专利名称：耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具 体是一种耶尔森氏菌決速检测试剂盒的制备和j顿方法。 背景駄
耶尔森氏菌(Yereinia)又称巴斯德菌，系包括鼠疫菌的细菌的一属。可寄生于所有 恒温动物，弓胞出血性败血症。革兰氏她阴性，好氧性或兼厌氧性。X诉发水化合物的 发酵能力很弱，同时并不产生气体。耶尔森氏菌属包括ll个种，其中对人有致病性的有 三沐小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结 核菌已确定是貪源性病原体。该属细菌在病原寄主方面虽有明显特异性，但抗原的构成
上却极为相似。3a寸噬菌体有相当高的感受性而导致溶菌。
鲁克氏耶尔森菌是弓l起春季传染性暴发鱼病的主要病菌。传染性暴发鱼病又称出血 性败血症、溶血性腹水病、出血ttl复7jC病等，它是上世乡抹危害鱼类,重的疾病之一。 这种细菌对抗生素药物不敏感，防治较困难。其症状是病鱼的上下颌、口腔、鳃盖、 眼睛、鳍鱼体两侧被充血，此时肠内尚有少量食物;严重时鱼体表、目艮眶周围、目艮球充 血，甚至出血，目艮球突出、肛门红肿、腹部膨大、腹腔内积有淡黄透明月勤JC，鳃、肝、 肾颜色均较淡，有的肝呈花斑状，病鱼严重贫血，肝、胆、脾、肾肿大，肠壁充血，有 的病鱼鳞片竖起、肌肉充血、鳃丝末端腐烂。这类疾病对我国特别是北方的淡水鱼f^直 业带来了巨大危害和经济损失。以往检测耶尔森氏菌的主要方法有三沐1.生理生化鉴 定技术，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附试验，3. 聚合,连式反应法(PCR法)，该方法较前两种方法决速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。 目前尚未见用环介导諧显扩增方法检测耳你森氏菌的试剂叙方法。
发明内容
本发明的目的是掛共一种耶尔森氏菌決速检测试剂盒的制备和j顿方法，以克服现 有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全Jif共科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引 物(上游内引物和下游内弓嫩)和两个外弓嫩(上游夕卜引物和下游外弓胸)，内引物包含 靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内弓嫩首先和靶DNA杂交，随后的f體换DNA 合成在具有高度fiS换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外弓l物启动，释放出单链DNA， 并作为由杂交至鹏的另一端的一个内引物和一个外弓嫩启动的DNA合淑莫板，产生一个 原始的蓬环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动f连置换DNA的合成，产生一 个原始的蓬环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA; (4)在等温条件下，内引物以 茎环DNA为丰對反，舰链置换形成多^^有革巴DNA反鍾餅歹啲茎环DNA，在一小时 内该循环反应可使耙DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增增结果。
本发明涉及的耶尔森氏菌决速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1) - (4):
(1) 环介导等温扩增(LAMP)反应液A:
包括lOXThermopol反应缓冲液、300—500 u mol/L dNTP、 2—4mmol/L硫酸镁 (MgSQt)、 0.8—1.2,1/L卜.游引内物(F1P)、 . 8—1. 2timol/L下有内引物(BIP)、 0. 2—0. 3 u mol/L上游夕卜弓|物(F3)、 0. 2—0. 3 u mol/L下游内引物(B3)和l一l, 5mol/L 甜熟咸；
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
其中所述的上游内引物5- ACCTGTGTTCCATGCTGCTTCTATTCGCMCTGACATGTCGG-3;
下游内引物5- TMCAMGGTCACCGTCCAGGCCAGMCGCAGGTCTTGTGM-3;
卜游外弓l物5- CCAGAGCCAGAGTTCTTCCT-3;
下游外弓l物5- GGCCCATCTCTTCCATCAC-3。
其中所述的lOXTherraopol反应缓冲液中含有200腿ol/L PH8. 8的三羟基甲基MS 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol,/L氯化钾(KC1)、 100鹏ol/L硫^l安((NH4) 2S04)、 20咖o丄/L硫^f美(MgS04)禾口丄X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1U/uL;
(3) Bst DNA聚合酶B:浓度为8U / u L;
(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNA Green。
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23 uL的最佳组成为2. 5uL 10 XThermopol反应缓冲液、1.0mL 10mmo/L 1 dNTP 、 l.OwL 20umol,/L上游内引物 (FIP)、 1.0tiL20&fflol下游内弓i物(BIP)、 0. 25uL20"mol/L上游外引物(F3)、 0.25yL 20umol/L下游外引物(B3)、 0. 5uL 100mmol/L MgS04、 12.5pL 2mol/L甜 熟卿4nL ddH20 (灭菌双蒸水)。
使用上述试剂盒決速检须哪尔森氏菌的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):
(1) 样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取
A. 取200mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用 台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；
B. 加入1.0—1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5 —10min，弃上清液；
C. 加入100—150 nL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热10—15min;
D. 用台式离心机10000-12000转/分离心5—KMn，取上清至另夕卜一个1. 5mL离 心管中，即为待检模板DNA。
(2) 进行耶尔森氏菌的环介导等显扩增反应
A.在装有 23 u L LAMP反应液A的反应管屮加入1 u L待检模板DNA，禾口 0. 5 n L的 UNG酶，于恒温金属浴上50。C放置3min，再于恒⑩属浴上95。C放置3—5min，立即置
于冰上l一3min;
B. 在上述反应管中力口入1 u L Bst DNA聚合酶B;
C. 千恒淵余属浴上60—65℃放置45 —90min:
D. 将金属浴调到80—95℃中止反应，3—5min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入luL显色剂C，直接用肉,见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检细菌不是耶尔森氏菌，如果颜色变为纟絶，则说明样品为耶尔森氏菌。
本发明建立了耶尔森氏菌的环介导等温扩增检测试剂皿检测方法，本试剂盒根据 耶尔森氏菌的gyrB基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内弓i物和两个特异 性外引物，该保守基因序歹伪耶尔森氏菌各不同血清型和菌株型所棘，以保证从种的 水平上检测不同来源的耶尔森氏菌株的可靠性。本发明采用环介导等显扩增(LAMP)技 术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏变，但不需要昂贵的PCR仪，只 需普通的金属浴或7K浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方&^见察，使用荧光燃料来观察即可，简单而快速。可用于耶尔森氏菌的检测，特別适用于基层医疗机构以及养殖场 现场应用。
下列实例进一步说明本发明，但不应当作X寸本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作耶尔森氏菌的环介导等尉广增试剂盒
(1) LAMP反应液A:
含有2.5uL lO×Thermopol反应缓冲液、l.OuL 1O0mmol/L dNTP、 l.OuL 20u mol/L上游内引物(FIP)、 1.0uL 20umol/L下游内引物(F1P)、 0.25uL 20umol/L 上游外引物(F3)、 0.25uL20umol/L下游外引物(B3)、 0. 5 uL 100mmol/LMgS04、 12.5 PL 2mol/L甜菜碱(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物5- ACCTGTGTTCCATGCTGCTTCTATTCGCAACTGACATGTCGG-3;
下游内引物5— TMCMAGGTCACCGTCCAGGCCAGAACGCAGGTCTTGTGM-3;
上游外引物5- CCAGAGCCAGAGTTCTTCCT-3;
下游外引物5- GGCCCATCTCTTCCATCAC-3。
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为 dUTP:dATP:dGTP:dCTP:2:1:1:1。
其中所述的lOXThemopol反应缓冲液中含有200mol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲垸一盐酸(Tris—HCl)、 100mol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫酸铵((NH4) 2S04)、 200mmo/L硫酸镁(MgS04)和1％曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1U/uL;
(3) Bst DNA聚合酶B:浓度为8U /uL;
(4) 显色剂C:为10％的荧光染料SYBR GREEN I。按照以下程序进行检测
(1) 细菌DNA的提取
A. 取200呢待检样品或者1.0过夜i錄的菌液，置于1.5fflL离心管中，用台式离 心机10000转/分离心10min，弃上清液；
B. 加入1.0灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000转/分离心5min，弃上清液;
C. 加入100ixL灭菌双蒸水，混匀，IO(TC沸水浴中加热10min;
D. 用台式离心机10000转/分离心10min，取卜.清至一个新的1. 5mL离心管中，即 为待检模板DNA。
(2) 进行耶尔森氏菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有23卩L LAMP反应液A的反应管巾加入1 y L待检t對及DNA，禾口 0. 5 u L的 UNG酶，于恒温金属浴上95℃放置5min，立即置于冰上lmin;
B. 在反应管中加入1UL Bst DNA聚合酶B;
C. 于恒温金属浴上65℃放置1小时；
D. 将金属浴调到80
中止反应，3min后取出；
(3) 显色检测
在每+待检反应管中加入1 U L显色剂C，直接用卿^见察颜色变化，如果颜色为黄 色，说明待检细菌不是耶尔森氏菌，如果颜色变为绿色，贝i脱明样品为耶尔森氏菌。
实施例2
按下列配方制作耶尔森氏菌的环介导等显扩增试剂盒
(1) LAMP反应液A:
含有2. 5 P L 10 X Thermopol反应缓冲液、1. 0 u L 10咖ol/LdMP、 1. 0 u L 20 ti mol/L 上游内引物(FIP)、 l.OyL 20ymol/L下游内引物(BIP)、 0.25iiL 20ymol/L上游外引物(F3)、0. 25 u L 20y mol/L下游外引物(B3)、0. 5 u L 100mmol/L MgS04、 12. 5 " L 2mol/L 甜熟和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量dUTP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。 其中所述的上游内引物、下游内引物、上游夕卜弓嫩、下游外引物同上。 其中所述的lOXThermopol反应缓冲液中含有200imol/L pH8. 8的三羟基甲基tt 甲垸一盐酸(Tris—HCl)、 100mol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、 20mmol/L硫酸镁(MgS04)和1%曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1U/uL;
(3) Bst DNA聚合酶B:浓度为8U /uL;
(4) 显色剂C:为10W的荧光染料DNA Green。
按照以下辦进行检测
(1)细菌DNA的提取
A.取200 mg待检样品或者1.0mL过夜i咅养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式 离心机12000转/分离心5min，弃上清液；
B. 加入1. OmL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清
液；
C. 加入100nL灭菌双蒸水，混匀，l(XTC沸TK浴中加热10min;
1D. 用台式离心机12000转/分离心5min，取上清至另外一个1. 5mL离心管中，即
为待检樹反腿。
(2) 进行耶尔森氏菌的环介导等尉广增反应
A. 在装有23iiL LAMP反应液A的反应管中加入1 "L待检丰It及DNA，禾tl0. 5uL的 UNG酶，于恒驢属浴上95t:放置5min，立即置于冰上lmin;
B. 在上述反应管中加入:UL Bst DNA聚合酶B;
C. 于睦脸属浴上6(TC放置1小时；
D. 将金属浴调到90。C屮止反应，2min后取出；
(3) 显色检测
在待检的齡反应管中加入luL显色剂C，直接用肉,见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待総田菌不是耶尔森氏菌，如果颜色变为绿色，贝i脱明样品为耶尔森氏菌。
权利要求
1.一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其特征是其中的试剂包括(1)环介导等温扩增反应液A包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中所述的上游内引物5-CCGGTTTGATCGGTTTCGCCCACTTACAAGATGGGTGTGCC-3、下游内引物5-GTGCGTTTCTGGCCGAGCTTGCAGACGTTTTGCCAGGATT-3、上游外引物5-CGCCGTGAAGGTAAAGTTCA-3、下游外引物5-CAGAGTTCAGGAACGACAGC-3(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶B8U/μL；(4)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其特征是上 述的混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
3. 根据权利要求1中所述的耶尔森氏菌快速检测试剂盒，其特征是上 述的环介导等温扩增反应液A每管23 w L的组成为2. 5u L lOXThermopol 反应缓冲液、1. 0u L 10mmol/L dNTP、 1. 0 u L 20 ji mol/L上游内引物、1.0 uL 20umol/L下游内引物、0. 25ixL20umol/L上游外引物、0. 25 u L 20 umol/L下游外引物、0. 5uL 100画ol/L MgS04、 12.5uL 2mol/L甜菜碱 禾口 4u L ddH20。
4. 一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征是依次包括下 列步骤(1)待检样品DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL 离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；B. 加入1.0 — 1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000 转/分离心5 — 10min，弃上清液；C. 加入100 — 150 uL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热IO — 15min;D. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，取其上清 液至一个1.5mL离心管中，即为待检样品模板DNA;(2) 进行耶尔森氏菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入ltiL待检样品模板DNA， 和0.5uL的UNG酶，于恒温金属浴上5(TC放置3min，然后在95。C放置3 一5min，立即置于冰上1 一3min;B. 在上述反应管中加入luL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒温金属浴上60 — 65。C放置45 — 90min;D. 将金属浴调到80 — 95。C中止反应，3 — 5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入luL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化， 如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含有或者不是耶尔森氏菌，如 果颜色变为绿色，则说明样品为含有或者是耶尔森氏菌。
全文摘要
本发明涉及一种耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、BstDNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-CCGGTTTGATCGGTTTCGCCCACTTACAAGATGGGTGTGCC-3、下游内引物5-GTGCGTTTCTGGCCGAGCTTGCAGACGTTTTGCCAGGATT-3、上游外引物5-CGCCGTGAAGGTAAAGTTCA-3、下游外引物5-CAGAGTTCAGGAACGACAGC-3和甜菜碱；检测耶尔森氏菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、耶尔森氏菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101200760SQ20071011517
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者刘彩霞, 超 林, 颖 陈, 高宏伟 申请人:中国检验检疫科学研究院