CTL作为活性成分的癌症疫苗本发明提供含有本发明的CTL作为活性成分的癌症疫苗(可用作癌症疫苗的药物组合物)。本发明的CTL用于下文采用的免疫治疗。对于黑素瘤，已经观察到，采用体外大量培养从患者他/她自身获得的肿瘤浸润T细胞，然后重新输回患者的免疫治疗实现了一定的治疗效果(J.Natl.Cancer.Inst.，86:1159，1994)。同样地，在小鼠黑素瘤中，通过体外用癌抗原肽TRP-2刺激脾细胞，从而使特异于癌抗原肽的CTLs增殖，以及将所述的CTLs施用到移植黑素瘤的小鼠中，已经观察到代谢受到抑制(J.Exp.Med.，185:453，1997)。这是由于特异性识别抗原呈递细胞上的HLA抗原和癌抗原肽之间形成的复合物的CTLs体外增殖所致。因此，包括使用如本发明所述的肽、或多核苷酸或表达载体来体外刺激患者外周血淋巴细胞用以增殖肿瘤特异CTLs，随后将CTLs输送回患者的治疗癌症的方法被认为是有效的。因此，本发明的CTLs可用作在采用的免疫治疗中所采用的癌症疫苗中含有的活性成分。包含本发明的CTLs作为活性成分的癌症疫苗优选含有生理盐水、磷酸緩冲盐(PBS)、培养基、或类似物质以稳定地维持CTLs。其可通过，例如静脉内、皮下、或真皮内施用。剂量例如是上述文献中描述的那些剂量。通过将癌症疫苗重新导入到患者体内，在HLA-A24阳性和WT1阳性患者中增强了CTLs对癌细胞的细胞毒效应，并且破坏癌细胞，从而实现了癌症的治疗。含有本发明的CTLs作为活性成分的癌症疫苗可用于治疗或预防WT1基因表达水平增高的癌症，包括血癌，如白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤，以及实体癌，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎性癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。(VII)含有基于SEQIDNO:7氨基酸序列的肽的癌症疫苗在本发明中，已经证明，具有ArgValProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:7)氨基酸序列的肽具有体内诱导CTLs的活性。在WOOO/18795中，由SEQIDNO:7氨基酸序列构成的癌抗原肽被描述为具有期望结合HLA-A24抗原序列的肽。然而，在本发明中首次发现，该肽具有体内诱导CTLs的活性，并可作为癌症疫苗。因此，本发明提供含有从如下组中选出的任何一种物质的药物组合物或癌症疫苗a)含有SEQIDNO:7氨基酸序列的肽，b)编码上述a)所示肽的多核苷酸，c)含有上述b)所示多核苷酸的表达载体，d)含有上述c)所示表达载体的细胞，e)在其表面呈递来源于上述a)所示肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的抗原呈递细胞，和f)能识别来源于上述a)所示肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的CTL。此外，本发明也提供上述肽、多核苷酸、表达栽体、转化体、抗原呈递细胞和CTL中的任何一种在制备癌症疫苗中的应用，以及癌症的治疗或预防方法，其包括向需要治疗的HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者施用治疗或预防有效量的那些物质中的任何一种。制备上述a)到f)中所述的那些物质的方法，以及它们用作癌症疫苗的应用与如本发明所述的肽、多核苷酸、表达载体、抗原呈递细胞和CTL的各部分均描述的一样。实施例本发明通过下列实施例进一步举例说明，但是在任何方面不受这些实施例的限制。下文参考方案描述表达HLA-A24的转基因小鼠的制备方法，详细描述见W002/47474(国际公开日2002年6月20日，PCT/JP01/10885(国际申请日2001年12月12日，(优先权日2000年12月13日)))。参考lHLA-A2402基因组DNA片段的克隆(1)HLA-A2402基因组DNA片段的克隆为了达到通过PCR克隆人HLA—A2402基因组DNA的目的，培养人肿瘤细胞系，RERF-LC-AI细胞(RikenCellBankRCB0444)，并采用基因组Prep细胞和组织DNA分离试剂盒(Amersham),根据所附的方案纯化人基因组DNA。然后在GeneBank数据库中搜索构建嵌合HLA基因所需的HLA-A2402基因组DNA，数据库显示登记号为No.Z72422的序列相关，但是一270bp的启动子区没有登记。目的转基因小鼠的构建需要启动子、外显子1到3和内含子1到3。为了克隆含有启动子的HLA-A2402基因组DNA，进行PCR，使用上游引物，HLA26-1F:5，-CCCAAGCTTACTCTCTGGCACCAAACTCCATGGGAT-3，(36个碱基，SEQIDNO:36)，该引物参照在日本人中经常发现的HLA-A2601启动子的核苷酸序列(登记号No.AB005048)设计；下游引物，A24-Bgl1130:5，-CGGGAGATCTACAGGCGATCAGGTAGGCGC-3，(30个碱基，SEQIDNO:37)，该引物包含一位于内含子3核苷酸序列中的修饰，具体地，登记号No.Z72422的5，端第1282位上的核苷酸从G变为A。由于下列原因需要对所述的核苷酸进行修饰。本参考方案目的是获得表达由HLA-A2402的外显子1-3和H-2Kb的外显子4-8构成的嵌合HLA的转基因小鼠，可通过将HLA-A2402基因组DNA内含子3中BamHI酶切位点的上游区和H-2Kb基因组DNA内含子3的下游区相连构建嵌合HLA，对于这个末端，必需在HLA-A2402的内含子3中构建人工BglII酶切位点。然后使用具有高度3，—5，外切酶活性的天然PfuDNA聚合酶(Stratagene)和上述引物对，根据所附的方案，PCR克隆HLA-A2402基因组DNA片段。该PCR反应包括95'C热处理45秒，35个反应循环，每个循环95'C45秒，66'C1分钟，72'C4分钟，以及72'C反应10分钟，随后冷却到4'C。将扩增的基因片段连接到噬菌粒栽体，pBluescript的HindIII和BamHI酶切位点从而获得重组质粒。通过热休克法，在42'C将重组质粒导入到大肠杆菌JM109(Toyobo)中，在涂布有X-Gal和IPTG的含有氨爷青霉素(50pg/ml)的LB琼脂培养基(1%细菌胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，2%琼脂)上挑选那些已导入了重组质粒的大肠杆菌的白色菌落从而获得转化体。(2)HLA-A2402启动子区核苷酸序列的测定在含有氨苄青霉素的LB培养基(3ml)中过夜培养在上述方法中获得的4个转化体，随后通过碱裂解法纯化每个转化体中含有的质粒克隆(CURRENTPROTOCOLSINM0LECUURBI0L0GY，F.M.Ausubel等编，JohnWiley&Sons,Inc.)。然后通过ABIPRISMTM377DNA测序系统(PE生物系统)测定其核苷酸序列。根据所附的方案，使用ABIPRISMTM染色终止循环测序预备反应试剂盒(ABIPRISMTMDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionkit)(PE生物系统)对测序样品进行测序，以测定每个克隆的序列。当比较各自克隆的启动子时，结果显示它们完全相同。因此，测定了HLA-A2402启动子区的核苷酸序列，该序列一直没有在GenBank数据库登记。将登记号No.Z72422的核苷酸序列与各自克隆的核苷酸序列比较，显示有1个无PCR突变的正常克隆。参考2克隆H-2Kb基因组DNA片段(1)H-2Kb基因组DNA片段的克隆培养小鼠肿瘤细胞系EL4(ATCCT1B-39)，纯化小鼠基因组DNA并用于PCR克隆。使用适合扩增长链DNA的TaKaRaLATaqTM(TakaraShuzo)，根据所附的方案进行DNA的纯化。然后搜索GenBank数据库寻找构建嵌合HLA基因所需的H-2Kb基因，结果显示所述基因被分成登记号Nos.v00746和v00747的两个片段。H-2Kb的内含子3中游以上的上游1594bp区域被登记为v00746，H-2Kb的内含子7中游以下的下游1837bp区域被登记为v00747。因为内含子3中没有BamHI酶切位点，因此数据库中被分割和登记为v00746和v00747的H-2Kb基因，被认为长度不完整。在H-2Kb基因中有同源假基因或高度同源基因(Cell.,25:683，1981)。根据所附的方案用TaKaRaLATaqTM(TakaraShuzo)进行PCR，j吏用上游引物H-2KBF3:5，一CGCAGGCTCTCACACTATTCAGGTGATCTC-3，(30个碱基，SEQIDNO:38)，其与所述的互补基因具有低同源性，并被v00746的外显子3编码；下游引物11-2KB3R:5，-CGGAATTCCGAGTCTCTGATCTTTAGCCCTGGGGGCTC-3,(38个碱基，SEQIDNO:39)，其相应于具有在末端添加了EcoRI酶切位点的v00747，并且使用上述经过纯化的小鼠基因组DNA作为模板。PCR包括25个反应循环，98。C10秒钟，66。C4分钟，以及68。C反应10分钟，随后冷却到4'C。将扩增的基因片段连接到噬菌粒载体pBluescript的Kpnl和EcoRI的酶切位点从而获得重组质粒。通过热休克法，在42'C将重组质粒引入到大肠杆菌JM109(Toyobo)中，在涂布有X-Gal和IPTG的含有氨节青霉素的LB琼脂培养基上挑选那些已导入了重组质粒的大肠杆菌的白色菌落，从而获得转化体。在含有氨节青霉素的LB培养基(3ml)中过夜培养3个转化体。纯化每个转化体中含有的质粒克隆，并以上述相似的方法进行核苷酸序列的分析。分别将3个克隆的核苦酸序列和v00747的核苷酸序列进行比较，显示在2个克隆中分别有一个PCR突变，在另一个克隆中有3个PCR突变。在这3个克隆中有5个通常发现的核普酸，其不同于v00747的那些核苷酸。在相当于内含子6的区域和3，非编码区中发现了这些核苷酸。此外，未登记的内含子3区域中含有由不同于3个克隆中的PCR突变获得的核苷酸。因而测定关于未登记区的核苷酸序列在一定程度上是不可能的，其可在使用具有高3，—5，核酸外切酶活性的聚合酶重新克隆未登记的内含子3区域之后获得。(2)H-2r内含子3核苷酸序列的测定为了测定未登记区域的核苷酸序列，用经过纯化的小鼠基因组DNA作为模板，根据所附的方案用天然PfuDNA聚合酶(Stratagene)，通过PCR克隆含有未登记的内含子3区域的区域。使用上游引物H-2kbF5进4亍PCR反应5，-AGGACTTGGACTCTGAGAGGCAGGGTCITS'(29个碱基，SEQIDNO:40)，其登记号为v00746;下游引物H-2kb5R:5，-CATAGTCCCCTCCTTTTCCACCTGTGAGAA-3，(30个碱基，SEQIDNO:41)，其登记为v00747。PCR包括95'C热处理45秒，25个反应循环，每个循环为95'C45秒，68'Cl分钟，72'C4分钟，以及在72'C反应10分钟，随后冷却到4'C。将扩增的基因片段连接到噬菌粒载体pBluescript的BamHI和BglII的酶切位点以获得重组质粒。通过热休克法，在42'C将重组质粒导入到大肠杆菌JM109(Toyobo)中，在涂布有X-Gal和IPTG的含有氨千青霉素(50pg/ml)的LB琼脂培养基(l。/。细菌胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，2%琼脂)上挑选已导入了重组质粒的大肠杆菌的白色菌落以获得转化体。在含有氨苄青霉素的LB培养基(3ml)中过夜培养5个转化体，纯化每个转化体中含有的质粒克隆，并以上述类似的方法进行核苷酸序列的分析。分别比较分析的克隆子的内含子3区域，结果显示序列完全相同。因而测定内含子3区域的核苷酸序列。另外，从未登记区中的BamHI位点到v00747之间的区域显示是463bp。(3)H-2r基因组DNA的构建由于测定了上述(2)中未登记的核苷酸序列，从而确定了构建目的嵌合HLA基因必需的H-2r基因组DNA的全部核苷酸序列。变得清楚的是，通过结合上述获得的两个克隆，即，在5，-和3，-区，分别是无PCR突变的H-2Kb#20和无PCR突变的H-2Kb#26,可构建目的H-2r基因组DNA。因此，通过限制性酶切割这些克隆，并将各自无PCR突变的区域结合从而构建得到无PCR突变的H-2r基因组DNA。在图1中显示构建的示意图。将两个克隆都在BglII和EcoRI的酶切位点切割并且连接，获得重组质粒。通过热休克法，在42'C将重组质粒导入到大肠杆菌JM109(Toyobo)中，在涂布有X-Gal和IPTG的含有氨节青霉素的LB琼脂培养基上挑选已导入重组质粒的大肠杆菌的白色菌落，得到转化体。在含有氨苄青霉素的LB培养基(3ml)中过夜培养3个转化体。通过碱裂解法纯化每个转化体中含有的质粒克隆，并通过上迷相似的方法进行序列分析。结果，序列分析显示所有的转化体都含有编码无PCR突变的H-2K-基因组DNA的质粒。这里获得的H-2lT基因组DNA的核苷酸序列对应于从包括SEQIDNO:33的第1551位核苷酸起的下游核苷酸序列，其将在下面描述。参考3嵌合基因组DNA(HLA-A2402/KbDNA)的构建在BglII酶切位点切割上述参考方案1中获得的含有HLA-A2402基因组DNA的质粒HLA-A2402#l,在BamHI酶切位点切割上述参考方案2中获得的含有H-2Kb基因组DM的质粒H-2Kb#20/26，将得到的片段连接，获得重组质粒。在图2中显示构建示意图。通过热休克法，在42'C将重组质粒导入到大肠杆菌JM109(Toyobo)中，在涂布有X-Gal和IPTG的含有氨爷青霉素的LB琼脂培养基上挑选已导入重组质粒的大肠杆菌的白色菌落，得到转化体。在含有氨苄青霉素的LB培养基(3ml)中过夜培养10个转化体。纯化每一转化体中含有的质粒克隆，并以上述类似的方法进行序列分析。结果，序列分析显示3个转化体含有带有目的嵌合基因HLA-A2402/KbDNA的质粒，其可简单地称作"A2402/KbDNA"。构建得到的HLA-A2402/Kb的基因组序列如SEQIDNO:33所示。参考4嵌合体基因组DNA的剪接分析使用ElectroGeneTransferGTE-IO(Shimadzu)，根据所附的方案，用构建的嵌合HLA基因(HLA-A2402/r基因)转染小鼠肿瘤细胞系EL4。2天后，使用IS0GEN(Nippon基因)，根据所附的方案纯化经过转染的EL4细胞和未转染的EL4细胞的总RNA。使用SuperscriptChoice系统(GIBC0BRL)，根据所附的方案4吏用01igo(dT)^"和一部分所述的RNA作为模板进行逆转录，合成cDNA。另外，使用天然PfuDNA聚合酶(Stratagene)以及一部分所述的cDNA作为模板，通过PCR特异性扩增嵌合基因。进行PCR反应，使用上游引物嵌合体一F2:5'-CGAACCCTCGTCCTGCTACTCTC-3，(23个碱基，SEQIDNO:42)，其在HLA-A2402基因的外显子1中编码并与H-2Kb基因具有较低同源性，以及下游引物嵌合体-R2:5，-AGCATAGTCCCCTCCTTTTCCAC-3，(23个碱基，SEQIDN0:43)，其在H-2Kb基因的外显子8中编码并与HLA-A2402基因具有较低同源性，反应条件是95'C热处理45秒，40个反应循环，每个循环是95'C45秒，53'C1分钟，和72'C2分钟，以及在72'C反应10分钟，随后冷却到4'C。结果，仅在转染的EL4细胞中特异性扩增出约1.lkb的基因片段。基于此结果，可以估计转移的嵌合基因组DNA在小鼠细胞中被转录，即，HLA启动子发挥作用，并且在预测位置被剪接的mRNA发生表达。对通过上述PCR扩增的片段进行测序，与所预期的那样，确定了编码HLA-A2402/Kb的cDNA的碱基序列。编码所述HLA-A2402/Kb的cDM的碱基序列如SEQIDNO:34所示，在SEQIDNO:35中显示其氨基酸序列。此外，图3到5显示以平行排列的HLA-A2402/r的基因组序列(SEQIDNO:33)和cDNA序列(SEQIDNO:34)之间的关系。参考5用于微注射的DNA溶液的制备用限制性酶HindiII和EcoRI消化编码构建的嵌合HLA基因的质粒(11pg)，同样地用仅切割载体的限制性酶Dral来消化。凝胶电泳("/oSeaKe迈GTG，NipponGene)后，回收含有嵌合DNA的凝胶片段。通过用Prep-A-基因纯化试剂盒(BioRad)，根据所附的方案来纯化转基因，并溶于1/10TE緩沖液(10mMTris(pH8)，0.1mMEDTA(pH8))，制备用于微注射的DNA溶液。参考6向小鼠受精卵中的导入和转基因小鼠的鉴定使用C57BL/6小鼠系来源的受精卵进行嵌合基因构建体的注射。因为C57BL/6小鼠表达作为I类分子的H-2b而不是对HLA-A2402具有相似结合基序的H-2Kb，所以使用C57BL/6小鼠系的受精卵。因此，当施用HLA-A24限制性抗原肽时，所述的C57BL/6系转基因小鼠可有利地避免交叉反应，因为I类内源小鼠不在细胞表面呈递所述肽。在第一次注射中，将嵌合构建体注射到81个受精卵中，受精卵被转移到4个受体小鼠中，结果没有导致分娩。在笫二次注射中，将嵌合构建体注射到50个受精卵中，受精卵被转移到2个受体小鼠中，结果导致分娩产生4个后代，但是所有后代均在断奶前死亡。在第三次注射中，将嵌合构建体注射到101个受精卵中，受精卵被转移到4个受体小鼠中，结果导致分娩产生ll个后代，但是所有后代均在断奶前死亡。在笫四次注射中，将嵌合构建体注射到168个受精卵中，受精卵被转移到6个受体小鼠中，结果导致分娩产生22个后代，其中19个从哺乳中断奶。其中的4个，即，01-4、04-2、05-1和05-6被鉴定为转基因小鼠；然而，由于畸形01-4小鼠不能交配，断奶后不久05-6小鼠死亡。在笫五次注射中，将嵌合构建体注射到221个受精卵中，受精卵被转移到8个受体小鼠中，结果导致分娩产生14个后代，其中6个从哺乳中断奶。其中的3个，即，04-1、04-5和04-6被鉴定为转基因小鼠。在第六次注射中，将嵌合构建体注射到225个受精卵中，受精卵被转移到8个受体小鼠中，结果导致分娩产生13个后代，其中9个从哺乳中断奶。其中的3个，即，10-5、14-1和15-2被鉴定为转基因小鼠。通过采用TaKaRaLATaqTM(TakaraShuzo)，如所附的方案所述，与那些用于克隆HLA-A2402基因的相同引物(HLA26-IF,SEQIDNO:36;和A24-BglII30，SEQIDNO:37)和尾部DNA制剂作为模板进行PCR，应用1%琼脂糖凝胶电泳，并基于1.5kbpDNA条带的存在挑选小鼠。参考7转基因产物在转基因小鼠中的表达根据CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,J.E.Coliganl等编，JohnWiley&Sons,Inc所记载的方法，从在参考方案6中构建的8个转基因小鼠系04—2、05-1、04-1、04-5、04-6、10-5、14-1和15-2的小鼠中分离的脾中回收脾细胞。通过流式细胞仪，分析来源于转基因的蛋白，HLA-A2402/r在转基因小鼠脾细胞的细胞表面上的表达。使用从C57BL/6系制备的脾细胞作为对照。具体地，5><106个脾细胞经FITC标记的抗HLA抗体B9.12.1(Immunotech)染色。I类内源小鼠经FITC标记的抗H-2Kb单克隆抗体AF6-88.5(Pharmingen)染色。结果，5个种系，即，04-1、04-5、10-5、14-1和15-2显示对I类HLA特异性表达。其中，仅04-l系显示具有生殖能力。在另一方面，其它3个种系，即，04-6、04-2和05-1显示不对I类HLA特异性表达。因此，构建了8个转基因小鼠，但是，它们中仅04-l系显示I类表达方式并获得纯合性。参考8表达HLA-A2402的转化细胞的建立为了评价上述制备的转基因小鼠的CTL的诱导能力，建立了稳定表达HLA-2402/Kb的转化细胞Jurkat-A2402/Kb。(1)表达载体的构建从Tg小鼠中分离脾，并制备脾细胞。使用IS0GEN(NipponGene)，根据所附的方案制备总RNA。用Superscript选择系统(GIBC0BRL)，根据所附的方案，使用01igo(dT)"—"和一部分所述RM作为模板，进行逆转录，合成cDNA。接着通过LA-PCR试剂盒(TakaraShuzo)，根据所附的方案，使用一部分所述cDNA作为模板，使用上游引物chi.PFl:5，-CCCAAGCTTCGCCGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCGAA-3，(SEQIDN0:44);和下游引物chi.PR1:5，-CCGGAATTCTGTCTTCACGCTAGAGAATGAGGGTCATGAAC-3，(SEQIDNO:45)进行PCR。PCR包括95'C热处理45秒，25个反应循环，每个循环为95'C45秒，60'C1分钟，和68'C2分钟，以及72'C反应10分钟，随后冷却到4'C。将PCR扩增的基因导入到表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，构建编码HLA-A2402/Kb的表达载体。(2)导入至Jurfcat细胞中通过用Pvul限制性酶消化，线性化上述栽体(10yg)。采用基因转移装置(GIBCOBRL)，根据所附的方案，用构建的嵌合HLA基因转染5xl()6个Jurkat细胞(ATCCT1B-152)。将细胞以0.5个细胞/孔的密度接种在96孔平板内，在含有Genetic(0.6mg/ml)的培养基中培养。结果，在6个孔(6个克隆，A-2、A-4、A-6、A-9、A-10和A-ll)中观察到细胞增殖。其中，A-10显示转基因的表达最高，并且建立了所述的克隆Jurkat-A2402/Kb细胞。参考9转基因小鼠CTL诱导能力的试验已知人肿瘤抗原HER-2/neu在乳腺癌、卵巢癌和肺癌中过度表达，通过体外实验显示，从其来源的肽具有诱导HLA-A24阳性健康受试者外周血中特异性CTLs的活性(Int.J.Cancer.，87:553，2000)。采用来源于所述人肿瘤抗原的HLA-限制性肽HER-2/neu"。-m(SEQIDNO:46)和源自破伤风毒素的MHCII类I-Ab限制性辅助肽(PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpUuArgValProLysValSerAlaSerHisLeuGlu;SEQIDNO:32)免疫转基因小鼠，检查是否诱导出和用人免疫的情况一样的特异性CTLs。具体地，将HER-2/neun。-m和辅助肽在DMSO中分别调整到40mg/ml和20mg/ml，用生理盐水分别稀释到2mg/ml和1迈g/ml。使用玻璃注射器将它们与等量的弗氏不完全佐剂(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)混合，制备油包水乳液。将得到的制剂(200在尾根部经皮下注射到转基因小鼠(04-1系)中进行免疫。在实验开始后7天，分离脾，并在玻璃栽玻片的磨砂部分上研磨，回收并制备脾细胞。将用ACK緩沖液(0.15MNH4C1，10mMKHC03，0.1迈MEDTA，pH7.2-7.4)溶血处理过的一部分脾细胞暴露于X线辐射(2,000拉德)，用上述肽(100pg/ml)脉冲处理l小时，以().7xl0V孔的密度种植在24孔平板内。同时一起加入未辐射、未经肽脉冲处理的脾细胞(7xl07孔)，并在37'C再次刺激(肽的终浓度，1lig/ml)。在10ml含有10%FCS、10mMHEPES、20mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mMMEM非必需氨基酸、1%MEM维生素和55nM2-氢硫基乙醇的RPMI1640培养基的培养液(CTM培养液)中进行体外刺激6天。另一方面，将在参考方案8中制备的Jurkat-A2402/r细胞用5'Cr(3.7MBq/10'细胞)标记，并用上述肽以100pg/ml的浓度脉冲处理1小时。标记进行2小时以上，在标记开始1小时后，添加肽使其终浓度为100pg/ml。制备未经肽脉冲处理的细胞作为对照靶细胞。通过51Cr释i文试验测定CTL的i秀导活性(J.Immunol.，159:4753，1997)，其中向作为靶细胞的所述Jurkat-A2402/Kb细胞中加入预先制备的转基因小鼠的脾细胞制剂。结果显示在图6中。结果，观察到通过HER-2/neu78。-m的刺激谦导出特异性CTLs。此夕卜，使用MAGE-3m，(SEQIDNO:47)、CEA652-66。(SEQIDNO:48)和CEAm一2"(SEQIDNO:49)，以相同的方法检验CTL的诱导能力，已知这些肽也是《象HER-2/neu78。-m—样的HLA-A24限制性癌抗原肽。结果显示在图7到9中。结果，观察到通过这些已知HLA-A24限制性癌抗原肽的刺激诱导出特异性CTLs。这些结果显示，本发明的HLA-A24转基因小鼠是可用于HLA-A24限制性癌抗原蛋白或癌抗原肽体外评价的用于人的动物模型。实施例1来源于人WT1的天然肽和改变肽的CTL的诱导活性使用用于搜索能够结合HLA抗原的序列的BIMAS软件(http:〃bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/)来搜索人WT1的氨基酸序列，寻找预计能结合HLA-A24抗原的序列。该搜索鉴定了下列肽肽A:ArgMetPheProAs"laProTyrLeu(SEQIDNO:8)，肽B:ArgValProGlyValAlaProThrLeu(SEQIDNO:7)，肽C:ArgTrpProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:9)，肽D:GinTyrArglieHisThrHisGlyValPhe(SEQIDNO二10)和肽E:AlaTyrProGlyCysAsnLysArgTyrPhe(SEQIDNO:11)。肽A、B、C、D和E分别对应于人WT1氨基酸序列的从126到134、从302到310、从417到425、从285到294、以及从326to335位上的序列。使用Fmoc法合成这些肽。使用Fmoc法也合成如下变异肽，其中在天然型肽A到C中，第2位上的氨基酸变异为酪氨酸肽F:ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu(SEQIDNO:2)，肽G:ArgTyrProGlyValAlaProThrUu(SEQIDNO:3)和肽H:ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe(SEQIDNO:4)。使用在上述参考方案中构建的HLA-2402/Kb转基因小鼠评价每种抗原肽的免疫原性。为了评价每种肽的免疫原性，用一种肽免疫3只转基因小鼠。用每种合成肽联合破伤风毒素来源的小鼠MHCII类I-Ab限制性辅助肽(PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgValProLysValSerAlaSerHisLeuGlu;SEQIDNO:32)来免疫转基因小鼠。具体地，将每种抗原肽和辅助肽在DMS0中分别调整到40mg/m1和20mg/ml，用生理盐水分别稀释到2mg/ml和1mg/ml。使用玻璃注射器将它们与等量的弗氏不完全佐剂UFA)混合，制备油包水乳液。将得到的乳剂(200pi)在尾根部经皮下注射到HLA-A2402/r转基因小鼠中进行免疫。在实验开始后7天，分离脾，并在玻璃载玻片的磨砂部分上研磨，回收并制备脾细胞。将用ACK緩冲液(0.15MNILC1，10mMKHCO"0.1mMEDTA，pH7.2-7.4)溶血处理过的一部分脾细胞暴露于X线辐射(2，000拉德)，然后用上述肽(lOOpg/ml)脉冲处理1小时，以7xl06/孔的密度种植在24孔平板内。同时，一起加入非辐射、未经肽脉冲处理的脾细胞(7xl07孔)，在37'C体外刺激6天。体外刺激是在添加有10%FCS、10mMHEPES、20mML-谷氨酰胺、lmM丙酮酸钠、1mMMEM非必需氨基酸、1%MEM维生素和55pM2-氢硫基乙醇的RPMI1640培养基中进行的。接着，根据常规方法检验细胞毒活性。将用肽脉冲处理的Jurkat-A2402/Kb细胞(参考方案8)和Jurkat-人2402/^细胞作为耙细胞(T)。用51Cr(3.7MBq/l()6细胞)标记这些细胞并用肽以100pg/ml的浓度脉冲处理1小时(标记进行2小时以上，标记开始后1小时，加入肽)。使用体外刺激并培养的脾细胞作为效应细胞(E)。将它们以E/T比为80结合并反应，通过51Cr释放试验测定细胞毒活性(J.Immunol.，159:4753，1997)。结果显示在图10到17中。Y轴表示细胞毒活性，X轴上的数字l，2和3表示3只小鼠的编号。这些图显示，在上述的经检验的5个WT1天然肽中，仅肽B具有免疫原性。天然型肽B的第2位上的氨基酸改变为酪氨酸的改变型肽G，显示比肽B具有更高的免疫原性。同样地，尽管天然型肽A和C没有免疫原性，但是天然型肽A和C的第2位上的氨基酸改变为酪氨酸的改变型肽F和H，显示具有高免疫原性。这些结果证明，天然型肽B和改变型肽F，G和H显示出具有体内诱导CTLs活性的抗原肽的功能。实施例2泉源于人WT1的改变肽的CTL的诱导活性(II)以与实施例1相似的方法，使用Fmoc法合成使用BIMAS软件搜索和鉴定得到的具有预计结合HLA-A24抗原的序列的下列天然肽(肽K和L)，及其将天然型中的第2位氨基酸变异为酪氨酸的变异肽(肽I和J):肽K-AlaLeuUuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:51)，肽L:AsnGinMetAsnLeuGlyAlaThrUu(SEQIDNO:52),肽I:AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu(SEQIDNO:5)，和肽J:AsnTyrMetAsn"uGlyAlaThrLeu(SEQIDNO:6)。肽K和L分别对应于人WTl氨基酸序列的10到18位和239到247位的序列。肽I和J是经改变的肽，其中肽K和L中第2位的氨基酸分别变为酪氨酸。以与实施例1相似的方法评价这些天然和经改变的肽中每一种的免疫原性。结果显示在图18，19，21和"中。Y轴表示细胞毒活性，X轴中的数字l，2和3表示3只小鼠的编号。这些图显示，尽管天然型肽K和L没有免疫原性，但是改变型肽I和J都具有高免疫原性。结果证明，WT1改变型肽I和J显示出具有体内诱导细胞毒T细胞的抗原肽的功能。实施例3来源于人WT1的经改变的肽的细胞毒活性检验由改变肽诱导的效应细胞对天然肽的交叉反应性。由经改变型肽H免疫小鼠诱导获得的效应细胞(E)和经天然型肽C脉冲处理Jurkat-A2402/Kb细胞获得的靶细胞(T)，以E/T比为80结合并反应，通过"Cr释放试验测定细胞毒活性。结果显示在图20中。该图显示，通过WT1改变肽诱导的效应细胞显示出抗经改变型和天然型肽脉冲处理过的细胞的细胞毒活性。实施例4通过来源于人WT1的经改变的肽从人外周血单核细胞中诱导CTL从HLA-A2402阳性的健康供体中分离外周血单核细胞，以4xl06细胞/孔的密度置于24孔平板的孔内。向孔内加入10pM浓度的SEQIDNO:7的天然肽或SEQIDNO:3的改变肽，将混合物在含有45%RPMI1640、45。/UIV、10。/Q灭活的人AB血清、1x非必需氨基酸、25ng/ml2—氢硫基乙醇、50mg/ml链霉素以及50U/ml青霉素的培养基中培养一周。培养后，将细胞调整到2xl()6细胞/孔，用作下文的应答细胞。另一方面，将从同一健康供体中分离的外周血单核细胞与10pM这些肽中的任何一种一起培养4小时以完成用肽的脉冲，然后以30Gy进行辐射。将这些细胞调整到4xl()6细胞/孔，用作下文的刺激细胞。将这样制备的应答细胞和刺激细胞一起混合，向混合物中添加30U/ml的IL-2并培养。在一周的时间间隔内3次用刺激细胞对应答细胞进行类似的刺激。通过"Cr释放试验测定这样获得的那些细胞的细胞毒活性，其中通过将用"Cr标记的，用SEQIDNO:7的天然肽脉沖处理的HLA-A24阳性的C1R-A*2402细胞作为乾细胞(T)，与用SEQIDNO:7的天然肽或上述SEQIDNO:3的改变肽刺激的细胞(效应细胞)(E)，以E/T比为10、20或40反应，测定细胞毒活性。结果显示在图23中。该图显示改变肽可诱导识别天然肽的CTLs，并且显示比天然肽具有更好的诱导CTLs的活性。此外，将对WT1阳性和对HLA-A24阳性的肺癌细胞系，RERF-LC-AI细胞；对WT1阳性和对HLA-A2402阴性的肺癌细胞系，11-18细胞；或对WT1阴性和对HLA-A24阳性的肺癌细胞系，11-18细胞用作靶细胞，以相似的方法通过51Cr释放试验测定上述效应细胞的细胞毒活性。结果显示在图24中。该图显示用改变肽和天然肽刺激的效应细胞仅特异性地损伤对WT1和HLA-A2402都呈阳性的RERF-LC-AI细胞，这表明通过用该肽刺激诱导产生对WT1特异，并且是HLA-A2402限制性的CTLs。这也表明，改变肽显示比天然肽具有更好的诱导CTLs的活性。实施例5半胱氨酸残基被取代肽的CTL的诱导活性肽H(ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe.，SEQIDNO:4)在第5位上含有半胱氨酸残基。半胱氨酸残基在溶液中可被氧化形成二硫键。为了避免发生这种情况，合成用丝氨酸残基、丙氨酸残基或ot-氨基丁酸取代第5位上半胱氨酸残基的取代型肽M、N、和O，体内评价每种肽的免疫原性肽M:Arg-Tyr-Pro-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys-Phe(SEQIDNO:66)，肽N:Arg-Tyr-Pro-Ser-Ala-Gln-Lys-Lys-Phe(SEQIDNO:67)和肽0:Arg-Tyr-Pro-Ser-Abu-Gln-Lys-Lys-Phe(SEQIDNO:68)。使用Fmoc法合成这些取代型肽M、N、和0，并以与实施例l相似的方法评价它们的免疫原性。在细胞毒活性的试验中，将体外刺激并培养的脾细胞用作效应细胞(E)，以各种比例与靶细胞混合，通过"Cr释放试验测定效应细胞的细胞毒活性(J.Immunol.,1997;159:4753)。结果显示在图25到28中。在图中，纵轴表示细胞毒活性，横轴表示E/T比。该图显示用丝氨酸残基、丙氨酸残基或oc-氨基丁酸取代肽H中第5位上半胱氨酸残基的肽M、N、和O具有与未取代肽，肽H同等的免疫原性。实施例6丰胱氨酸残基被取代肽的细胞毒活性检验被取代肽诱导的效应细胞对未取代肽的交叉反应活性。将用肽M或N，用肽H，或不用任何肽脉沖处理的Jurkat-A2402/r靶细胞(T)与通过用肽M或N免疫小鼠诱导产生的效应细胞(E)反应，通过51Cr释放试验测定效应细胞的细胞毒活性。结果显示在图29和30中。这些图表明，通过取代肽诱导的效应细胞显示出抗所有用取代肽(肽M和N;图中的免疫肽)以及非取代肽(肽H)脉冲处理细胞的细胞毒活性。工业实用性根据本发明，具有体外诱导CTLs活性的WT1来源的HLA-A24限制性肽、编码所述肽的多核普酸、或含有该肽或多核苷酸的癌症疫苗。本发明的癌症疫苗可用于治疗许多癌症患者。序列表<110>HaruoSugiya迈aChugaiSeiyakuKabushikiKaisha药物有限公司<120>HLA-A24限制性癌抗原肽<130>540886HT〈140〉PCT/JP03/07463〈141〉2003-06-12<150〉JP2002-171518<151>2002-06-12<150>JP2002-275572<151〉2002-09-20<160〉68<210〉1<211〉449<212>PRT<213>人<400>1MetGlySerAspValArgAspLeuAsnAlaLeuLeuProAlaValPro151015SerLeuGlyGlyGlyGlyGlyCysAlaLeuProValSerGlyAlaAla202530GinTrpAlaProValLeuAspPheAlaProProGlyAlaSerAlaTyr354045GlySerLeuGlyGlyProAlaProProProAlaProProProProPro505560ProProProProHisSerPhelieLysGinGluProSerTrpGlyGly65707580AlaGluProHisGluGluGinCysLeuSerAlaPheThrValHisPhe859095SerGlyGinPheThrGlyThrAlaGlyAlaCysArgTyrGlyProPhe100105110GlyProProProProSerGinAlaSerSerGlyGinAlaArgMetPhe115120125ProAsnAlaProTyrLeuProSerCysLeuGluSerGinProAlalie130135140ArgAsnGinGlyTyrSerThrValThrPheAspGlyThrProSerTyr145150155160GlyHisThrProSerHisHisAlaAlaGinPheProAsnHisSerPhe165170175LysHisGluAspProMetGlyGinGinGlySerLeuGlyGluGinGin180185190TyrSerValProProProValTyrGlyCysHisThrProThrAspSer195200205CysThrGlySerGinAlaLeuLeuLeuArgThrProTyrSerSerAsp210215220AsnLeuTyrGinMetThrSerGinLeuGluCysMetThrTrpAsnGin225230235240MetAsnLeuGlyAlaThrLeuLysGlyValAlaAlaGlySerSerSer245250255SerValLysTrpThrGluGlyGinSerAsnHisSerThrGlyTyrGlu260265270SerAspAsnHisThrThrProlieLeuCysGlyAlaGinTyrArglie275280285HisThrHisGlyValPheArgGlylieGinAspValArgArgValPro290295300GlyValAlaProThrLeuValArgSerAlaSerGluThrSerGluLys305310315320ArgProPheMetCysAlaTyrProGlyCysAsnLysArgTyrPheLys325330335LeuSerHisLeuGinMetHisSerArgLysHisThrGlyGluLysPro340345350TyrGinCysAspPheLysAspCysGluArgArgPheSerArgSerAsp355360365GinLeuLys370CysLysThr385HisThrArgThrHisThrGlyLys405ArgTrpProSerCysGinLysLys420PheGinLysThr400ThrSerGluLysProPheSerCys410415PheAlaArgSerAspGluLeuVal425430ArgHisGinArgArgHisThrGlyValLysPro375380CysGinArgLysPheSerArgSerAspHisLeu390395ArgHisHisAsnMetHisGinArgAsnMetThrLysLeuGinLeuAla435440445Leu<210>2<211〉9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400>2ArgTyrPheProAsnAlaProTyrLeu15<210>3<211〉9<212>PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>3ArgTyrProGlyValAlaProThrLeu15<210>4<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223〉人工序列的说明合成肽〈400〉4ArgTyrProSerCysGinLysLysPhe15<210>5<211〉9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400>5AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu15<210〉6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人工序列的说明合成肽<400>6AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrLeu15<210>7<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223〉人工序列的说明合成肽<400>7ArgValProGlyValAlaProThrLeu15<210〉8〈211〉9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>8ArgMetPheProAsnAlaProTyrLeu15<210>9<211>9〈212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>9ArgTrpProSerCysGinLysLysPhe15<210〉10<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>10GinTyrArglieHisThrHisGlyValPhe1510<210>11<211>10<212>PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400〉11AlaTyrProGlyCysAsnLysArgTyrPhe1510<210>12<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>12ArgTyrPheProAsnAlaProTyrPhe15<210〉13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<柳〉13ArgTyrPheProAsnAlaProTyrTrp15<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400〉14ArgTyrPheProAsnAlaProTyrlie15<210>15<211〉9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400〉15ArgTyrPheProAsnAlaProTyrMet15<210〉16<211〉9<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉人工序列的说明合成肽<■〉16ArgTyrProGlyValAlaProThrPhe15<210>17<211>9<212〉PRT<213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列的说明合成肽<400>17ArgTyrProGlyValAlaProThrTrp15<210>18<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人工序列的说明合成肽<400〉18ArgTyrProGlyValAlaProThrlie15<210〉19<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400〉19ArgTyrProGlyValAlaProThrMet15<210>20<211>9<212〉PRT〈213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400〉20ArgTyrProSerCysGinLysLysTrp15<210〉21<211〉9<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400〉21ArgTyrProSerCysGinLysLysLeu15<210〉22<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>22ArgTyrProSerCysGinLysLyslie15<210〉23<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>23ArgTyrProSerCysGinLysLysMet15<210〉24<211〉9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400>24AlaTyrLeuProAlaValProSerPhe15<210>25<211>9<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽〈400〉25AlaTyrLeuProAlaValProSerTrp15<210>26<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>〈223〉人工序列的说明合成肽<400>26Ala.TyrLeuProAlaValProSerlie15<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400〉27AlaTyrLeuProAlaValProSerMet15<210〉28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400>28AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrPhe15<210>29<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人工序列的说明合成肽<400〉29AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrTrp15<210>30<211〉9<212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223>人工序列的说明合成肽<400〉30AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrlie15<210>31<211〉9<212〉PRT<213〉人工序列<220><223〉人工序列的说明合成肽<400>31AsnTyrMetAsnLeuGlyAlaThrMet15<210>32<211>21<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<■>32PheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgValProLysValSer151015AlaSerHisLeuGlu20<210〉33<211>3857<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的说明从1-1550位的DNA区来自人，从1551-3857位的DNA区来看小鼠<400>33aagcttactctctggcaccaaactccatgggatgatttttcttctagaagagtccaggtg60gacaggtaaggagtgggagtcagggagtccagttcagggacagaga^ttacgggatgaaaa120gtgaaaggagagggacggggcccatgccgagggtttctcccttgtttctcagacagctct180tgggcc肌gattcetgggagacattga^gacagagcgcttggcacagaagcagaggggtcag240ggcgaagtcccagggccccaggcgtggctctcagggtctcaggccccgaaggcggtgtat300ggattggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcc360caacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactccca420ttgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgctgttctaaagtcc480gcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgaggatggccgtcatggcgccc540cgaaccctcgtcctgctactctcgggggccctggccctgacccagacctgggcaggtgag600tgcggggtcgggagggaaacggcctctgcggggagaagca鄉ggcccgcctggcggggg660cgcaagacccgggaagccgcgccgggaggagggtcgggcgggtctcagccactcctcgtc720cccaggctcccactccatgaggtatttctccacatccgtgtcccggcccggccgcgggga780gccccgcttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcga840cgccgcgagcC柳gg3tggagccgcgggcgccgtgg咖gagcaggaggggccggagta900ttgggacgaggagacagggaaagtgaaggcccactcacagactgaccgagagaacctgcg960gatcgcgctccgctactacaaccagagcgaggccggtgagtgaccccggcccggggcgca1020ggtcacgacccctcatcccccacggacgggGCgggtcgcccacagtctccgggtccg卿1080tccaccccgaagccgcgggaccccgagacccttgccccgggagaggcccaggcgccttaa1140cccggtttcattttcagttttccccccgggttggtcggggccgggcgggg1200ctcgggggactgggctgaccgcggggtcggggccaggttctcacaccctccagatgatgt1260ttggctgcgacgtggggtcggacgggcgcttcctccgcgggtaccaccagtacgcctacg1320acggc犯ggattacatcgccctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatgg1380cggctcagatcaccaagcgc犯gtgggaggcggcccatgtggcggagcagcagagagcct1440acctggagggcacgtgcgtggacgggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgc1500tgcagcgcacgggtaccaggggccacggggcgcctacctgatcgcctgtagatcctgtgt1560gacacacctgtaccttgtcccccagagtcaggggctgggagtcattttctctggctacac1620acttagtgatggctgttcacttggactgacagttaatgttggtcagcaaggtgactacaa1680tggttgagtctcaatggtgtcaccttccaggatcatacagccctaattttaata_tgaact1740caaacaca^ttaaattagttattttccattccctcctccattctttgactacctctctc1800atgctattgaacatcacataaggatggccatgtttacccaatggctcatgtggattccct1860cttagcttctgagtcccaaaagaaaatgtgcagtcctgtgctgaggggaccagctctgct1920tttggtcactagtgcgatgacagttgaagtgtca^aca^cacatagttcactgtcatca1980ttgatttaactgagtcttgggtagatttcagtttgtcttgttaattgtgtgatttcttaa2040atcttccacacagattccccaaaggcccatgtgacccatcacagcagacctgaagataaa2100gtcaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgctgacatcaccctgacctggcag2160ttgaatggggaggagctgatccaggacatggagcttgtggagaccaggcctgcaggggat2220ggaaccttccagaagtgggcatctgtggtggtgcctcttgggaaggagcagta.ttacaca2280tgccatgtgtaccatcaggggctgcctgagcccctcaccctgagatgggg2340gtgggtgcagagct,ggggtcagggaaagctggagctttctgcagaccctgagctgctcag2400ggctg卿gctggggtcatgaccctcaccttcatttcttgtacctgtccttcccagagcc2460tcctccatccactgtctccaacatggcgaccgttgctgttctggttgtccttggagctgc2520aategtcactggagctgtggtggcttttgtgatgaagatgagaaggagaaacacaggtag2580g犯agggC3gagtctgagttttctctcagcggg獄acaggC3cax;ccca^cattgctactgaacttcctagtgtcaagatcttcctggaaaaggaggggactatgctctggctccaggtttggagtgaagttggagatgatgggagctctcttctaggtgcctgagttgtgccatgaaatttgttttgttttaccctaggctcccagaccgacactctagggtctgattggggaggggcacagaatccGCtgtgagtgagtgatgggttgtgaccctcattctctagcgtgaagamgctcttctcatatctcctgtgacatccagagcctccctgtgagcctatggactcaatgtgaagcaggaccctgtccctgcactgctctgtcttcaaacactgagggacatctgtagcctgtcaacttccacactgagaataataatttgaatggctgatttcttgttaatttcatggattgagttgatttgtttttttgaagaaataaatgattatgctgtgtgtatctgttggg織ggatggtgccgaggtgggctcagtttgctttgatcctctgggctctgttccctctatcactatgaacacagggaaggcctgagccttgccctgtctcagagactcggaattcctcctttagagtgtgctctgctcatcaatg2640gtctctaactgggtctgctgtcagttctgg2700ctctcacagcttttcttctcacaggtggaa2760agtgtggggacagagttgtcctggggacat2820gggaatccataatagctcctccagagaaat2880gaatatgtacatgtacatatgcatatacat2940tctgatctgtctctcccagattgtaaaggt3000atgtggacatgattgggtttcaggaactcc3060ttcgaatgttgtcttcacagtgatggttca3120gcctggagtggacttggtgacagacaatgt3180ctcagttctctttagtcaagtgtctgatgt3240aactgtggagcccagtccacccctctacac3300cccttccacagccaaccttgctggttcagc3360gctccatgctaccctgacctgcaactcctc3420taaccttgattgttatcatcttgacctagg3480aatgcttagaggttttgtttgtttgtttga3540agatgaataaacttccagaatctgggtcac3600agactgtagcagctgagtgtgaacagggct3660tgtgatggggccacacctccactgtgtcac3720ggcacatgctgagagtttgtggtcacaaag3780cccaggattatgagcccccagggctaaaga38403857<210〉34〈211〉1119<212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列的说明从1-618位的DNA区来自人，从619-1119位的DNA区来自小鼠〈400〉34atggccgtcMetAlaValMetgcgcccAlaPro5ArgThretcLeugtcVal10ctgLeuetaetcLeuLeutegSergggGly15gccAla48ctggccLeuAlactgLeuThr20ca_gaccGinThrtggTrpgcaAlaGly25tecSerHistecatgSerMet鄉Arg30tatTyrttcPhe96teca^caiSerThrtecSer35gtgValteceggSerArgcccProggcGly40cgcArggggGlygagGluccccgcProArg45ttcPheateliegccAla144gtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgeggttcgacagegacgec192ValGlyTyrValAspAspThrGinPheValArgPheAspSerAspAla505560gcgagecagaggatggagccgegggcgccgtggatagagcaggagggg240AlaSerGinArgMetGluProArgAlaProTrplieGluGinGluGly65707580ccggagtattgggacgaggagacagggaaagtgaaggeccacteacag288ProGluTyrTrpAspGluGluThrGlyLysValLysAlaHisSerGin859095actgaccgagagaacctgeggategcgetccgctactacaaccagage336ThrAspArgGluAsnLeuArglieAlaLeuArgTyrTyrAsnGinSer100105110gaggecggttctcacaccetccagatgatgtttggctgcgacgtgggg384GluAlaGlySerHisThrLeuGinMetMetPheGlyCysAspValGly115120125teggacgggcgcttcetccgcgggtaccaccagtacgectacgacggc432SerAspGlyArgPheLeuArgGlyTyrHisGinTyrAlaTyrAspGly130135140aaggattacategecctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcg480LysAspTyrlieAlaLeuLysGluAspLeuArgSerTrpThrAlaAla145150155160gacatggcggetcagateaccaagcgcaagtgggaggcggeccatgtg528AspMetAlaAlaGinlieThrLysArgLysTrpGluAlaAlaHisVal165170175gcggagcagcagagagectacctggagggcacgtgcgtggacgggetc576AlaGluGinGinArgAlaTyrLeuGluGlyThrCysValAspGlyLeu180185190cgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagc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9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400〉63AsnPheMetAsnLeuGlyAlaThrLeu15<210〉64<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明合成肽<400>64AsnMetMetAsnLeuGlyAlaThrLeu15<210>65<211〉9<212〉PRT<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的说明合成肽<400>65AsnTrpMetAsnLeuGlyAlaThrLeu15<210>66<211〉9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的说明合成肽<400>66ArgTyrProSerSerGinLysLysPhe15<210〉67〈211〉9<212>PRT<213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列的说明合成肽<400〉67ArgTyrProSerAlaGinLysLysPhe15<210>68<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220>〈223〉人工序列的说明合成肽<223〉第5位上的Xaa代表Abu<400>68ArgTyrProSerXaaGinLysLysPhe1权利要求1.一种包含如SEQIDNO5所示的氨基酸序列，即AlaTyrLeuProAlaValProSerLeu的肽。2.如权利要求l所迷的肽，其由SEQIDNO:5的氨基酸序列构成。3.编码如权利要求1或2所述的肽的多核苷酸。4.含有权利要求3的多核苷酸的表达载体。5.含有权利要求4的表达载体的细胞。6.制备如权利要求1或2所述的肽的方法，其包括在适于表达肽的条件下培养如权利要求5所述的细胞。7.与如权利要求1或2所述的肽特异性结合的抗体。8.—种在其表面呈递来源于如权利要求1或2所述的肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的抗原呈递细胞。9.如权利要求8所述的抗原呈递细胞，在其表面呈递由SEQIDNO:5的氨基酸序列构成的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物。10.—种识别来源于如权利要求1或2所述的肽的癌抗原肽和HLA-A24抗原之间形成的复合物的CTL。11.如权利要求10的所述CTL，其识别由选自SEQIDNO:5的氨基酸序列构成的癌抗原肽和HLA—A24抗原之间形成的复合物。12.—种药物组合物，其包含如权利要求1或2所述的肽、如权利要求3所述的多核苷酸、如权利要求4所述的表达载体、如权利要求5所述的细胞、如权利要求8或9所述的抗原呈递细胞、或如权利要求10或11所述的CTL，连同药学上可接受的载体。13.—种癌症疫苗，其包括作为有效成分的如权利要求1或2所述的肽、如权利要求3所述的多核苷酸、如权利要求4所述的表达栽体、如权利要求5所述的细胞、如权利要求8或9所述的抗原呈递细胞、或如权利要求10或11所述的CTL。14.如权利要求1或2所述的肽、如权利要求3所述的多核苷酸、如权利要求4所述的表达栽体、如权利要求5所述的细胞、如权利要求8或9所述的抗原呈递细胞、或如权利要求10或11所述的CTL在制备癌症疫苗中的应用。全文摘要提供来源于WT1，具有体内诱导CTLs活性的HLA-A24限制性肽、编码所述肽的多核苷酸、在体内或体外使用这些肽或多核苷酸的癌症疫苗，等。可使用本发明的疫苗治疗许多癌症患者。文档编号C12N5/10GK101113163SQ20071010819公开日2008年1月30日申请日期2003年6月12日优先权日2002年6月12日发明者后藤正志,杉山治夫,高须秀夫申请人:株式会社国际癌症免疫研究所;中外制药株式会社;大日本住友制药株式会社