专利名称：：一株短小芽孢杆菌突变株及其发酵生产碱性蛋白酶的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
。技术背景蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。目前，碱性蛋白酶的主要产生菌种有芽孢杆菌属细菌、链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)以及酵母等。中国专利(申请号03144206.4)中公开了一种发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，采用的菌种是一株嗜碱性枯草芽孢杆菌。中国专利(申请号02825897.5)中公开了一种来自芽孢杆菌种(DSM14392)的芽孢杆菌属型碱性蛋白酶，及其在洗涤剂和清洗剂中的应用。中国专利(申请号00123404.8)中公开了一株黄杆菌属末知种菌株YS9412-130可以产生的低温碱性蛋白酶。我们从中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心短小芽孢杆菌1.894菌株(Sa"7/船pwm7w1.894)，该菌株具有一定的产碱性蛋白酶能力。本发明将该原始菌株进行紫外诱变，得到高产碱性蛋白酶的突变株，目前还没有用该突变株进行发酵生产碱性蛋白酶的报道。
发明内容本发明的目的是提供一株具有高产碱性蛋白酶能力的耐碱细菌——短小芽孢杆菌的突变株，并提供一种利用该菌株发酵生产碱性蛋白酶的方法。该菌株是将短小芽孢杆菌1.894菌株，经紫外诱变，通过稀释涂平板培养和透明圈筛选方法，筛选到碱性蛋白酶高产突变株，其产碱性蛋白酶的能力比原始菌株提高90%，经连续培养性能稳定。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.2080。采用该菌株进行固态发酵生产碱性蛋白酶的步骤如下1、菌种保藏。短小芽孢杆菌突变株2080保藏于4'C冰箱内碱性琼脂培养基斜面，半年转接一次。培养基组成(g/L):胰蛋白胨IO，牛肉膏3，NaC15,琼脂15，用20%碳酸钠调节pH二8.5。于115。C灭菌20分钟。2、种子培养。培养基组成(g/L):胰蛋白胨IO，牛肉膏3，NaC15，用20%碳酸钠调节PH=8.5。于115。C灭菌20分钟。接种，30'C摇瓶培养24小时，既得液体种子。3、固态发酵。产碱性蛋白酶固态培养基麸皮50g，酵母膏1.5g，D-果糖1.25g，磷酸二氢钾20mg，水125mL，用20%的Na2C03调节pH=8.5，搅拌均匀，于115'C灭菌20分钟。接种液体种子，混合均匀，于35'C静态培养48小时。4、酶的提取和净化。固态发酵后的物料，加入10倍重量的pH为10的0.05mol/L的Na2C03/NaHC03缓冲溶液，浸泡30分钟，在高速离心机中进行固液分离，提取液用孔径0.1pm的微滤膜过滤除去菌体，滤液用截留分子量为10000的超滤膜浓縮，收集浓縮液，即碱性蛋白酶溶液，贮藏。5、蛋白酶活力定义在5(TC、pH10的反应体系中，每分钟降解酪蛋白释放出的三氯醋酸可溶物在280nm的光密度与1微克酪氨酸相当时，其所需酶的量为一个单位。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。实施例l:不同氮源对产酶的影响向固体培养基中添加不同氮源，替代酵母膏。用20M的Na2CO3调节pH=8.5，搅拌均匀，于115'C灭菌20分钟。接种液体种子，混合均匀，于35'C静态培养48小时。结果见表1。结果表明，酵母膏比较适合碱性蛋白酶的发酵生产。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>实施例2:不同碳源添加对产酶的影响向固体培养基中添加2.5%重量比的各种碳源。用20X的Na2CO3调节pH:8.5，搅拌均匀，于115"C灭菌20分钟。接种液体种子，混合均匀，于35'C静态培养48小时。结果见表1。当添加D-果糖时产酶率最高，达到1.53万U/g干底物。表2:各种含果胶生物质及培养基不同湿度对产酶影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1.一株产碱性蛋白酶的耐碱细菌，其特征在于，该细菌是一株短小芽孢杆菌的突变株，能够利用麸皮发酵生产碱性蛋白酶，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.2080。2.—种利用权利要求l所述细菌生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于，以麸皮为主要底物，添加酵母膏、D-果糖、磷酸二氢钾和水，接种权利要求1所述耐碱细菌，采用固态发酵方法生产碱性蛋白酶。3.权利要求2所述的方法，其特征在于，固态发酵后的物料加入pH为10的Na2C03/NaHC03缓冲溶液，浸泡30分钟，在高速离心机中进行固液分离，提取液用孔径0.1pm的微滤膜过滤除去菌体，滤液用截留分子量为10000的超滤膜浓縮，收集浓縮液,'即得碱性蛋白酶溶液，贮藏。全文摘要本发明提供了一株高产碱性蛋白酶的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)突变株，并提供了一种利用该菌株发酵制备碱性蛋白酶的方法。属于生物工程
技术领域：
。发明所用菌株是将短小芽孢杆菌1.894菌株，经紫外诱变，筛选得到。以麸皮为主要底物，添加酵母膏、D-果糖、磷酸二氢钾和水分，接种短小芽孢杆菌2080菌株，在接触空气条件下，于温度35℃左右，静态培养48小时左右达到产酶高峰。用Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>/NaHCO<sub>3</sub>缓冲溶液浸提培养物，过滤，滤液即碱性蛋白酶液，再经超滤浓缩得到浓缩酶液或喷雾干燥得到碱性蛋白酶干粉。碱性蛋白酶产率达到1.53万单位/克干底物。(酶活力单位定义为在50℃、pH10的反应体系中，每分钟降解酪蛋白释放出的三氯醋酸可溶物在280nm的光密度与1微克酪氨酸相当时，其所需酶的量为一个单位)。文档编号C12N1/21GK101148652SQ20071012166公开日2008年3月26日申请日期2007年9月12日优先权日2007年9月12日发明者朱秋莉,李祖明,李鸿玉,白志辉,翟春风申请人:北京联合大学