chIFNGR1基因、其编码的蛋白质及应用的制作方法

专利名称：chIFNGR1基因、其编码的蛋白质及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及鸡干捷素-y受体《链 (chIFNGRl)基因及编码的氨基酸，还涉及其胞外域重组蛋白的抗 病毒活性。
背景技术：
干扰素-y (IFN-y)主要由活化的T细胞、NK细胞产生，是一 种具有抗病毒，调节免疫和促进细胞凋亡等多种生翁学活性的细胞 因子。其功能的多效性是邇过与几乎表达在所有细胞表面、高亲和 力的受体以严格的种属特异性方式结合，诱导细胞表达多种蛋白质 面实现的。
IFN-y相关的诸多生物学功能早已被人们所认识，但对于IFN-y 细胞表面受体的结抅与功能的认识，只是在近十来年才取得了有意 义的进展。IFN-y受体由配体结合链(IFN-y受体a链，,IFNGR1 ) 和信号转导链(IFN-了受体P链，即IFNGR2)缀成。IFNGR1蛋白 结抅域由胞外域(ECD)、跨膜区(TM)和胞内域(CYT)组成。 胞外域与配体结合， 一般由200个左右的氨基酸残基组成，包含2
个串连的纤连蛋白ni型区(FNin)。胞内域传递细胞内信号，含有
保守的LPKS和YDKPH序列，这两个序列分别是JAK1和STAT1 的结合位点。
1988年，Michel等人首先克隆了人n型干扰素受体lFNGRl的 基因。1994年，Soh等人首先克隆了 IFNGR2基因。目前已先后克 隆出人、小鼠、大鼠和牛的IFNGR1基因，以及人、大鼠、小鼠和 鸡的1FNGR2基因。其中，鸡的IFNGR2基因于2006年由本教研组 的韩春来博士采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术成功获得并 发表，该基因全长cDNA序列和其中编码区在GenBank上的序列号 分别为AY957508和AY820753。而鸡的IFNGR1基因在国内外未见 公开报道，仅可在GenBank上查到 一段计算机分析预测序列 XM_419722,该序列的正确性霱要进一步的实验证明。本发明填补 了鸡干扰素受体研究的空白，为开发应用奠定基础。

发明内容
本发明的目的在于提供鸡IFNGRl基因及其编码蛋白。
本发明首次获得了鸡IFNGRl的cDNA序列，其核普酸序列如 序列表SEQ ID No.l所示，该序列全长2123bp，编码442个氨基酸， 其序列如序列表SEQIDNo.2所示，是一种跨膜蛋白，信号肽、胞 外域、跨膜区和胞内域分别由20、 220、 23和179个氨基酸组成。
本发明无菌采集鸡抗凝血，分离淋巴细胞提取总RNA。并根据 GenBank上登录的鸡IFNGRl基因计算机预測序列及IFNGRl基因 的保守序列(IFNGRl蛋白胞内域的氨基酸序列LPKS和YDKPH序 列在人、牛、小鼠和大鼠都是保守的)设计引物，用RACE和PCR 方法获得了 chIFNGRlcDNA序列2123bp,序列包括该基因的部分 5，端非编码区、编码区和3'墙非编码区。该基因编码的蛋白为鸡 IFN-Y受体a链，具有结合配体，传递IFN-Y剌激信号的作用。
应当理解，考虑到密码子的简并性和将用于具体表达本发明鸡 IFNFR1基因的动物或徽生物的优选密码子，倒如可在其编码区，在 不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响鸡IFNFR1 表达的条件下，对SEQIDNo.l所示的序列进行修改。因此，本发 明的范围还包含对SEQIDNo.l所示序列进行的替换、添加和/或缺 失一个或多个核苷酸，具有与本发明基因具有相同功能的核苷酸序 列。
并且，本发明还包括对表达自本发明基因的蛋白质(SEQ ID No.2)进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。
此外，应当理解，本领域的技术人员还可以具体利用本发明基
因的某个片段，例如下面所要说的鸡IFNGR1基因的胞外域核苷酸 序列。本领域技术人员还可以利用本发明蛋白质的某个部分，如该 基因的胞外域蛋白。
本发明的基因或蛋白质可来自鸡的各种活组织或邇过DNA或 肽合成的方法来获得。
此外，可以将本发明的基因或其片段插入到克隆载体或表达载 体中，进而可以将表达载体引入适宜的宿主中表达，如大肠扦菌， 酵母和动物细胞等，从而可以进行大规模的生产本发明的DNA或蛋
白质。上述得到的克隆载体或表达载体，以及含有所述表达载体的 宿主，均属于本发明的范围。
本发明的另一个目的在于提供具有抗病毒活性的鸡IFNGR1胞 外域重组蛋白。
本发明应用PCR方法扩增ehIFNGRl基因的胞外域核苷酸序 列，并构建chIFNGRl胞外域的表达载体pMAL-p2x/IFNGRlEC。 将上述表达载体转化大肠杆菌TBI感受态细胞，诱导获得了 chIFNGRl胞外域蛋白rchIFNGRlEC。为了便于构建表达载体，该 重组蛋白缺失chlFNGRl胞外域N端的ASLQ四个氨基酸残基和C 端的WST三个氨基酸残基，但不会影响蛋白质的结抅和功能，其抗 病毒活性为4.58x103 U/mg。
本发明基因编码的蛋白为鸡IFN-Y受体a链，具有结合配体，传 递IFN-y刺激信号的作用。本发明体外获得的鸡IFNGR1胞外域融合 蛋白其具有抗病毒活性，是一种潜在的抗病毒生翁制剂。


图l. chIFNGRlEC重组蛋白的SDS-PAGE和Western biot分析.(A) 大肠扦菌表达的chIFNGRlEC的SDS-PAGE (12%)分析(B) Western blot分析M(左)，低分子量蛋白标准分子量分别为97kDa,66kDa, 43kDa，31kDa和20kDa。 M(右)，低分子量蛋白标准分子量分别
为97 kDa， 66 kDa, 43 kDa和31 kDa;
图2.鸡IFNGR1胞外域(EC)重组蛋白与鸡IFN-y的相互作用. 1, SDS-PAGE( 15% )分析rchlFNGRlEC(66kDa)+rchlFN-y( 43kDa );
M,低分子量蛋白标准。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的 范围。
实施铜l、鸡IFNy受体a链(ehIFNGRl)的获得
一、采用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得鸡chIFNGRl 的cDNA序列
提取鸡外周血淋巴细胞总RNA,将总RNA用IOO U MMLV-RT (Promega公司产品)，lOOng的上下游引物 5，-AACATATGCGGCCGCATTATGGCCGGG-3，和5，-GATCTTCCAC GCGTCGAC(T)30MN-3， (M=A, Q C; N =A, Q C, T)在42。C条件下 进行反转录。获得的cDNA进行3，RACE,根据GenBank上登录的红 色原鸡IFNGR1计算机预测序列XM—419722的保守区设计RACE引 物，第一轮PCR的引物为特异的上游引物GSP1 (5，- CAGAAGCAA AAGGCATTTGTGCCGTC-3') 和通用的下游引犊UP (5'-GATCTTCCACGCGTCGACr-3，)，第二轮PCR的引物为巢式上 游引物GSP2(5，- TGTGAGTGTCCCATTGACAGTGAAT-3，)和UP， 第三轮PCR的引物为巢式上游引物GSP3(5，-TAT GACAAGCCTCATGTGCCACTA-3，)和UP。采用Touch-Down PCR程 序进行第一轮PCR: 92°C, 30s, 68°C, 3min， 5个循环;94°C, lmin， 60。C， lmin, 72。C, lmin, 6个循环；94。C， lmin, 58。C, lmin， 72。C， lmin， IO个循环；94。C, lmin, 56。C, lmin, 72°C, lmin, 7个循环；72°C， 10min。第二轮PCR: 92。C, 30s， 68。C， 3min， 5个循环；94。C, lmin, 64°C, lmin, 72°C, lmin, 6个循环；94。C，
lmin, 62。C, lmin, 72。C, lmin, IO个循环；94。C, lmin, 60。C, lmin， 72。C, lmin, 7个循环；72°C, lOmin。第三轮PCR反应程序
与第二轮相同。
另外，根据XM—419722,设计引物扩增IFNGR1基因。引物序 列分另!』为 ehIFNGRl-F (5'-CTCGGCTCGCTGTGGTCTT-3)和 chlFNGRl-R (5'-TGTATGCAATCACAGGCTGTT CTTC-3〕扩出约 1400bp的产德。PCR反应程序为95°C, 5min; 95°C, lmin， 58°C， lmin, 72°C, 1.5min， 30个循环；72°C， 10min。纯化获得的PCR 产物，并连接到pGEM-T-easy载体(Promega公司产品)上，将连接 产翁转化大肠杆菌感受态细胞DH5ot并测序。
将3'RACE获得的825bp序列和PCR扩增得到的1368 bp序列 拚接。分别进行BLASTN和BLASTX的分析，获得鸡IFNGR1基 因。该基因编码的蛋白为鸡IFN-Y受体a链，具有结合配体，传递IFN-y 剌激信号的作用。
二、鸡IFNGRl核苷酸序列和氨基黢序列特征分析
通过SignalP3.0、TMpred、 Motif scan和Domain Linker Prediction (http:〃www.expasy.org)分析鸡IFNGR1的信号肽、跨膜区和保守 性motif,通过基因组BLAST,确定该基因在鸡基因组中的定位， 通过与其他物种该基因的比对，确定它们之间的同源性，分析遗传 进化的规律。最后我们获得了如下信息克隆得到的序列包括部分5' 端非编码区、编码区和3，端含Poly (A)尾巴的cDNA序列，全长 2123bp。 diIFNGRl编码442个氨基酸(SEQ ID No.2 )，是 一种跨膜 蛋白，信号肽、胞外域、跨膜区和胞内域分别由20、 220、 23和179 个氨基酸组成(自氨基端第1-20位(Metl-Ala20)为鸡IFNGR1蛋白 的信号肽序列，自氨基端第21-240位(Ala21-Gln 240)为鸡IFNGR1 蛋白的胞外域序列，自氨基端第241-263位为鸡IFNGR1蛋白的跨 膜区序列，自氨基端第264-442位为鸡IFNGR1蛋白的胞内域序列)。
基因组BLAST表明该基因位于鸡的第3号染色体上，由7个外显子 编码，基因大小约18.4kb。第1个外显子编码5'非编码区和信号肷; 第2， 3, 4, 5和外显子编码胞外域，第6个外显子编码跨膜区和一 部分胞内域，第7个外显子编码剩余的胞内域和3'非编码区。
与人、小鼠、大鼠和牛的IFNGR1相比，鸡IFNGR1胞外域也 由两个纤连蛋白m结抅域组成，分别命名为Dl区和D2区，两个 结抅域之间也存在一对高度保守的鱸氨酸残基PP。在鸡IFNGR1的 胞内域含有LPKS和YDKPH序列，这两个序列分别是JAK1和 STAT1的结合位点，这在各物种中是保守的。鸡IFNGR1与人和其 它哺乳动物IFNGR1之间的同源性为25-29%,序列相似性为 53~55%,其中，Dl区的相似性最高，可达到62-65%。因此将获得 的序列命名为鸡IFNGR1基因。
实饞俩2、鸡IFNGR1胞外域(EC)重组蛋白的表达
一、 鸡IFNGR1EC重组表达载体的构建
用常规PCR方法扩增鸡IFNGR1胞外域，所用的引物为 ch丽GRlEC-F (5,-TAGGATCCGAGCGTCTTCCCGCAGT-3)和 ch丽GRlEC-R(5，"GCrCTAGArCAAGCCTGCGTGATAGGAACC-3)， PCR反应条件为94。C5分钟，94。C 1分钟，60。C l分钟，72°C 1 分钟，30个循环；72°C IO分钟。反应结束后，将扩增获得的PCR 产物用Ba/w//1和Z&fl I双酶切，并插入到pMAL-p2x (New England Biolabs公司产品)载体中，将连接产物转化大藤杆菌感受态细胞 DH5a并测序。得到含有IFNGR1EC的重组质粒，命名为 pMAL-p2x/lFNGRlEC。
二、 将步骤一的重组质粒转化大肠杆菌TB1感受态细胞，37°C 摇菌培养至ODfioo = 0.5-0.8后用0.4mM IPTG在30°C诱导3h, SDS-PAGE裣测目的蛋白的表达。融合蛋白用Amylose亲和层析柱
(New England Biolabs公司产品)纯化，具体方法为离心收集
rIFNGRlEC表达菌，将细菌重悬于上柱缓冲液中(20mM Tris-HCl (pH7.4)， 200mMNaCl， lmMEDTA， 1mMDTT),超声破碎细胞 后离心，保存上清(粗提物)。将Amylose介质填充于柱子中，用上 柱缓冲液洗柱。将粗提物上样，之后用上柱缓冲液洗柱。最后用上 柱缓冲液+10 mM麦芽糖洗脱融合蛋白质。将获得的纯化蛋白进行 SDS-PAGE,并用兔抗MBP血清为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG 为二抗进行Western blot分析。SDS-PAGE和Western blot分析显示 在66-kDa处出现带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的目的蛋白 rchIFNGRlEC。见图1。
实施例3、鸡IFNGRl胞外域(EC)重组蛋白抗病毒活性的测定
纯化的rIFNGRlEC蛋白测定浓度后进行病变抑制效应试验。将 带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的rIFNGRlEC进行系列稀释(1: 4),接种到鸡CEF细胞单层上，培养24h后，每孔如入1(X)TC1D50
马水疱状口炎病毒)(vsv),当病毒对照孔完全病变时，釆用干扰
素效价的计算方法，计算rIFNGRlEC的抗病毒活性。rIFNGRlEC 具有较高的抗病毒活性，能有效捭制VSV对成纤维细胞的破坏作用。 rIFNGRlEC的抗病毒活性为4.58xl03 U/mg。
实施例4、鸡IFNGRl胞外域与鸡IFN-y的相互作用
将纯化的鸡IFN-y融合蛋白(带有GST标签)与rIFNGRlEC(不 带GST标签)等摩尔混合，室温作用l小时，而后加入适量经PBS 平衡的Sepharose 4B亲和填料，轻轻振荡混勾，室温作用半小时， 其间不断振荡以防止填料沉淀；300g离心15min，弃上清，填料用 适量PBS至少洗涤三次，最后用二倍填料体积的还原型谷統甘肽溶 液洗涤填料，500g离心15min,上清用3K超滤管浓縮后进行15% SDS-PAGE分柝。如图2所示，rcMFNGRlEC可以与rchIFN-Y结合， 说明鸡IFNGR1廳外域具有结合配体的作用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120〉 chlFNGRl基因、其编码的蛋白及应用
<雄> <湖> 4
<170〉 Patentlii version 3. 3
<210> 1 <211> 2123 <212> 腦 <213> 鸡 <220>
<221> 5，觀 <222> (l)..微 <220>
<221> CDS
<222> (54).. (1382)
<220>
<221> 3'羅
<222> (1383)..《2123)
<400〉 1
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325 330 335
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340 345 350
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2123
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50 55 60
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鄉 410 415
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<2!0> 3 <211> 642 <212> 腿 <213> 鸡 <400> 3
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Glu lie Phe His Ser 70
Gin Gin
Ser Gin Gin Ser Gin Tyr 85 90 ￥a.l Leu Gin L.ys His Gly Lys lie Gly Pro
100 105 Arg His Gly Ma Glu lie lie Val Asp V'al 115 120 Glu ￥al Arg Pro Trp Met Arg Glu
Ser Val 130
Tyr Ser Val lie Phe 145
Thr Val Ala Asp
Pro Trp 135
Arg Asn Ser Glu Asn 150
Glu Met
Pro Ser Glu Gly 180 lie
Asp Asp L.eu 195
Pro lie Thr Gin Ala 210
Cys Glu Met Asn Glu Cys 165 170 Ser Thr Tyr Cys Val Ser 185
Val Gly Ala Ser Ser Glu 200
Tyr Trp Phe Arg lie L.ys 75 80 Val Glu Thr A印Glu Phe 95
Pro Lys Leu Asn Leu Ser 110
Tyr His Pro Glu Phe Pro 125
lie Tyr Ser Glu L.eu Ser 140
Glu Ser Arg Lys Asn Phe 155 160 Asn Leu Ser lie Pro Val 175
Ala Lys Gly His Phe Phe 190
Glu Ser Cys lie Trp Val 20权利要求
1、鸡IFNGR1基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列。
2、 鸡IFNGR1蛋白质，其具有5￡0101^0.2所示的氨基酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能 的氨基酸序列。
3、 含有权利要求l所述基因的克隆载体或表达载体。
4、 含有权利要求3所述表达载体的宿主。
5、 一种蛋白质，其具有SEQIDNo.4所示的氨基酸序列，或该 序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的氨 基酸序列。
6、 如权利要求5所述的蛋白质，其为权利要求2所述蛋白质胞 外域区段的重组蛋白。
7、 编码权利要求5或6所述蛋白质的基因。
8、 含有权利要求7所述基因的表达载体。
9、 含有权利要求8所述表达载体的宿主。
10、 权利要求5或6所述的蛋白质在制备抗病毒制剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了鸡IFN-γ受体α链(IFNGR1)基因，其具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列。本发明还提供了该基因编码的蛋白质鸡IFNGR1，该蛋白具有结合配体，传递IFN-γ刺激信号的作用。鸡IFNGR1胞外域融合蛋白其具有抗病毒活性，是一种潜在的抗病毒生物制剂。
文档编号C12N15/12GK101191130SQ20071011872
公开日2008年6月4日 申请日期2007年7月12日 优先权日2007年7月12日
发明者明 汪, 雪 韩 申请人:中国农业大学