专利名称：一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法
技术领域：
本发明涉及一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，具体涉及以明胶、 海藻酸钠或/和卡拉胶为载体的包埋-交联法；或以尼龙网为载体的交联-共价法， 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶，属于食品生物技术领域。
背景技术：
在大规模的工业生产中使用游离酶，不仅会增加生产成本，而且由于混入 了外加蛋白，导致产品的质量不高。酶经过固定化之后，不仅能够实现连续操 作，反复回收使用，而且简化了后续的分离步骤。固定化后的酶其物理化学性 质会发生一定的改变，对温度和pH的稳定性得到增强，具有很大的优越性。1970 年Mosbach建立了固定化多酶体系，实现了固定化多酶体系的共固定和共反应。 共固定化酶技术不仅能使酶反应的连续生产成为现实，简化下游分离纯化步骤， 而且还具有单独固定化酶所不具有的协同反应能力，能够将底物一步转化成产 物，副反应少，催化效率高，经济效益显著。
目前工业上生产乳果糖主要采用化学催化法，但此法反应条件激烈，得到 的产品色泽深，副产物多，催化剂分离困难，给糖浆的进一步纯化及制取结晶 带来困难。而采用酶法制备乳果糖专一性强、副产物较少、产品色泽浅，但成 本较高。因此有必要为乳果糖的生产开发出一种共固定化的乳糖酶和葡萄糖异 构酶，以降低生产成本，提高催化效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法。通过研 究共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的构建，以期得到一种两种酶的活力回收率 都比较高、半衰期长、载体对酶的伤害小、机械强度高的固定化方法。
本发明的技术方案 一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，以明胶、 海藻酸钠和/或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构 建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；或以尼龙网为载体采用先交联后共价结合 的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；
(A)包埋-交联法以明胶、海藻酸钠和/或卡拉胶中的一种或几种为载体， 采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶
a) 配制pH4—10的质量浓度5%—27%的20g胶溶液，在30"C水浴中使胶完 全溶解；
b) 按照活力比2:1 —1:5将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于2mL去离子水中；
C)将b)配制的乳糖酶和葡萄糖异构酶的混合酶液添加到胶溶液中，使两种 酶的添加量为l一30U/g胶溶液，搅拌混匀；
d) 在c)所得的胶溶液中加入2mL体积分数0.05% — 5%的戊二醛，搅拌后立 即倒入培养皿中，4'C硬化过夜，得凝胶；
e) 次日将凝胶浸入到体积分数0.05% — 5%的戊二醛中，在4。C一30。C交联 10min—60min，然后用去离子水清洗凝胶若干次，滤纸吸干表面水，最后切成 2mm见方的小方块，即为共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；
或(B)交联-共价法采用尼龙网为载体共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶
a) 尼龙网的预处理将60目的尼龙网裁成边长2cm的小片，先用lmol/L NaOH浸洗10min，水洗至中性，再用lmol/LHCl浸洗10min，再水洗至中性， 然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性杂质，再用乙醇除去丙酮， 晾干，接着将尼龙网浸泡在含18.6% CaCl2禾卩18.6%水的甲醇溶液中，5(TC保 温20min,将尼龙网滤出并彻底水洗，乙醇脱水，晾干；
b) 尼龙网的活化:将预处理后的尼龙网浸入到3-二甲氨基丙胺中7(TC活化5 一15h，彻底水洗；
c) 载体的交联将活化后的尼龙网浸入体积分数0.05%—5%、 pH4—10的戊 二醛中，4'C一3(TC浸泡10min—60min，接着用pH7的磷酸盐缓冲液反复清洗 尼龙网；
d) 酶与载体的结合配制浓度为l一30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL 酶液一30g/100mL酶液的量将尼龙网添加到乳糖酶液中，4"C一3(TC下不断搅拌 浸泡5—20h，滤出尼龙网，水洗至水洗液中无蛋白之后再将尼龙网浸泡到l一 30U/ mL的葡萄糖异构酶溶液中，尼龙网的添加量为100mL酶液用5-30g尼龙 网，4-C一30'C不停缓慢搅拌浸泡5—20h，最后用去离子水多次清洗尼龙网表面 至水洗液中无蛋白，用冷风吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。
所用的游离乳糖酶的比活力为3000U/g，游离葡萄糖异构酶的比活力为 2000U/g。
共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶用于乳糖为底物制备乳果糖。
一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法，以共固定化乳 糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂，以乳糖为单一底物制备乳果糖；
(A)共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的间歇式乳糖转化反应
用pH4—10的磷酸盐缓冲液配制5。/。一40W (w/w)的乳糖溶液，稍加热使 乳糖溶解，添加1.5—10U/mL的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶，在25—6(TC 温度下反应12—48h，并回收共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；
或(B)共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的连续式乳糖转化反应: 用pH4—10的磷酸盐缓冲液配制5。/。一40e/。 (w/w)的乳糖溶液，稍加热使乳糖
溶解，自上而下进料反应，按0.02_0.3mL/min的流速使乳糖溶液匀速通过装载 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的恒温酶反应柱，温度为25—70°C，单程操作。 本发明的有益效果
1、 与液态酶相比，共固定化酶具有能够回收利用，简化下游分离步骤等显 著优点。因此采用将乳糖酶和葡萄糖异构酶进行共固定化的方法，可以节约经 济成本，增强市场竞争力。
2、 与固定化单一酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶能够发挥两种酶 之间的协同作用，实现底物到产物的一步转化，减少副产物。因此采用将乳糖 酶和葡萄糖异构酶进行共固定化的方法，具有提高反应效率和产品质量等优点。
图1共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的热稳定性变化。 图2共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的pH稳定性变化。 图3共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的操作稳定性。
具体实施例方式
实施例1:配制pH 8.6 27。/。(w/w)明胶溶液20g，在3(TC水浴中使明胶完全 溶解，按照活力比l:l将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于2mL去离子水中，将酶液 加到明胶中，使两种酶的添加量均为3U/g (明胶溶液)，搅拌混匀，再加入体积 分数为0.15。/。的戊二醛2mL，搅拌后立即倒入培养皿，在4。C固化过夜，次日将 其浸入体积分数为0.15%的戊二醛中4'C交联10min，然后用去离子水清洗多次， 滤纸吸干表面水，最后切成2mm见方的小方块。测得共固定酶中乳糖酶的回收 率为30.85%，葡萄糖异构酶的回收率为83.48%。
图1显示了游离乳糖酶、游离葡萄糖异构酶及共固定化乳糖酶和葡萄糖异 构酶的热稳定性变化，并均以酶在20。C保温lh的活力作为100%。如图示，游 离乳糖酶在不高于3(TC保温lh活力始终保持在90%以上，而在35'C保温后活 力迅速下降到80.55%;游离葡萄糖异构酶在不高于35'C时保温lh活力始终保 持在90%以上，而在40。C保温后活力迅速下降到83.31%;而共固定化乳糖酶和 葡萄糖异构酶在不高于45'C时保温lh活力始终保持在90%以上，在5(TC保温 后活力下降到84.47%。说明共固定化之后酶的热稳定性比两种游离酶有所提高。
图2显示了游离乳糖酶、游离葡萄糖异构酶及共固定化乳糖酶和葡萄糖异 构酶的pH稳定性变化。如图示，游离乳糖酶在pH 6.2保存8h活力最大，pH6.8 保存残余活力为96.82%，髙于或低于这个范围其残余活力迅速下降；游离葡萄 糖异构酶在pH8.5保存8h活力最大，pH 7.5—8.5之间保存残余活力始终保持在 90%以上，高于或低于这个范围其残余活力迅速下降；而共固定化乳糖酶和葡萄 糖异构酶在pH 7.5保存8h活力最大，在pH6.8—9之间保存残余活力始终保持 在90%左右，高于或低于这个范围其残余活力迅速下降。说明共固定化之后酶
的pH稳定性比两种游离酶大大提高。
图3显示了同一批共固定乳糖酶和葡萄糖异构酶在45°C、 pH7.5不同操作 次数后的残余活力，并以第一次使用时的活力作为100%。如图示，在第二次使 用时，体系残余酶活力比第一次下降了约10%，之后数次使用损失都不是很大， 经过6次使用，酶活力仍然保持在77%，直到第八次使用时，其残余活力下降 到不足40%。
实施例2:配制含明胶与海藻酸钠质量浓度分别为20%和4%的混合胶液 20g， pH7，在3(TC水浴中完全溶解，按照活力比1:2将乳糖酶和葡萄糖异构酶 溶于2mL去离子水，将酶液加到混合胶液中，使乳糖酶和葡萄糖异构酶的添加 量分别为9U/g和18U/g (混合胶液)，搅拌混匀，再加入体积分数0.25%的戊二 醛2mL，注入培养皿，冷凝后用4MCaCl2浸泡过夜。次日用去离子水洗涤，清 澈后用体积分数0.25。/。的戊二醛15"C交联30min，再用去离子水清洗多次，滤纸 吸干表面水，切成2mm见方的小方块。
实施例3:配制pH7.5 20。/。的卡拉胶溶液20mL，在30'C水浴中使卡拉胶完 全溶解，按照活力比l:5将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于2mL去离子水，将酶液 加到卡拉胶溶液中，使乳糖酶和葡萄糖异构酶的添加量分别为6U/g和30U/g(卡 拉胶溶液)，搅拌混匀，再加入体积分数为P/。的戊二醛2mL，搅拌后立即倒入 培养皿，固化后将其浸入0.2mol/LKCl中4'C硬化过夜。次日用体积分数1%的 戊二醛3(TC交联40min，然后用去离子水清洗多次，滤纸吸干表面水，切成2mm 见方的小方块。
实施例4:将60目的尼龙网先用lmol/LNaOH浸洗10min，水洗至中性， 再用lmol/LHCl浸洗10min,水洗至中性，接着用乙醇洗去水分，丙酮洗20min 除去脂溶性杂质，乙醇除去丙酮，晾干。然后将尼龙网用含18.6。/。CaCl2和18.6% 水的甲醇溶液在5(TC水浴处理20min，彻底水洗，乙醇脱水，再晾干。再将尼 龙网浸入3-二甲氨基丙胺中7(TC浸泡活化12h，彻底水洗。用体积分数3%的戊 二醛，6"C下浸泡尼龙网lh，然后滤出尼龙网用pH7的磷酸盐缓冲液反复清洗。 配制浓度为20U/mL的乳糖酶溶液，按照100mL酶液用20g尼龙网的量将尼龙 网添加到乳糖酶液中，4'C下浸泡10h，并不断搅拌。滤出尼龙网，水洗至水中 无蛋白。之后再将尼龙网浸泡到20U/ mL的葡萄糖异构酶溶液中，尼龙网的添 加量为100mL酶液用20g尼龙网，4'C浸泡10h，并不停缓慢搅拌。最后用去离 子水多次清洗尼龙网表面至水中无蛋白，用冷风吹干即可。
权利要求
1、一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，其特征是以明胶、海藻酸钠和/或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；或以尼龙网为载体采用先交联后共价结合的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；(A)包埋-交联法以明胶、海藻酸钠和/或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶a)配制pH4-10的质量浓度5％-27％的20g胶溶液，在30℃水浴中使胶完全溶解；b)按照活力比2∶1-1∶5将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于2mL去离子水中；c)将b)配制的乳糖酶和葡萄糖异构酶的混合酶液添加到胶溶液中，使两种酶的添加量为1-30U/g胶溶液，搅拌混匀；d)在c)所得的胶溶液中加入2mL体积分数0.05％-5％的戊二醛，搅拌后立即倒入培养皿中，4℃硬化过夜，得凝胶；e)次日将凝胶浸入到体积分数0.05％-5％的戊二醛中，在4℃-30℃交联10min-60min，然后用去离子水清洗凝胶若干次，滤纸吸干表面水，最后切成2mm见方的小方块，即为共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；或(B)交联-共价法采用尼龙网为载体共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶a)尼龙网的预处理将60目的尼龙网裁成边长2cm的小片，先用1mol/LNaOH浸洗10min，水洗至中性，再用1mol/L HCl浸洗10min，再水洗至中性，然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性杂质，再用乙醇除去丙酮，晾干，接着将尼龙网浸泡在含18.6％CaCl2和18.6％水的甲醇溶液中，50℃保温20min，将尼龙网滤出并彻底水洗，乙醇脱水，晾干；b)尼龙网的活化将预处理后的尼龙网浸入到3-二甲氨基丙胺中70℃活化5-15h，彻底水洗；c)载体的交联将活化后的尼龙网浸入体积分数0.05％-5％、pH4-10的戊二醛中，4℃-30℃浸泡10min-60min，接着用pH 7的磷酸盐缓冲液反复清洗尼龙网；d)酶与载体的结合配制浓度为1-30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL酶液-30g/100mL酶液的量将尼龙网添加到乳糖酶液中，4℃-30℃下不断搅拌浸泡5-20h，滤出尼龙网，水洗至水洗液中无蛋白之后再将尼龙网浸泡到1-30U/mL的葡萄糖异构酶溶液中，尼龙网的添加量为100mL酶液用5-30g尼龙网，4℃-30℃不停缓慢搅拌浸泡5-20h，最后用去离子水多次清洗尼龙网表面至水洗液中无蛋白，用冷风吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。
2、 根据权利要求1所述的一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，其 特征是所用的游离乳糖酶的比活力为3000U/g，游离葡萄糖异构酶的比活力为 2000U/g。
3、 用权利要求l所述方法构建的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的应用， 其特征是将共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶用于以乳糖为底物制备乳果糖。
全文摘要
一种乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，属于食品生物技术领域。本发明是以明胶、海藻酸钠和/或卡拉胶为载体，采用先包埋后交联；或以尼龙网为载体，采用先交联后共价结合的方法共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。本发明的独特之处是将乳糖酶和葡萄糖异构酶进行共固定化，不仅能够实现酶的回收利用，节约经济成本，简化下游分离步骤，而且在反应过程中能够发挥两种酶之间的协同作用，提高反应效率。本发明思路新颖，流程简单，实用性强，所得到的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶可以用来转化乳糖制备乳果糖，具有较好的应用前景。
文档编号C12N11/04GK101182508SQ200710134998
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者芳 刘, 杨瑞金 申请人:江南大学