一种利用生物法合成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖、制备方法及其用途的制作方法

专利名称：：一种利用生物法合成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及革兰氏阴性菌的细菌表面单糖的合成，尤其涉及大肠杆菌07和痢疾志贺菌7型中单糖的合成。
背景技术：
：革兰氏阴性菌(G—)的细胞壁分三层，由内至外分别为脂蛋白、外膜和脂多糖(LPS)。脂多糖是由类脂A、核心多糖和O-特异性多糖链(0-抗原)组成。O-抗原结合在核心多糖上，位于脂多糖分子的最外层，是细菌细胞主要的表面抗原。细菌O-抗原重复单位一般含有三到八个单糖，所有的单糖均需以核苷二磷酸(NDP)—单糖前体的形式参与合成O-抗原。这些单糖通常分为两类一类是细菌细胞在代谢过程中出现的常见的单糖及其衍生物；第二类单糖为细菌中O抗原中特有的罕见单糖，包括多种单糖，糖衍生物，糖类似物等，一般是由第一类单糖经过多酶反应后产生。由于人与动物体内没有这些糖，它们能在人与动物体内产生强烈的免疫反应，而这些单糖存在于细菌表面也是为了产生新的抗原从而逃避宿主免疫系统的识别和攻击，因此对这些糖的研究有助于我们了解细菌表面O-抗原与人体免疫系统之间的关系。脂多糖在细菌感染的初始阶段和逃避宿主的免疫反应方面有显著的作用。缺失LPS的菌株与野生菌株相比对血清和宿主细胞的吞噬作用更加敏感。由于LPS中的O抗原含有一些罕见单糖，所以一旦我们阻止这些罕见单糖的合成就有可能使LPS无法合成，使细菌更易被杀死。目前国外一些实验室正在开展这方面的研究,一些菌种中的罕见单糖合成途径中的酶的功能被确认。比如Gudph大学的JosephS丄am等人对铜绿假单胞菌Ol1血清型(尸化Mfifomomwaen^"a^Ol1)的UDP-N-乙酰-D-海藻糖胺合成过程中的酶——WbjB、WbjC、WbjD进行了研究。他们还证明了铜绿假单胞菌06血清型中的WbpO酶的作用是催化UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺为UDP-N-乙酰-D-半乳糖醛酸。另外，他们还通过计算机模拟和结构比较证明了WbpD是铜绿假单孢菌05血清型中的UDP-2，3-二乙酰氨基-2,3-双脱氧-D-甘露糖醛酸合成中的一个3-N-乙酰转移酶。但是，有关在大肠杆菌07中合成dTDP-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)和痢疾志贺菌7型中dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)的酶学和分子生物学特性还未见报道。
发明内容本发明的一个目的是提供一种在革兰氏阴性菌细菌表面中利用转氨酶合成的具有式(I)的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)，进而合成dTDP-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)。本发明的另一目的是提供上述两种单糖的制备方法。本发明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动研究出了在大肠杆菌07中合成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)，进而合成dTDP-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)的合成途径RmlARmlBVioAVioBGlc-1國p——>dTDP-Glc——>dTDP-GlcO——>dTDP隱Qui4N——>dTDP-Qui4NAc并研究出了在痢疾志贺菌7型中dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖dTDP-Qui4N的合成途径RmlARmlBVioAGlc-1-p——>dTDP-Glc——>dTDP-GlcO——>dTDP-Qui4NRmlARmlB上述2条途径中的Glc-l-p——>dTDP-Glc——>dTDP-GlcO为现有技术，由dTDP-GlcO合成dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)，进而合成dTDP-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)这两种新的单糖及其所需要的转氨酶是本发明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动研究出来的。一种在革兰氏阴性菌细菌表面中利用转氨酶合成的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)，具有下述式(I)结构CI)c所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌07，所述的转氨酶为转氨酶IVioAI;所述的转氨酶IVioAI基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列a)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:l但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:l所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的转氨酶I的核苷酸序列。所述的转氨酶IVioAI具有选自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；k)SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；1)上述k)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有转氨酶I的活性。一种表达所述的转氨酶IVioAI的重组质粒，所述的质粒的载体为pET画28a(+)。一种产生所述的转氨酶IVioAI的重组菌，所述的重组菌导入了转氨酶I。所述的式(I)的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)经乙酰转移酶VioB转化为具有式(II)的(《1^-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-0-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)，所述的乙酰转移酶VioB基因具有选自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；e)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:2但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)在严格杂交条件下与上述d)或e)中的序列杂交，并且编码具有活性的乙酰转移酶的核苷酸序列。所述的乙酰转移酶具有选自于下列p)、q)或r)的氨基酸序列p)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；q)SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；r)上述q)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有乙酰转移酶的活性。一种表达所述的乙酰转移酶VioB的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。一种产生所述的乙酰转移酶VioB的重组菌，所述的重组菌导入了乙酰转移酶VioB。所述的革兰氏阴性菌为痢疾志贺菌7型，所述的转氨酶为转氨酶IlVioAlI;所述的转氨酶IIVioAlI基因具有选自下列g)、h)、i)的核苷酸序列g)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；h)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:3但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:3所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；i)在严格杂交条件下与上述g)或h)中的序列杂交，并且编码具有活性的转氨酶II的核苷酸序列。所述的转氨酶IlVioAII具有选自于下列m)、n)或o)的氨基酸序列m)上述d)、e)或f)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；n)SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；o)上述n)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有转氨酶II的活性。一种表达所述的转氨酶IlVioAlI的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。一种产生所述的转氨酶nvioAn的重组菌，所述的重组菌导入了转氨酶IlVioAlI。应当指出的是，上述提到的术语"严格杂交条件"在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格杂交条件可以是，相互之间的同源性不小于70%的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90%的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7XSDS)中，50'C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50。C杂交12hr;弃杂交液，加入洗膜液I(2xSSC和0.1XSDS)，50'C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5xSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜30min。所属
技术领域：
的技术人员应该知道，本发明的编码罕见单糖合成的转氨酶I、转氨酶n和乙酰转移酶的DNA序列，还包括编码对SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。另外，对本发明的罕见单糖合成的转氨酶I、转氨酶II和乙酰转移酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、和SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有转氨酶I、转氨酶II和乙酰转移酶活性的蛋白质。上面使用的术语"多个"可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。此外，本发明的发明人对合成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)和dTDP-4-乙酰氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)这两种新的单糖的酶进行了研究，以抑制上述两种单糖的合成或生产上述两种单糖，详述如下(l)调节转氨酶I和转氨酶II的方法
技术领域：
：本发明涉及到调节转氨酶IVioAI和转氨酶IlVioAlI功能的方法。在大肠杆菌07和痢疾志贺菌7型中这2个转氨酶都将dTDP-GlcO转化为dTDP-Qui4N。因为它们拥有这个功能，所以它们可以在商业上用来将dTDP-GlcO转化为dTDP-Qui4N。另一方面，本发明提供一种检验转氨酶IVioAI和转氨酶IlVioAII活性的方法。向待测样品中加入足量的dTDP-GlcO，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测dTDP-GlcO的减少。另一方面，本发明提供另一种检验转氨酶IVioAI和转氨酶IlVioAII活性的方法。向待测样品中加入足量的dTDP-GlcO，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测dTDP-GlcO的减少和对应的dTDP-Qui4N的生成。本发明还提供一种检测有转氨酶IVioAI和转氨酶nvioAii活性的物质的抑制因子的方法。这种筛选转氨酶IVioAI和转氨酶IlVioAlI活性抑制因子的方法包括①将包含以下物质的待测样品在一定条件下培养(a)有转氨酶IVioAI和转氨酶IlVioAlI活性的物质(b)—个可能的抑制因子(c)dTDP-GlcO或dTDP-Qui4N;②终止反应；③比较样品与对照(不含可能的抑制因子)中dTDP-GlcO或dTDP-Qui4N的浓度，如果与样品比较，对照中的dTDP-GlcO或dTDP-Qui4N的浓度降低就说明找到了转氨酶IVioAI和转氨酶IlVioAlI活性抑制因子。(2)调节乙酰转移酶的方法
技术领域：
：本发明涉及到调节乙酰转移酶VioB功能的方法。在大肠杆菌07中这个乙酰转移酶将dTDP-Qui4N转化为dTDP-Qui4NAc。因为乙酰转移酶VioB拥有这个功能，所以它可以在商业上用来将dTDP-Qui4N转化为dTDP-Qui4NAc。另一方面，本发明提供一种检验乙酰转移酶VioB活性的方法。向待测样品中加入足量的dTDP-Qui4N，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测dTDP-Qui4N的减少。另一方面，本发明提供另一种检验乙酰转移酶VioB活性的方法。向待测样品中加入足量的dTDP-Qui4N，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测dTDP-Qui4N的减少和对应的dTDP-Qui4NAc的生成。本发明还提供一种检测有乙酰转移酶VioB活性的物质的抑制因子的方法。这种筛选乙酰转移酶VioB活性抑制因子的方法包括①将包含以下物质的待测样品在一定条件下培养(a)有乙酰转移酶VioB活性的物质(b)一个可能的抑制因子(c)dTDP-Qui4NAc或dTDP-Qui4N;②终止反应；③比较样品与对照(不含可能的抑制因子)中dTDP-Qui4N或dTDP-Qui4NAc的浓度，如果与样品比较，对照中的dTDP-Qui4N或dTDP-Qui4NAc的浓度降低就说明找到了乙酰转移酶VioB活性抑制因子。本发明中编码转氨酶VioA和乙酰转移酶VioB的核酸与脂多糖(LPS)的合成有关，因此，本发明可用于研究抑制大肠杆菌07和痢疾志贺菌7型感染的方法或途径例如，该方法或途径可以是，(1)利用本发明所提供的缺失转氨酶IlVioA编码基因的方法，阻断罕见单糖合成途径，进而阻断细菌O抗原合成，最终阻止细菌的繁殖。(2)核酸序列相对于其正常转录状态可以转化为反义的核酸分子。更合适的情况是，转化起始密码子之前的区域或未被观察的区域，以得到反义序列。因此，本发明中的核酸分子包含的核酸序列或其中的片段，特别是SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的核酸序列相对于其正常转录状态可以转录为反义的核酸分子，然后利用该反义核酸分子抑制对应基因的表达。具体来说本发明的反义核酸分子或其中一个片段可以通过使用天然存在的核苷酸或者各种用来增加分子的生物稳定性或增加与mRNA或天然的基因结合的物理稳定性的修饰的核苷酸(比如硫代磷酸化衍生物和吖啶替代核苷酸)进行化学合成；还可以用生物方法合成，将表达载体以重组质粒、噬菌体质粒或减活病毒的形式转入高拷贝的宿主细胞中，反义核酸分子可以在高效调节区的调控下合成。本发明的DNA核酸分子也可以以反义方向转入表达载体。也就是说，将DNA分子与一个调控序列连接，这个调控序列在某种意义上通过DNA分子的转录产生SEQIDNO:l或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所示序列的反义RNA分子，可以选择要表达反义RNA分子的与反义核酸连接的调控序列。含有本发明中某个反义序列或寡核苷酸的重组分子还可以通过类似反转录病毒载体、腺病毒载体和DNA病毒载体等运输媒介直接注入体内的细胞或组织中。也可通过显微注射和电穿孔等物理技术或将DNA共沉淀入脂质体的方法导入体内细胞。重组分子还可以通过气溶胶或洗胃方法进入体内。(3)利用本发明中的转氨酶i、转氨酶n和乙酰转移酶可通过制备单克隆抗体、多克隆抗血清或嵌和抗体衍生物等来抑制对应酶的活性，使对应罕见单糖的合成受阻，从而阻断细菌o抗原合成，进而控制细菌繁殖。具体来说因本发明中蛋白的活性可以被针对本发明中蛋白的抗体抑制，所以，可以用传统方法制备抗体。比如，利用本发明中的蛋白或多肽，使用标准方法来制备多克隆抗血清或单克隆抗体。用具有免疫原性形式的多肽来免疫哺乳动物(比如小鼠、大鼠或兔子)使之产生抗体反应。使多肽具有免疫原性的技术包括将其连接到载体上或其它本领域公知的方法，比如加入佐剂。免疫过程可以通过检测抗体在血浆或血清中的滴度方法控制。利用抗原这样的免疫原和标准的ELISA实验或其它免疫检测方法来评估抗体的水平。免疫过程之后可以获得抗血清，如果需要可以血清中分离多克隆抗体。为生产单克隆抗体，可以从被免疫的动物中涉及抗体产生细胞(淋巴细胞)。这些细胞可以通过标准的体细胞融合方法和骨髓瘤细胞融合，使之稳定并产生杂交瘤细胞。这些技术在本领域是公知的，比如杂交瘤技术是由Kohler和Milstein(Nature256,495-497(1975))发明的，人体B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today4,72(1983))，通过EBV-杂交瘤技术产生人体单克隆抗体(Cole等，《肿瘤治疗中的单克隆抗体》(1985))AllenR.Bliss,Inc，77-96页)，和组合抗体库的筛选(Huse等，Science246，1275(1989))。利用免疫化学方法筛选杂交瘤细胞，然后产生与多肽特异反应的抗体，并且可分离出单克隆抗体。本发明所说的"抗体"可以包括与本发明中的蛋白特异反应的片段或多肽。可以用传统方法将抗体打断，并且可以用上述方法筛选这些片段。比如，用谓蛋白酶处理抗体来产生F(ab')2片段。F(ab')2片段结果打断二硫桥生产Fab'片段。嵌合抗体衍生物，比如由非人类动物的可变区合人类的恒定区组成的抗体也在本发明的范围之内。例如嵌合抗体分子由来自鼠、小鼠或其它物种抗体的抗原结合位点和人类的恒定区组成。可以用传统方法制备含有识别本发明中某一蛋白的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体(比如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851(1985);Takeda等，Nature314，452(1985);Cabilly等，U.S.PatNo.4,816，567;Boss等，U.S.Pat.No.4,816,397;Tanaguchi等，EuropeanPatentPublicationEP171496;EuropeanPatentPublication0173494，UnitedKingdompatentGB2177096B)。与本发明中某个蛋白特异反应的单克隆或嵌合抗体可以通过产生人类恒定区嵌合体来进一步类人化。人类恒定区嵌合体中的可变区，特别是抗原结合位点的保守骨架区是人源的，只有高变区是非人源的。这种免疫球蛋白分子可以通过本领域公知的技术制备(比如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80,7308-7312(1983);Kozbor等，ImmunologyToday,4，7279(1983);Olsson等，Meth.Enzymol"92，3-16(1982)禾口PCTPublicationWO92/06193或EP0239400)。类人化的抗体也可进行商业生产(ScotgenLimited,2HollyRoad,Twickenham,Middlesex,GreatBritain)。也可通过从编码与本发明中的核酸分子产生的多肽一起在细菌中表达的免疫球蛋白基因(或其部分)表达文库中筛选。比如，用噬菌体表达文库在细菌中表达完整的Fab片段、VH区、FV区(例如Ward等,Nature341，544-546(1989);Huse等，Science246,1275-1281(湧9)禾口McCafferty等，Nature348,552-554(1990))。还可以用DNA免疫来制备抗体。例如将含有本发明的某个核酸分子的表达载体注射进合适的动物体内(比如小鼠)。然后本发明的蛋白会在体内表达，同时也会产生抗体。然后用上述方法分离抗体用来蛋白免疫。可以用各种酶、荧光物质、发光物质和放射性物质等标记物标记抗体。合适的酶包括辣根过氧化酶、生物素、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酶；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物质包括鲁米诺；合适的放射性物质有S-35,Cu-64,Ga-67,Zr-89,Ru-97,Tc-99m,Rh-105,Pd-109，In画lll，1-123，1-125,1131，Re-186,Au-198,Au-199，Pb-203,At-211,Pb-212和Bi-212。也可以用配体粘合物将一个配体连接或标记抗体。代表性例子有亲和素-生物素和核黄素-核黄素系统。以上标记或连接抗体的方法均用传统方法完成。(4)利用上述获得的反义寡核苷酸或抗体可以用来设计药物，这些药物应适宜在体内形成生物相容形式。"体内的生物相容形式"是指在通过治疗使任何毒性作用都降低的过程中的物质形式。包括人和动物在内的活的有机体都可服用这些物质。本发明的药物成分的有效剂量的给药指在一定剂量、足够时间的情况下能产生所需结果。比如，一个药物的有效剂量会受诸如病情、患者年龄、性别、体重和注入患者体内的抗体的效果等许多因素影响。比如将每天的剂量分开服用或者根据治疗中的紧急情况减少剂量。可以通过适宜的方式服用这些药物。比如注射(皮下注射、静脉注射等)、口服、吸入、或者直肠吸收。根据给药方法的不同，可以将有效物质包裹起来，与酶、酸和其它可使它失活的物质隔离开。这里所说的药物可以用己知的治疗药物制备方法制备，也就是将有效剂量的活性物质与治疗媒介混合一起。适宜的媒介已有介绍，比如Remington'sPharmaceuticalSciences(Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,Pa"USA1985)。另外，这些药物包括可溶性的物质与一种或多种治疗媒介或稀释液在适宜pH值和离子渗透压的生理液体的缓冲液中混合。(5)还可利用本发明中的核酸分子或蛋白分子制成疫苗来抑制细菌感染。具体来说通过服用疫苗使机体对本发明中的蛋白产生免疫应答来抑制或处理由大肠杆菌07和痢疾志贺菌7型引起的细菌感染的方法。疫苗可以是包含本发明中某个核酸分子的核酸疫苗或包含本发明中某个蛋白的蛋白疫苗。核酸疫苗要包括在载体上并能在宿主体内表达对应蛋白的核酸序列。疫苗可以包括一个合适的运输载体，比如水溶液、悬浮剂、缓冲液、赋形剂和一种或多种已知的佐剂。疫苗还可以包括防腐剂，比如叠氮化钠、卩-丙内醇。本发明中的疫苗可以设计为既可以给动物包括哺乳动物、鸟类和鱼类服用；也可以给人类、和其它哺乳动物，包括牛、马和猪等服用。还可以用方便的方法服用本发明的疫苗，比如静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔给药、经鼻吸收或口服。服用剂量可以根据所要达到的效果、给药途径的不同和其它本领域人员熟知的因素而定。(6)本发明还可以用于制作方便实施本发明的试剂盒。例如，实施本发明中方法的试剂可以包装成拥有必要材料、合适包装的、方便的试剂盒。试剂盒中除包括使用本发明描述的方法检测本发明中的核酸或蛋白分子所需的所有试剂，还应有实施本发明中方法的一些必要的说明。应当指出，上述"合适的条件下"包括本领域的技术人员所理解的温度、时间、体积和底物的量、压力等使底物经反应生成推测的产物。上述"足够量"或"足够浓度"是指能产生可被检测的产物的底物的量或浓度。本发明提出2种分别表达罕见单糖转氨酶I、转氨酶II和乙酰转移酶的重组质粒，它们至少分别包括上述编码罕见单糖转氨酶i、转氨酶n和乙酰转移酶的基因。本发明还提出一种生产可作为商品或其它反应底物的dTDP-Qui4NAc和dTDP-Qui4N的方法，该方法包括在生产dTDP-Qui4NAc和dTDP-Qui4N过程中使用上述酶的步骤。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。图l.VioAl、VioAII、VioB反应的毛细管电泳图谱;图2.VioAlI反应产物的一级质谱；图3.VioAI反应产物的一级质谱；图4.VioB反应产物的一级质谱；图5.VioB反应产物的二级质谱；图6.VioB反应产物的三级质谱；图7.VioB反应产物的核磁共振图谱；图8.dTDP-GlcO转氨酶II基因缺失的痢疾志贺菌7型培养3天后的平板图片。具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是由于说明不是限制本发明。实施例一合成酶基因的克隆1.大肠杆菌07和痢疾志贺菌7型的总DNA提取取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250ial50mMTris缓冲液中(pH8.0)，离心去上清，菌体重悬于250^150mMTris缓冲液中(pH8.0)加入1(V10.4MEDTA(pH8.0),混匀后37。C保温20分钟，之后加入15^20mg/ml溶菌酶，混匀后37"C保温15分钟，再加入2pl50mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后再加入15^110%SDS，5(TC保温至澄清,再加入7|il25mg/mlRNA酶，65"C保温15分钟，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提2次，氯仿:异戊醇抽提1次，最后一次的上清溶液加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于20plTE缓冲液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)。2.dTDP-GlcO转氨酶I基因的克隆和筛选取前面所述的大肠杆菌07总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。设定的PCR循环参数如下95°C，3分钟；95°C，30s;55°C，30;72°C，1分钟；72°C，3分钟；4°C，2小时引物序列见SEQIDNO:7-8。将上述PCR产物用BamHI和HindIII双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收l.lkb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a后，涂于50pg/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37"培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQIDNo:1所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLWl195，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为H1427。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长1116bp由ATG起始密码开始，到TGA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:l所示。该完整的ORF编码一个由371个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于转氨酶家族，最高相似性同K/Z)Woc/zo/erae的转氨酶基因，同源性为50%。将重组质粒pLWl195转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21为H1426。3.dTDP-GlcO转氨酶II基因的克隆和筛选取前面所述的痢疾志贺菌7型的总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。设定的PCR循环参数如下95°C，3min;95°C，30s;50°C，30s;72°C，lmin;72°C，3min;4。C，2hr引物序列见SEQIDNO:9-10。将上述PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收l.lkb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a后，涂于50pg/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37。C培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQIDNo:3所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1049，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为H1219。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长1104bp，由ATG起始密码开始，到TGA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。该完整的ORF编码一个由367个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于转氨酶家族，最高相似性同F/6Woc/zo/erae的转氨酶基因，同源性为51%。将重组质粒pLW1049转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21为H1208。4.dTDP-Qui4N乙酰转移酶基因的克隆和筛选取前面所述的大肠杆菌07的总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。设定的PCR循环参数如下95°C，3分钟；95°C，30s;50°C，30s;72°C，1分钟；72°C，3分钟；4°C，2小时引物序列见SEQIDNO:11-12。将上述PCR产物用NcoI和SalI双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收l.lkb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a后，涂于50pg/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37。C培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQIDNo:2所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1049，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为H1362。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长579bp，由ATG起始密码开始，到TGA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。该完整的ORF编码一个由192个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于转氨酶家族，最高相似性同^^wWm'k^7/w决emoam^M^的乙酰转移酶基S同源性为39%。将重组质粒pLW1049转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21为H1363。实施例二合成酶的纯化1.重组dTDP-GlcO转氨酶I的纯化和特性将上述重组菌BL21H1426单克隆接入20ml含50jig/mlKan的LB培养基中，37°C，200卬m培养U小时，然后将培养物按1%(V/V)接种量接入250ml含50吗/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶)，37°C，220rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.lmM25°C，180rpm诱导4小时、离心收集菌体，悬于一定量的Bindingbuffer(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl,10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组dTDP-GlcO转氨酶I的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组dTDP-GlcO转氨酶的分子量为43850道尔顿，与理论推算的分子量(45210道尔顿)相似。2.重组dTDP-GlcO转氨酶II的纯化和特性将上述重组菌BL21H1208单克隆接入20ml含50吗/mlKan的LB培养基中，37°C，200rpm培养12小时，然后将培养物按1%(V/V)接种量接入250ml含50吗/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶)，37°C，220rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.lmM37°C，220rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Bindingbuffer(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组dTDP-GlcO转氨酶II的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组dTDP-GlcO转氨酶的分子量为43772道尔顿，与理论推算的分子量(42472道尔顿)相似。3.重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的纯化和特性将上述重组菌五.co/fBL21H1363单克隆接入20ml含50昭/mlKan的LB培养基中，37°C，200rpm培养12小时，然后将培养物按1%(V/V)接种量接入250ml含50吗/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶)，37°C，220rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.lmM37°C，220rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Bindingbuffer(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中1，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的分子量为27166道尔顿，与理论推算的分子量(22429道尔顿)相似。实施例三大肠杆菌07中dTDP-Qui4NAc产物的鉴定1.重组dTDP-GlcO转氨酶I的转氨作用在0.5ml离心管中装入20^1下列反应体系2mMdTDP-GlcO，0.2mM磷酸吡口多醛，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，5mMMgCl2，50mML-谷氨酸，0.66pM实施例二中制得的重组dTDP-GlcO转氨酶I的纯化酶制剂。37。C反应30分钟。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析结果如图1中的G所示结果显示底物消失有新产物生成(图1中的A是RmlB的产物dTDP-GlcO，E表示将dTDP-GlcO转氨酶IIO(TC使其失活后加入反应体系反应后的产物，F表示加入转氨酶抑制剂的反应产物)重复此反应，积累500^1体系后，经FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪检测，546.33的峰与dTDP-Qui4N的理论分子量547.34接近，初步证明产物为dTDP-Qui4N，如图3所示。2.重组dTDP-GlcO转氨酶II的转氨作用在0.5ml离心管中装入20(il下列反应体系2mMdTDP-GlcO，0.2mM磷酸吡卩多醛，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，5mMMgCl2，50mML-谷氨酸，2fiM实施例二中制得的重组dTDP-GlcO转氨酶II的纯化酶制剂。37。C反应l小时'。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析结果如图1中的D所示，结果显示底物消失，有新产物生成。(图1中的B表示将dTDP-GlcO转氨酶II100。C使其失活后加入反应体系反应后的产物，C表示加入转氨酶抑制剂的反应产物)。重复此反应，积累500^1体系后，经FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪检领lj，546.13的峰与dTDP-Qui4N的理论分子量547.34接近，初步证明产物为dTDP-Qui4N，如图2所示。3.重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的作用在0.5ml离心管中装入20)il下列反应体系2mMdTDP-Qui4N，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，2.5mM乙酰辅酶A(acetyl画CoA)，1.93jiM实施例二中制得的重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的纯化酶制剂。37。C反应20分钟。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析。结果显示底物消失，有新产物生成,见图1中的I(图1中的H表示将dTDP-Qui4N乙酰转移酶IO(TC使其失活后加入反应体系反应后的产物，J表示acetyl-CoA标准品，K表示反应的另一产物SH-CoA标准品)。重复此反应，积累500pl体系后，经FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪检测，588.13的峰与dTDP-Qui4NAc的理论分子量589.38接近，然后以588.13这个分子为母离子进行碎裂，得到321.13的峰，与Qui4NAc+P03+P03的322.12接近，再以321.13这个分子为母离子进行碎裂，得到195.07的峰，与P03+P03+H20的195.99接近，初步证明产物为dTDP-Qui4NAc，如图4，5，6所示。重复此反应，积累3-4ml体系后，经BioCAD700E高效液相分离纯化产物，然后经BmkerDRX-500核磁共振仪检测，最终确定产物是dTDP-Qui4NAc，如图7所示。实施例四dTDP-Oui4N和dTDP-Oui4NAc的分离纯化、质谱检测及核磁共振检测方法将反应体系注入BioCAD700E纯化工作站中分离，使用VenusilMP-C18柱(4.6x250mm)，流动相为10%乙腈和90%50mM三乙胺-醋酸溶液(pH6.0)，流速为0.6ml/min。将收集到的产物冻干，用50%甲醇回溶，注入Fi皿iganLCQAdvantageMAX质谱仪检测。使用电喷雾源，负相，4.5kV，250°C。在做二、三级质谱时以氮气作为碰撞气体，氦气为辅助气体，碰撞能量为20-30eV。将0.2mg最终产物溶于99.96X020中，以三甲硅基-[2，2，3，3-2^]-丙酸酯钠为内标，85%磷酸为外标，使用BmkerDRX-500核磁共振仪在3(TC检测。TOCSY实验中的混合时间为200ms。实施例五大肠杆菌07中dTDP-Qui4NAc和痢疾志贺菌7型中dTDP-Qui4N合成途径的确定大肠杆菌07中dTDP-Qui4NAc合成途径中和痢疾志贺菌7型中dTDP-Qui4N合成途径的RmiA和RmlB的功能已在其它菌株中被鉴定，同源性在65%以上，再经过CE检测，发明人认为在大肠杆菌07中和痢疾志贺菌7型中上述酶的功能是将Glc-l-P转化为dTDP-GlcO。通过实施例三中的实验证明了大肠杆菌07中和痢疾志贺菌7型中的转氨酶均将dTDP-GlcO转化为dTDP-Qui4N，而大肠杆菌07中的乙酰转移酶将dTDP-Qui4N转化为dTDP-Qui4NAc。至此证明了大肠杆菌07中dTDP-Qui4NAc的合成途径可以表述如下Glc-1-p—dTDP-Glc-dTDP-GlcO-dTDP-Qui4N-dTDP-QuicNAc。痢疾志贺菌7型中dTDP-Qui4N合成途径可以表述如下Glc-1-p—dTDP-Glc——dTDP-GlcO——dTDP-Qui4N实施例六合成酶的活性鉴定1.重组dTDP-GlcO转氨酶I的活性测定在0.5ml离心管中装入20)il下列反应体系2mMdTDP-GlcO，0.2mM磷酸吡哆醛，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，5mM的二价金属离子氯化物，50mML型氨基酸，0.66|iM实施例二中制得的重组dTDP-GlcO转氨酶I的纯化酶制剂，一定温度下，反应30分钟。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析。(l)最适酶活温度上述反应条件下，在4-75。C范围内测定上述重组dTDP-GlcO转氨酶I的活性，结果表明该酶的最适温度范围为37-75°C。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(2)二价金属离子影响上述反应条件下(37°C)，金属离子为Mg^C^+,M^+，F^+,C^+条件下，测定上述重组dTDP-GlcO转氨酶I的活性，结果表明抑制能力由小到大为Mg2+，Ca2+,Mn2+,Fe2+,C02+，其中Fe2，Co"使其转化率降至10%以下。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(3廣基供体影响上述反应条件下(37°C，MgCl2)，氨基供体为L型精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的条件下，测定上述重组dTDP-GlcO转氨酶I的活性，结果表明L-谷氨酸是其最适氨基供体,L-谷氨酰胺和L-丙氨酸使转化率达15%左右，其余均不能使反应进行。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>上述反应条件下(37°C，MgCl2，L-谷氨酸，0.022pM酶，3分钟)，dTDP-GlcO的浓度为0.02-0.lmM，测定dTDP-Qui4N的浓度，根据米氏方程得出上述重组dTDP-GlcO转氨酶I的Km值为45.8|iM，^加为5.66s。2.重组dTDP-GlcO转氨酶II的活性测定在0.5ml离心管中装入20^d下列反应体系2mMdTDP-GlcO，0.2mM磷酸吡哆醛，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，5mM的二价金属离子氯化物，50mML型氨基酸，2jiM实施例二中制得的重组dTDP-GlcO转氨酶II的纯化酶制剂，一定温度下，反应60分钟。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析。(l)最适酶活温度上述反应条件下，在4-75。C范围内测定上述重组dTDP-GlcO转氨酶II的活性，结果表明该酶的最适温度为37。C。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>(2)二价金属离子影响上述反应条件下(37°C)，金属离子为Mg、Ca^M^+，Fe、C(^+条件下，测定上述重组dTDP-GlcO转氨酶II的活性，结果表明抑制能力由小到大为Mg2+,Ca2+,Mn2+,Fe2+,C02+，其中002+使其转化率降至25%以下。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>(3)氨基供体影响上述反应条件下(37°C，MgCl2)，氨基供体为L型精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的条件下，测定上述重组dTDP-GlcO转氨酶I的活性，结果表明L-谷氨酸是其最适氨基供体，结果表明L-谷氨酸是其最适氨基供体，L-谷氨酰胺也使转化率达74%，L-丙氨酸和L-甘氨酸仅使转化率达5%，其余均不能使反应进行。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>上述反应条件下(37°C，MgCl2，L-谷氨酸，liaM酶，IO分钟)，dTDP-GlcO的浓度为0.05-2mM，测定dTDP-Qui4N的浓度，根据米氏方程得出上述重组dTDP-GlcO转氨酶II的U直为980pM，&。,为0.74s。3.重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的活性测定在0.5ml离心管中加入下列反应体系2mMdTDP-Qui4N，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，5mM的二价金属离子氯化物，1.93pM实施例二中制得的重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的纯化酶制剂，一定温度下，反应20分钟。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析。(l)最适酶活温度上述反应条件下，在4-75X:范围内测定上述重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的活性，结果表明该酶的最适温度范围为25-5(TC。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>上述反应条件下(37°C)，金属离子为Mg"，Ca^Mn",Fe",Co"条件下，测定上述重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的活性，结果表明只有Fe^抑制这个反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>(3)4、U直测定在0.5ml离心管中加入20(il下列反应体系1.9mMdTDP-Qui4N，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，0.187-1.87mM乙酰辅酶A，5mMMgCl2，0.046pM实施例二中制得的重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的纯化酶制剂，37i:反应3分钟。氯仿抽提后，水相加入2mMDTNB，混匀，在412nm测吸光度，换算为dTDP-Qui4NAc的浓度，根据米氏方程得出上述重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶对乙酰辅酶A的《m值为554pM，^,为21.6s。在0.5ml离心管中加入20|il下列反应体系0.08-0.48mMdTDP-Qui4N，50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，3mM乙酰辅酶A，5mMMgCl2，3.86nM实施例二中制得的重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶的纯化酶制剂，37'C反应2分钟45s。氯仿抽提后，水相加入2mMDTNB，混匀，在412nm测吸光度，换算为dTDP-Qui4NAc的浓度，根据米氏方程得出上述重组dTDP-Qui4N乙酰转移酶对dTDP-Qui4N的Km值为142|iM，&加为155.3s。实施例七痢疾志贺菌7型中dTDP-GkO转氨酶II基因的缺失将质粒pKD20转化入感受态痢疾志贺菌7型中，3(TC培养。以质粒pKK232作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR，扩增两端含有部分讨o4序列的cW基因。设定的PCR循环参数如下95°C，5分钟；95°C，30s;56°C，45s;72°C，2分钟；72°C，10分钟；4°C，10小时引物序列见SEQIDNO:13-14将上述PCR产物转化入感受态含有pKD20的痢疾志贺菌7型中，37°C培养。两端含有部分WoJ序列的c^基因重组后，使得痢疾志贺菌7型中dTDP-GlcO转氨酶II基因缺失。培养3天后平板上未长出任何菌落，请参照图8，是dTDP-GlcO转氨酶II基因缺失的痢疾志贺菌7型培养3天后的平板图片，说明缺失dTDP-GlcO转氨酶II基因后，罕见单糖的合成受阻，从而阻断细菌O抗原合成，最终阻止细菌的繁殖。虽然本发明已较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
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的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表<110>南开大学<120>—种利用生物法合成dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖、制各方法及妖:用途<130〉7P13001-CN<160>14<170>Patentfnversion3,2<210>1<211〉1116<212>DNA<213>编码转氨酶IVioAI的DNA序列<400>1atgaacgataaaactattccagtaacgcaaccttctttgccggaacttgcagaattcatg60ccttacctggaaaaaatatggaaaaataaatggttgacaaataatggaccatttcatcaa120gaactcgaggaaaaattatgtgaatttttgggtgtgcagcatatctcgctttttaacaat180gcaacaattgcattgatcacagcattacaagccctaagaataacaggtgaggtaataaca240acaccatattcatttgttgcaacttcacatgctatutatggaatggacttacgcctgtc3G()tttgttgatattgaaaatgatggatataatattgattacagaaaaatagaacaggctatt360acaccaa肌acttcagcaattttacctgtccattgctactcaacaccctgtgaagtcgaa420gaaattcaaaaaatagctgataattatggattgaaagtaatctacgacgcagcacatgca480ttcggtgtaaattttaaagggggcaaagtttacttaactatggtgatttatcaattctta540gtttccatgcgacgaaagtcttcaataaactttgaaggtggggcaataattagccctgat600gctaaaaccaagttacgtatagatcgaltaaaaaactttggtatcgccgacgagctgact660gtgacagctccaggaataaatggcaaaatgagtgaaattaatgctgcctttggacttgtt720cagttaaagcatattgagggctcaatatctaagcgaaaaataattgatagtctttaccgg780aatttactgaaagggactccgggtattactatatttccaggaaalat雄tacaaatagc840aactattcatattttcctatactcatagatgatggUUcatatgaglcgtgatcaggca900tatgaattacttaagaaaaataatatcctatctcgaaagtatttttatccattaatcagt960aatatgcctatgtatcgaggattgatttcagctagcgttgataatctaccaatagccaat1020agtgttgctgataaagtcctatgcttgccaatatatacagatttaaatgaagagattgU1080gtgaaaataaccaaattattattgggtaagatgtga1116<2I0>2<211>579<212>DNA<213>编码乙酰转移酶VioB的DNA序列<400>2atggcctatttagatgaaatacagttaaaagaaatgggcttcaaaagcgttggagaaaat60gtaaaaatatcagataaggcatctttttatgggt跑ataatattagtattgggaataat120gtaaggattgatgatUttgcgtgttttcagctggagagggtggkiUgatatacacgat180tatattcatatagcggtatattcttcaattattggcaaaggaaaagUmctatatctgac240tacgcaaacatttcatctcgagtctcaatatattccagtaacgagtattattctggcaat300tatatgtctaatccagtagttccaagtgaatatacgaatatacatagx、ggtactgtattt360ataggcaaacatgttatcataggttgcggaagtattgttcttccggatgttattttacat420gagggtgcagcaattggagctctttctgtagtcaaagaggattgtgaagcttttacggta480aatgtaggtataccagctaaaccaatatctg咖gaagcaagaaattattggagcttgaa540tctgtatttaaaccaagcgctattggagataatctgtga579<210>3<211>隨<212>DNA<213>编码转氨酶IIVk、八11的DNA序列<400>3atggaaaagccaatctttgtaacgcaacctaatttaccaccgctag鄉agtttatacca60tatctggaaatcatttggcagaataagcaaUtacaaataatggtccaatgcatcaaaaa120ttagaaaaaaaattatgcgagtttcttggtgttgaatacattagtctatttaataatggg180actattgcgcttataaccgcagtacaggctttgggtgttaaaggcgaagtaattaccaca240ccatattcctttgtagcaactgcacactccttggtcttaaatgggctlaaacctgttttt300gtcgatattgatcccaaaaccttaaatatcgatccgagaagaattgaagaggcgattacc360cctgaaacgcaggcaataaJgccggtgcactgctatgggaatccttgcgatacacaagct420attgctgatattgcgcaaaaatataatttaaaggtcatttatgatgctgcgcatgccttt480ggcgttgaagatgatgatggaagtgttc(tcgccatggagatctaagtgtcttaagtttc540catgcaactaaagtgttcagcacttttgaaggcggagctattgtgtgtaatagtaaagaa600atgaaagaaaaaattgatagactaaaaaactttggttatatcgatgaaactaacatcaat660atcattggctctaatggaaaaatgagcgaagttaatgctgctttcggcttgctacaatta720gaacatatggatacttttctacgtggtcgaatgaatgctgacatgtittatcggcagaaa780cttaaagatatcactggtataagcatagtaattcccagcggccagaaaatatcgaatttt840tcatatttccctatattggttgaatctgattttccgttatctcgtgatgaactatttaat900tatctgaagaaccagaatatttttgcaagacgttatttttatcctgttataccagatttt960caagcgtatttgaatgtaggtgaagtctgtgatgtcaagaatgcccgtgaaatagcctcg1020aaagtgctttgcctaccgatgcatgcagaattgagctctgatatcttagaatatattgta1080agtacgattagggagattaaatga1104<210>4<211>371<212>PRT<213>编码转氨酶IVioAI的氮基酸序列<400>4MetAsnAspLysThrlieProValThrGinProSerLeuProGluLeu151015AlaGluPheMetProTyrLeuGluLyslieTrpLysAsnLysTrpLeu202530ThrAsnAsnGlyProPheHisGinGluLeuGluGluLysLeuCysGlu354045PheLeuGlyValGinHislieSerLeuPheAsnAsnAlaThrlieAla505560LeulieThrAlaLeuGinAlaLeuArglieThrGlyGluVallieThr65707580ThrProTyrSerPheValAlaThrSerHisAlalieLeuTrpAsnGly859095LeuThrProValPheValAsplieGhiAsnAspGlyTyrAsnlieAsp100105110TyrArgLyslieGluGinAlalieThrProLysThrSerAlalieLeu115120125ProValHisCysTyrSerThi.ProCysGluValGhiGlulieGinLys130135140lieAlaAspAsnTyrGlyLeuLysVallieTyrAspAlaAlaHisAla145150155160PheGlyValAsnPheLysGlyGlyLysValTyrLeuThrMetVallie165170175TyrGinPheLeuValSerMetArgArgLysSerSerIkAsnPheGlu180185190GlyGlyAlalielieSerProAspAlaLysThrLysLeuArglieAsp195200205ArgLeuLysAsnPheGlylieAlaAspGluLeuThrValThrAlaPro210215220GlylieAsnGlyLysMetSerGlulieAsnAlaAlaPheGlyLeuVal225230235240GinLeuLysHislieGluGlySerlieSerLysArgLyslielieAsp245250255SerLeuTyrArgAsnLeuLeuLysGlyThrProGly〖IeThrliePhe260265270ProGlyAsnlieAsnThrAsnSerAsnTyrSerTyrPheProHeLeu275280285lieAspAspGlyPheHisMetSerArgAspGinAlaTyrGluLeuLeu290295300LysLysAsnAsnlieLeuSerArgLysTyrPheTyrProLeulieSei.305310315320AsnMetProMetTyrArgGlyLeulieSerAlaSet'ValAspAsnLeu325330335ProlieAlaAsnSerValAlaAspLysValLeuCysLeuProlieTyr340345350ThrAspLeuAsnGluGlulieValValLyslieThrLysLeuLeuLeu355360365GlyLysMet370<210>5<211>367<212>PRT<213>编码转氨酶IIVioA1!的氨基酸序列<400>5MetGluLysProliePheValThrGinProAsnLeuProProLeuGlu151015GluPheHeProTyrLeuGlulieHeTrpGinAsnLysGinPheThr202530AsnAsnGlyProMetHisGinLysLeuGluLysLysLeuCysGluPhe354045LeuGlyValGluTyrlieSerLeuPheAsnAsnGlyThrlieAlaLeu505560lieThrAlaValGinAlaLeuGlyValLysGlyGluValHeThrThr65707580ProTyrSerPheValAlaThrAlaHisSerLeuValLeuAsnGlyLeu859095LysProValPheValAspHeAspProLysThrLeuAsnlieAspPro100105110ArgArglieGluGluAlalieThrProGluThrGinAlalieMetPro115120125ValHisCysTyrGlyAsnProCysAspThrGinAlalieAaAsplie130135140AlaGinLysTyrAsnLeuLysVallieTyrAspAlaAlaHisAlaPhe145150155160GlyValGluAspAspAspGlySerValLeuArgHisGlyAspLeuSer165170175ValLeuSerPheHisAlaThrLysValPheSerThrPheGluGlyGly180185190AlalieValCysAsnSerLysGluMetLysGluLyslieAspArgLeu195200205LysAsnPheGlyTyrlieAspGluThrAsnlieAsnlielieGlySer210215220AsnGlyLysMetSerGluValAsnAlaAlaPheGlyLeuLeuGinLeu225230235240GluHisMetAspThrPheLeuAi.gGlyArgMetAsnAlaAspMetPhe245250255TyrArgGinLysLeuLysAsplieThrGlylieSerlieValliePm260265270SerGlyGinLyslieSerAsnPheSei'TyrPheProlieLeuValGlu275280285SerAspPheProLeuSerAi'gAspGluLeuPheAsnTyrLeuLysAsn290295300GinAsnliePheAlaArgArgTyrPheTyrProVallieProAspPhe3053H)315320GinAlaTyrLeuAsnValGlyGluValCysAspValLysAsnAlaArg325330335GlulieAlaSerLysValLeuCysLeuProMetHisAlaGluLeuSer340345350SerAsplieLeuGluTyrHeValSerThrHeArgGlulieLys355360365<210>6<211>192<212>PRT<213>编码乙酰转移酶VioB的氨基酸序列<400>6MetAlaTyrLeuAspGlulieGinLeuLysGluMetGlyPheLysSer151015ValGlyGJuAsnValLyslieSerAspLysAlaSerPheTyrGlyCys202530AspAsnlieSerlieGlyAsnAsnValArglieAspAspPheCysVal354045PheSerAlaGlyGluGlyGlylieAsplieHisAspTyrHeHislie505560AlaValTyrSerSerHelieGlyLysGlyLysValThrHeSerAsp65707580TyrAlaAsnHeSerSerArgValSerlieTyrSerSerAsnGluTyr859095TyrSerGlyAsnTyrMetSerAsnProValValProSerGluTyrThr100105110AsnHeHisSerGlyThrValPlielieGlyLysHisVallielieGly115120125CysGlySerlieValLeuProAspVallieLeuHisGluGlyAlaAla130135140lieGlyAlaLeuSerValValLysGluAspCysGluAlaPheThi'Val145150155160AsnValGlylieProAlaLysProlieSerGluArgSerLysLysLeu165170175LeuGluLeuGluSerValPheLysProSerAlalieGlyAspAsnLeu180185190<210>7<211>35<212>DNA<213>基于dTDP-GlcO转氣酶I基因设计并合成的上游引物<400>7gcaggatccatgaacgataaaactattccagtaac35<210>8<211>35<212>DNA<213>基于dTDP-GlcO转氨酶I基因设计并合成的下游引物<400>8gtcgaagctttcacatcttacccaataataatttg35<210>9<211>31<212>DNA<213>基于dTDP-GlcO转氨酶1基因设计并人工合成的上游引物<400>9gagaattcatggaaaagccaatctttgtaac31<210>10<211>31<212>DNA<213>基于dTDP-GlcO转氣嗨II基因设计并人工合成的下游引物<400>10gcacttctcgagtcatttaatctccctaatc31<210>11<211>27<212>DNA<213>基于dTDP-Qui4N乙酰转移酶基因设计并人工合成的上游引物<400>11ggtcccatggcctatttagatgaaatac27<210>12<211>28<212>DNA<213>基于dTDP-Qui4N乙酰转移酶基因设计并人工合成的下游引物<400>12cggaagtcgaccagattatctccaatag28<210>13<2U>60<212>DNA<213>基于dTDP-GlcO转氨離II基因设计并合成的、扩增含有部分wo4序列的W媒W的上游引物<400>13gcgagtttcttggtgttgaatacattagtctatttaataagagtaggacaaatccgccga60<210>14<211>60<212>DNA<213>基于dTDP-GlcO转玩,II基因设计并合成的、扩增含有部分Wa^序列的基闲的下游引物<400>14gcatcggtaggcaaagcactttcgaggctatttcacgggcaaattacgccccgccctgcc60权利要求1.一种在革兰氏阴性菌中利用转氨酶合成的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖，具有下述式(I)结构2.按照权利要求1所述的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖，其特征在于所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌07，所述的转氨酶为转氨酶I;所述的编码转氨酶I的基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列a)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:l但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:l所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的转氨酶I的核苷酸序列。3.按照权利要求2所述的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖，其特征在于所述的转氨酶I具有选自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；k)SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；1)上述k)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有转氨酶I的活性。4.一种表达权利要求2或3所述的转氨酶I的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。5.—种产生权利要求2或3所述的转氨酶I的重组菌，所述的重组菌导入了转氨酶I。CIh6.权利要求2所述的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖经乙酰转移酶转化为具有式(II)的dTDP-4-乙酰氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)。7.按照权利要求6所述的dTDP-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖，其特征在于所述的编码乙酰转移酶的基因具有选自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；e)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:2但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)在严格杂交条件下与上述d)或e)中的序列杂交，并且编码具有活性的乙酰转移酶的核苷酸序列。8.按照权利要求7所述的dTDP-4-乙酰氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖，其特征在于所述的乙酰转移酶具有选自于下列p)、q)或r)的氨基酸序列p)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；q)SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；r)上述q)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有乙酰转移酶的活性。9.一种表达权利要求7或8所述的乙酰转移酶的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。10.—种产生权利要求7或8所述的乙酰转移酶的重组菌，所述的重组菌导入了乙酰转移酶。11.按照权利要求1所述的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖，其特征在于所述的革兰氏阴性菌为痢疾志贺菌7型，所述的转氨酶为转氨酶II;所述的转氨酶II基因具有选自下列g)、h)、i)的核苷酸序列g)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；h)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:3但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:3所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；i)在严格杂交条件下与上述g)或h)中的序列杂交，并且编码具有活性的转氨酶II的核苷酸序列。12.按照权利要求11所述的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖，其特征在于所述的转氨酶II具有选自于下列m)、n)或o)的氨基酸序列m)上述d)、e)或f)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；n)SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；o)上述n)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有转氨酶II的活性。13.—种表达权利要求11或12所述的转氨酶II的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。14.一种产生权利要求11或12所述的转氨酶II的重组菌，所述的重组菌导入了转氨酶n。全文摘要本发明涉及生物法体外合成的具有式(I)的dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4N)，进而利用乙酰转移酶合成dTDP-4-乙酰氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖(dTDP-Qui4NAc)，本发明还涉及上述两种单糖的制备方法与用途，及上述两种单糖合成中的酶及其用途。文档编号C12P19/02GK101338330SQ200710127579公开日2009年1月7日申请日期2007年7月3日优先权日2007年7月3日发明者露冯,徐艳丽,磊王,颖王,齐源远申请人:南开大学